[Pharmacokinetic study of anti-human T-cell porcine immunoglobulin combined with cyclosporine A immunosuppressive therapy in patients with severe aplastic anemia].

Objective: To study the metabolic characteristics of anti-human T-cell porcine immunoglobulin (p-ATG) in patients with severe aplastic anemia (SAA) .
Methods: For patients with SAA treated with p-ATG combined cyclosporine A (CsA) immunosuppressants between February 2017 and December 2017, the p-ATG dose was 20 mg·kg(-1)·d(-1) over 12 h of intravenous administration for 5 consecutive days. The blood concentration of p-ATG was detected by the three-antibody sandwich ELISA method, the pharmacokinetic analysis software was fitted, and the second-chamber model method was used to calculate the pharmacokinetic parameters and plot the pharmacokinetic curve. Adverse events were recorded and the hematologic reactions were determined at 6 months after treatment.
Results: Sixteen patients with SAA treated with p-ATG were enrolled, including 8 females and 8 males, with a median age of 22 years (range, 12 to 49 years) and a median weight of 62.5 kg (range, 37.5 to 82.0 kg) . The pharmacokinetics of p-ATG could be evaluated in 14 cases. p-ATG is distributed in vivo as a two-chamber model, with an average drug concentration peak (T(max)) of (5.786±2.486) days, a peak concentration (C(max)) of (616±452) mg/L, and a half-life of (10.479±8.242) days. The area under the drug time curve (AUC) was (5.807±3.236) mg/L·d. Six months after treatment, 8 of 14 patients received a hematologic response; the AUC (0-t) of the effective group and ineffective groups was (7.50±3.26) mg/L·d vs (4.50±2.18) mg/L·d, and the C(max) was (627±476) mg/L vs (584±382) mg/L, respectively.
Conclusion: The plasma concentration of p-ATG reached a peak after 5 days of continuous infusion, and then decreased slowly, with a half-life of 10.479 days, and the residual drug concentration was detected in the body 60 days after administration. A relationship between drug metabolism and efficacy and adverse reactions could not be determined.

抗胸腺/淋巴细胞球蛋白（ATG/ALG）联合环孢素A（CsA）的免疫抑制治疗（IST）是不适合或者无法耐受造血干细胞移植（HSCT）的重型再生障碍性贫血（SAA）患者的首选治疗。抗人T细胞猪免疫球蛋白（p-ATG）是我国目前唯一自主生产的此类产品，临床应用该药物治疗SAA患者获得较好疗效，但目前国内外尚未见有关p-ATG治疗SAA的药代动力学报道。近期我们以接受p-ATG联合CsA治疗的SAA患者为研究对象，监测p-ATG的药物浓度变化，了解其药代动力学特性。

病例与方法

1. 方案设计：接受IST的SAA患者为中国医学科学院血液病医院住院患者，药物浓度检测单位为中国医药集团武汉生物制品研究所。依据赫尔辛基宣言原则及GCP规范，研究获得我院伦理委员会批准（批件号：ΠT2014015-EC-2），试验前患者本人或其监护人均签署知情同意书。

2. 受试对象：纳入标准：2017年2月至2017年12月中国医学科学院血液病医院贫血诊疗中心住院，参照诊断标准[1]临床诊断为获得性SAA，按照《再生障碍性贫血诊断与治疗中国专家共识（2017年版）》[2]原则，因年龄或供者受限无法接受HSCT，拟接受IST的患者；ECOG评分≤2分；接受各项生化、心电图、超声、骨髓等诊断及筛查评估；患者本人或监护人签署知情同意书。排除标准：先天造血衰竭；患者合并无法控制的严重感染；合并肝肾心等重要脏器功能损伤；合并恶性肿瘤；妊娠或者哺乳期女性。随访至2018年12月，中位随访17（12～22）个月。

3. p-ATG给药方法与样品采集：p-ATG为中国武汉生物制品研究所产品，规格为每支250 mg。给药方案：20 mg·kg−1·d−1×5 d，皮试阴性后每天连续匀速静脉泵滴，持续12 h输注完毕。另一静脉通路按照1 mg/kg剂量泼尼松，换算为静脉短效氢化可的松（大约总量1/3），剩余剂量换算为静脉地塞米松输注，以预防即刻输注反应。开始p-ATG输注前采集静脉血为0 h，用药过程中观察记录患者的生命体征及药物的不良反应，如发生严重不良事件，立即暂停p-ATG输注，并采取急救措施。整个用药过程患者应用心电监护，并在医护人员的密切监护下层流病房内进行。

接受p-ATG治疗开始至停药后60 d连续不同时间点于用药过程中及用药后采集血样标本，时间点分别为第1天0、4、8、16 h，第2、3、4、5天（用药期间）静脉p-ATG输注前，第6、7、10、15、20、25、35、45、55、65天（停药后）晨起空腹采集静脉血标本。室温下静置30 min，24 °C离心10 min，分离血清，置−70 °C冰箱冷冻保存待测。

4. 血药浓度检测：采用三抗体夹心酶联免疫吸附（ELISA）方法，参照武汉生物制品研究所p-ATG检测试剂盒说明书进行血药浓度检测。应用兔抗猪IgG（美国Santa Cruz公司）包板，胎牛血清封闭；加入样品或对照100 µl，37 °C温浴后洗板5次；然后加入HRP标记鼠抗猪IgG（美国Santa Cruz公司）100 µl，37 °C温浴后洗板5次；再加入显色液反应15 min后，加入终止液终止反应；读取450 nm处吸光度（A）值，选择4参数方程式对阳性对照进行回归，计算获得待测样品浓度。实验重复2次取平均值。

5. 药代动力学模型的建立：采用DAS 3.1.4药代动力学分析软件进行拟合，确定权重和房室模型，计算药物代谢动力学参数，包括半衰期（T1/2），血药浓度-时间曲线下面积（AUC）、分布容积（V）和清除率（CL）等。AUC用梯形法计算，峰浓度（Cmax）、药物浓度达峰时间（Tmax）用实测值，并利用相关参数绘制药代曲线。

6. 疗效标准：参照中华医学会血液学分会制定的AA疗效标准[2]，根据外周血常规恢复程度、是否依赖血制品输注等指标，将疗效分为完全缓解（CR）、部分缓解（PR）、未缓解（NR），CR、PR共同计入血液学反应率。

7. 不良反应及各项临床指标观测：所有患者在IST期间均密切观察其临床症状体征，包括输注p-ATG期间的即刻不良事件及输注后3周内的血清病反应事件。并且在治疗期间监测淋巴细胞绝对值，观察其与药物浓度的相关性。治疗后监测血液骨髓相关指标，于治疗后6个月进行疗效评价，观察药代动力学指标与疗效的关系。

结果

1. 入组患者一般情况：共纳入16例SAA患者，其中女8例，男8例，中位年龄22（12～49）岁，中位身高为162（130～170）cm，中位体重为62.5（37.5～82.0）kg，中位身体质量指数（BMI）为23.5（18.8～33.5）。其中SAA 13例，极重型再生障碍性贫血（VSAA）3例，中位外周血淋巴细胞绝对计数（ALC）为1.84（0.52～3.07）×109 /L（表1）。其中2例患者因其他原因未能按方案完成p-ATG治疗，延长了用药时间，虽其药物浓度及代谢参数也进行了相应检验和安全性数据收集，在数据统计分析过程中仅保留安全性数据，其药代数据未予采用。

表1

16例入组抗人T细胞猪免疫球蛋白药代动力学检测SAA患者一般情况

例号	性别	年龄（岁）	诊断	体重（kg）	身高（cm）	BMI	治疗前血常规
							ALC（×109/L）	WBC（×109/L）	HGB（g/L）	ANC（×109/L）	PLT（×109/L）	RET（％）
1	女	13	VSAA	46.0	154	19.4	3.07	3.2	66	0.13	14	6
2	男	21	SAA	61.0	170	21.1	1.90	2.6	47	0.70	15	12
3	女	12	SAA	44.0	153	18.8	1.93	2.4	69	0.47	11	12
4	男	38	SAA	80.0	170	27.7	1.96	2.2	70	0.24	11	6
5	女	13	SAA	74.0	162	28.2	1.69	2.5	50	0.41	2	72
6	女	48	SAA	82.5	157	33.5	1.26	2.0	57	0.74	9	15
7	男	31	SAA	62.5	166	22.7	2.09	2.5	66	0.41	10	23
8	男	22	SAA	72.5	170	25.1	0.52	0.97	70	0.45	9	20
9	男	12	VSAA	54.0	168	19.1	2.27	2.4	60	0.13	14	4
10	男	20	SAA	53.0	158	21.2	1.60	2.9	64	0.30	8	42
11	女	15	SAA	62.0	160	24.2	2.25	2.5	52	0.25	14	4
12	女	41	SAA	77.0	163	29.0	1.04	1.5	45	0.46	9	22
13	男	8	SAA	37.5	130	22.2	2.15	2.4	70	0.25	10	16
14	女	41	SAA	67.0	162	25.5	1.19	1.9	38	0.71	4	20
15	女	25	VSAA	56.0	166	20.3	0.72	0.8	58	0.03	18	2
16	男	11	SAA	65.0	156	26.7	1.77	2.0	78	0.23	13	11

注：SAA：重型再生障碍性贫血；VSAA：极重型再生障碍性贫血；ALC：淋巴细胞绝对计数；RET：网织红细胞比值

2. 基础结构模型的建立和药代模型参数：药物浓度时间曲线见图1。p-ATG输注第1天血药浓度均快速升高，在开始输注后的16 h最大血药浓度为（22.7±20.0）mg/L；p-ATG输注期间患者血药浓度仍逐渐升高，无明显平台期，并于输注结束后第1天达峰值血药浓度；结束末次药物输注后，p-ATG血药浓度开始下降，药物清除早期较快，后期缓慢，可体内存在长达60 d。

图1

14例重型再生障碍性贫血患者p-ATG血药浓度与淋巴细胞绝对计数动态曲线

p-ATG：抗人T细胞猪免疫球蛋白

根据p-ATG在体内代谢浓度数值参数，采用DAS 3.1.4软件计算拟合，确定p-ATG药代动力学的二室模型（中央室及外周室），权重系数1/c/c。14例患者平均Tmax为（5.786±2.486）d，平均Cmax为（616±452）mg/L，平均T1/2为（10.479±8.242）d，平均驻留时间［MRT（0-∞）］为（14.43±14.02）d，分布常数（0.581±0.432）1/d，分布速率（0.352±0.282）1/d，分布相半衰期（T1/2α）为（4.873±3.067）d，消除常数（6.100±5.439）1/d，消除速率（0.066±0.560）1/d，平均消除相半衰期（T1/2β）（12.353±16.183）d，平均药物浓度时间曲线下面积［AUC（0-t）］为（5.807±3.236）mg/L·d。

3. ALC、有效性与药物浓度相关性：14例患者中位基线ALC为1.84（0.52～3.07）×109 /L，应用p-ATG过程中，ALC迅速下降，药物浓度达峰时患者中位ALC为0.31（0.10～0.90）×109/L，最低值仅为基线值的16.8%。随着ATG用药结束，药物浓度逐渐降低，ALC也逐渐复升，于用药14 d达峰值，中位水平为2.43（1.54～3.43）×109/L。此后，淋巴细胞再逐渐下降至接近基线水平，第35天中位ALC为1.71（0.72～2.27）×109/L（图1）。治疗后6个月，14例患者中8例有效，有效组与无效组患者AUC（0-t）分别为（7.50±3.26）mg/L·d、（4.50±2.18）mg/L·d，Cmax分别为（627±476）mg/L、（584±382）mg/L，有效组均高于无效组，但样本量过低，未进行假设检验。

4. p-ATG的耐受性：即刻输注不良反应主要为发热1例，皮疹1例，窦性心动过缓1例，加快糖皮质激素给药速度后患者症状缓解，未出现严重不良反应。药物治疗后7～14 d，2例患者出现血清病反应，1例为皮疹、发热，1例为水钠潴留，加大激素药物剂量均控制。

讨论

ATG/ALG是提取人类胸腺细胞（包括T淋巴细胞及少许B淋巴细胞）及淋巴细胞（或淋巴细胞系）免疫动物（如兔、马、猪等），产生针对人T淋巴细胞的抗体，提纯后制备的含有IgG、IgM等多克隆免疫球蛋白，是一种针对人T细胞的强免疫抑制剂。目前有关AA的发病机制国际共识认为，T淋巴细胞的功能异常是导致骨髓造血衰竭的主要机制[3]，ATG/ALG是不能选择移植治疗的SAA患者的首选治疗方案，为避免患者过度免疫抑制而发生严重感染和复发，以及ATG/ALG药物血浓度过低而疗效欠佳，因此探索SAA患者个体化的最佳ATG/ALG剂量尤为重要。

p-ATG在中国AA患者体内药代动力学特点尚未明确，而应用p-ATG治疗AA的疗效及不良反应是否与其药代动力学相关，本研究希望为临床提供数据依据。采用三抗体夹心ELISA试验法，样本处理相对简单，成本费用较低，数据可靠等优点，具有广泛开展的可能性。本研究应用p-ATG总量为100 mg/kg，分5 d应用，每日输注时间不低于12 h，Cmax为（616±452）mg/L，达到峰值为应用药物第6天，其后早期开始快速下降，第10天后开始缓慢下降，T1/2为10.479 d，用药后60 d仍可检测到药物残留。

研究表明p-ATG为慢代谢药物，在总剂量相同的条件下，分多日应用，避免生物制剂的单次大剂量引起的短时药物浓度过高，从而引发高热、关节痛、过敏甚至休克等药物不良反应，且分日应用可维持更好的疗效，针对本病的异常T淋巴细胞抑制更充分持久。本研究14例患者平均AUC（0–∞）为（5.807±3.236）mg/L·d，患者随访至治疗后6个月时判断疗效，14例患者中8例有效，有效组AUC（0–t）及Cmax高于无效组，但样本量过低，未进行假设检验。本研究纳入患者样本量较小，视为Ⅰ期药代动力学研究，此结果没有足够效力评价疗效影响因素，加之AA疗效影响因素众多，故无法判定药代参数与疗效相关性。未来需增加样本量进一步研究。

由于ATG的消除半衰期很长，因此临床每日应用等量ATG剂量，体内p-ATG的浓度随应用时间逐步达稳态，这是很多药物产生临床治疗作用的先决条件[5]，同时也可能是药物产生不良反应的重要原因。本研究中所有患者未出现严重不良事件，因此根据p-ATG安全耐受的结果及药代动力学特点，我们认为在SAA治疗中，按100 mg/kg分5 d静脉输注是安全的。

本研究p-ATG Tmax相较国内外报道马/猪ATG（h/p-ATG）相似[3]–[4],[6]，其T1/2β 为12.353 d，短于r-ATG的21.56～29.67 d[4],[6]，与既往p-ATG在HSCT患者中的10.99 d相似[7]。用药后60 d体内检测到残存药物浓度，短于r-ATG体内残留最长90 d的清除时间[4],[6]，代谢清除相对较快。我们发现随着p-ATG体内的清除，患者淋巴细胞也很快恢复至较高水平，随着血药浓度的平稳，淋巴细胞也恢复至基线水平，这与文献报道r-ATG的IST后淋巴细胞较长时间抑制不同[8]，提示p-ATG免疫抑制强度可能略低，而与马-ATG（h-ATG）免疫抑制特征相近。

我们对SAA患者p-ATG药代特征研究表明，p-ATG是慢代谢的生物制剂，治疗过程随着药物的蓄积其浓度可快速达峰值，无明显平台期；治疗后药物清除早期较快，后期缓慢，可在体内长期残留。本研究尚不能得出药物代谢与疗效及不良反应的关系，尚需进一步研究探索。