Evaluation of Endothelial Dysfunction in COVID-19 With Flow-Mediated Dilatation.

BACKGROUND: Inflammation is known to play a crucial role in many diseases, including COVID-19.
OBJECTIVE: Using flow-mediated dilatation (FMD), we aimed to assess the effects of inflammation on endothelial function in COVID-19 patients.
METHODS: This study was conducted with a total of 161 subjects, of whom 80 were diagnosed with COVID-19 within the last six months (comprising 48 women and 32 men with a mean age of 32.10 ± 5.87 years) and 81 were healthy controls (comprising 45 women and 36 men with a mean age of 30.51 ± 7.33 years). We analyzed the findings of transthoracic echocardiography and FMD in all subjects. All results were considered statistically significant at the level of p < 0.05.
RESULTS: The echocardiography and FMD of the COVID-19 group were performed 35 days (range: 25-178) after diagnosis. There was no statistically significant difference in echocardiographic parameters. Differently, FMD (%) was significantly higher in the control group (9.52 ± 5.98 vs. 12.01 ± 6.18, p=0.01). In multivariate analysis with the forward stepwise model, FMD was significantly different in the control group compared to the COVID-19 group (1.086 (1.026 - 1.149), p=0.04). A Spearman's correlation test indicated that FMD (r=0.27, p=0.006) had a weak positive correlation with the presence of COVID-19.
CONCLUSION: Our findings point to COVID-19-induced endothelial dysfunction, as assessed by FMD, in the early recovery phase.

Introdução

Um novo tipo de doença causada por coronavírus surgiu em dezembro de 2019, sendo chamada de COVID-19 pela Organização Mundial da Saúde (OMS). Ela infecta principalmente o trato respiratório e se espalhou rapidamente pelo mundo.[1]

Como vírus de RNA capazes de sofrer mutações e se recombinar rapidamente, os coronavírus são conhecidos por infectar sobretudo o trato respiratório ou o trato intestinal em humanos e animais.[2] Os coronavírus entram na célula hospedeira ligando-se à enzima conversora de angiotensina 2 da peptidase de zinco, uma molécula de superfície encontrada nas células endoteliais de artérias e vasos, no epitélio do trato respiratório, no músculo liso arterial, no epitélio do intestino delgado e em células imunes.[3-5]

A ativação e a disfunção endotelial se desenvolvem como resultado da infeção das células endoteliais pela COVID-19.[6] Isso aumenta os níveis de citocinas pró-inflamatórias (fator de necrose tumoral alfa, interleucina-1 e interleucina-6/IL-6), quimiocinas (proteína quimiotática de monócitos-1), antígeno do fator de von Willebrand (FvW), e atividade FvW, fator anti-hemofílico (FAH) e reagentes de fase aguda (IL-6, proteína C reativa e dímero D).[6]

Embora a COVID-19 afete principalmente os tratos respiratórios superior e inferior, o endotélio vascular é outro alvo conhecido. A disfunção endotelial pode ser causada diretamente pela atividade do vírus ou pela resposta inflamatória sistêmica resultante. A dilatação fluxo-mediada (DFM) — método ultrassonográfico não invasivo — tem sido bastante utilizada para avaliar a disfunção endotelial devido à sua simplicidade e economia.[7] Vários estudos têm abordado o efeito da DFM em doenças inflamatórias, como artrite reumatoide, doença vascular periférica, doença arterial coronariana, diabetes mellitus (DM) e hipertensão. Até o momento e até onde sabemos, há apenas alguns relatos sobre o uso da DFM para avaliar a COVID-19.[8,9]

Neste estudo, a DFM foi utilizada para investigar possíveis efeitos anormais na função vascular de pacientes recuperados de uma infecção de COVID-19.

Métodos

Este estudo de centro único foi realizado no Abant Izzet Baysal University Training and Research Hospital entre outubro de 2020 e fevereiro de 2021. A pesquisa contou com a participação de 80 indivíduos diagnosticados com COVID-19 nos últimos seis meses que não necessitaram de hospitalização e 81 indivíduos controle saudáveis, com distribuição etária de >18 e <45 anos. Todos os pacientes do grupo COVID-19 estavam curados e sem sintomas no momento da entrada no estudo.

Os critérios de exclusão foram: idade >45 anos, qualquer presença de doença arterial coronariana, disfunção sistólica do ventrículo esquerdo (fração de ejeção/FE<50%), valvopatia moderada a grave, cardiopatia congênita, distúrbio de condução atrioventricular, doença renal ou hepática moderada a grave, doença tireoidiana, desequilíbrio eletrolítico, doença inflamatória sistêmica ou janela acústica ecocardiográfica inadequada. O protocolo do estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética local e um termo de consentimento livre e esclarecido foi assinado por cada indivíduo antes da participação.

Com base no Plano de Diagnóstico e Tratamento de COVID-19 da Comissão Nacional de Saúde (7ᵃ edição), os casos de COVID-19 foram classificados em quatro tipos clínicos: leves (sintomas clínicos leves sem pneumonia em imagem radiológica), comuns (febre, comprometimento do trato respiratório e outros sintomas com pneumonia em imagem radiológica), graves (desconforto respiratório, frequência respiratória de ≥30 vezes/min, saturação de oxigênio ≤93% em repouso, PaO2/FiO2 ≤300 mmHg) e críticos (insuficiência respiratória com necessidade de ventilação mecânica, choque e insuficiência de outro órgão exigindo monitoramento e tratamento em uma unidade de terapia intensiva).[10]

O comprometimento pulmonar foi categorizado por meio do “escore total de gravidade” (ETG), baseado na avaliação da tomografia computadorizada (TC) de tórax. Para isso, as porcentagens de comprometimento calculadas para cada um dos cinco lobos foram convertidas em uma das seguintes categorias de pontuação: nenhum (0%) (escore 0), mínimo (1–25%) (escore 1), leve (26–50%) (escore 2), moderado (51–75%) (escore 3) e grave (76–100%) (escore 4). Por fim, a soma de todas as pontuações gerou um valor de ETG que variou de 0 a 20.[11]

Parâmetros laboratoriais foram obtidos a partir de prontuários hospitalares no diagnóstico da infeção de COVID-19. Os dados laboratoriais do grupo controle foram coletados na entrada do estudo.

Pacientes e controles foram avaliados por meio de ecocardiograma e ultrassonografia braquial com Doppler para obter a medida da DFM na entrada do estudo.

Avaliação ecocardiográfica

Um transdutor Vivid S6 de 4 MHz (GE Vingmed, N-3191 Horten-Noruega) foi utilizado para realizar os procedimentos ecocardiográficos necessários.

Todas as imagens ecocardiográficas foram obtidas por meio do monitoramento contínuo do eletrocardiograma (ECG) por um cardiologista com cegamento simples com os pacientes na posição lateral esquerda. Considerou-se a média de três ciclos cardíacos consecutivos e foram medidos os diâmetros diastólico final e sistólico final do ventrículo esquerdo, a espessura da parede posterior do ventrículo esquerdo, a espessura do septo ventricular esquerdo e os diâmetros do átrio esquerdo. O método de Simpson biplano modificado foi aplicado para medir a FE do ventrículo esquerdo. Medidas Doppler bidimensionais e pulsadas foram calculadas com base nos critérios da American Society of Echocardiography.[12]

Avaliação ultrassonográfica

Os parâmetros foram obtidos em uma sala silenciosa, escura e com ar-condicionado (ou seja, temperatura ambiente de 22–25°C) após um período de repouso de pelo menos 15 minutos. Além disso, foi solicitado aos participantes que evitassem se exercitar, fumar e consumir álcool ou cafeína por pelo menos 8 horas antes das medições de DFM. Um transdutor de arranjo linear de 7,5 MHz (GE Healthcare, M4S-RS, Tóquio, Hino-Shi, Japão) foi empregado para medir o diâmetro da artéria braquial na fossa antecubital. A pele foi marcada com um lápis; portanto, todas as medidas foram realizadas na mesma linha. Iniciou-se com o diâmetro basal e a taxa de fluxo da artéria braquial e, em seguida, a pressão foi aumentada até 50 mmHg acima da pressão arterial sistólica e mantida por 5 minutos nesse nível, de modo que o braço permanecesse isquêmico. Em seguida, a pressão do balonete foi reduzida, e o diâmetro e a taxa de fluxo da artéria braquial foram medidos novamente após 1 minuto da queda da pressão.

A DFM foi calculada usando a seguinte equação:

Análise estatística

Todas as análises estatísticas foram realizadas por meio do SPSS 18.0 Statistical Package Software para Windows (SPSS Inc., Chicago, IL, EUA). Os dados de normalidade das variáveis foram avaliados pelo teste de Kolmogorov-Smirnov. Variáveis contínuas com distribuição normal foram descritas por média e desvio padrão; variáveis contínuas sem distribuição normal foram descritas por mediana e intervalo interquartil (IIQ). Os dados foram expressos em números ou porcentagens para variáveis qualitativas. Para analisar as diferenças entre grupos independentes, utilizou-se o teste t de Student (bicaudal) para variáveis quantitativas com distribuição normal, o teste U de Mann-Whitney para variáveis sem distribuição normal e o teste qui-quadrado para variáveis qualitativas. Análises de correlação de Spearman foram realizadas para avaliar correlações entre a COVID-19 e o nível de linfócitos, a relação neutrófilos/linfócitos, os níveis de glicose e creatinina e a DFM. Para as variáveis consideradas significativas na análise de regressão univariada, empregou-se a regressão logística multivariada com o modelo stepwise progressivo para estabelecer os fatores prognósticos independentes da COVID-19. O teste de correlação de Spearman também foi realizado entre a DFM e o tempo decorrido desde o diagnóstico. Resultados com p<0,05 foram considerados estatisticamente significantes.

Resultados

Características clínicas de referência foram semelhantes entre os dois grupos. Entre os parâmetros laboratoriais, glicose, creatinina e a relação neutrófilos/linfócitos foram significativamente maiores, enquanto as contagens de linfócitos foram significativamente menores no grupo COVID-19 quando comparadas ao grupo controle (Tabela 1).

Tabela 1

Variáveis demográficas e laboratoriais da população do estudo

Variáveis			COVID-19 (n= 80)	Grupo controle (n=81)	p
Dados demográficos
Idade (anos)			32,10±5,87	30,51±7,33	0,407
Homens/Mulheres (n (%))			32/48 (40/60%)	36/45 (44/56%)	0,313
PAS (mmHg) (IIQ)			105 (14)	110 (22)	0,307
PAD (mmHg) (IIQ)			70 (15)	70 (20)	0,343
Altura (cm)			169,36±8,72	169,36±9,30	0,997
Peso (kg)			73,81±13,73	71,30±16,09	0,289
IMC (kg/m2)			25,63±3,74	25,00±4,13	0,198
Hipertensão n (%)		Não	78 (97,5%)	79 (97,5%)	1,000
		Sim	2 (2,5%)	2 (2,5%)
Diabetes mellitus n (%)		Não	78 (97,5%)	81 (100,0%)	0,245
		Sim	2 (2,5%)	0 (0,0%)
Dislipidemia n (%)		Não	79 (98,8%)	80 (98,8%)	1,000
		Sim	1 (1,3%)	1 (1,2%)
Histórico familiar de DAC n (%)		Não	54 (67,5%)	59 (72,8%)	0,459
		Sim	26 (32,5%)	22 (27,2%)
Fumante n (%)		Não	61 (76,3%)	58 (48,7%)	0,502
		Sim	19 (23,8%)	23 (28,4%)
Parâmetros laboratoriais
	Glicose plasmática em jejum (mg/dL) (IIQ)		93,50 (16,75)	91 (14)	0,038
	Creatinina (mg/dL) (IIQ)		0,78 (0,19)	0,74 (0,11)	0,042
	Hemoglobina (g/dL) (IIQ)		14,20 (2,05)	14,40 (1,95)	0,875
	Hematócrito (%) (IIQ)		42,30 (5,51)	42,90 (5,40)	0,851
	Contagem de plaquetas (K/uL) (IIQ)		250 (90,25)	263 (76,50)	0,659
	Contagem de linfócitos (K/uL) (IIQ)		1,83 (1,14)	2,24 (0,89)	0,017
	Contagem de neutrófilos (K/uL) (IIQ)		4,15 (2,12)	3,82 (1,73)	0,291
	Relação neutrófilos/linfócitos (IIQ)		2,05 (1,63)	1,30 (1,06)	0,044

*IIQ: intervalo interquartil; PAS: pressão arterial sistólica; PAD: pressão arterial diastólica; IMC: índice de massa corporal; DAC: doença arterial coronariana.

Mialgia (65%) e perda de olfato e/ou paladar (61%) foram os sintomas mais comuns em pacientes com COVID-19, enquanto sudorese (8%) foi o menos comum (Tabela 2). Nenhum dos pacientes do grupo COVID-19 apresentou infeção grave que exigisse hospitalização. Neste estudo, os pacientes tinham o tipo leve ou o comum de acordo com a classificação clínica, com ETG variando de 0 a 5.

Tabela 2

Sintomas dos pacientes que tiveram COVID-19

Sintomas	Número	%
Mialgia	52/80	65
Perda de olfato e/ou paladar	49/80	61
Fraqueza	33/80	41
Dor de cabeça	32/80	40
Tosse	28/80	35
Febre	25/80	31
Dispneia	19/80	24
Dor de garganta	15/80	19
Náusea	15/80	19
Diarreia	13/80	16
Sudorese	7/80	8

O ecocardiograma e a DFM do grupo COVID-19 foram realizados 35 dias (25–178; IIQ: 38,5) após o diagnóstico. As medidas ecocardiográficas foram semelhantes entre os dois grupos. No entanto, em relação ao grupo controle, a DFM (%) foi significativamente menor nos pacientes com COVID-19 (9,52±5,98 versus 12,01±6,18, p=0,010) (Tabela 3). O teste de correlação de Spearman mostrou não haver associação estatisticamente significante entre a DFM e o tempo decorrido desde o diagnóstico de COVID-19 (r=0,064; p=0,527).

Tabela 3

Medidas ecocardiográficas da população do estudo

Variáveis	COVID-19 (n= 80)	Grupo controle (n= 81)	p
Diâmetro do átrio esquerdo (cm)	3,03±0,5	2,92±0,32	0,332
DDFVE (cm)	4,48±0,45	4,45±0,42	0,281
DSFVE (cm)	2,80±0,30	2,81±0,29	0,711
PP (cm)	0,96±0,14	0,96±0,13	0,550
SIV (cm)	0,92±0,16	0,90±0,14	0,742
FE (%)	67,27±5,02	65,90±4,64	0,151
Onda E transmitral (cm/s) (IIQ)	96,9 (23,3)	94,7 (22,5)	0,409
Onda A transmitral (cm/s) (IIQ)	68,0 (16,1)	69,0 (15,3)	0,533
TD mitral (ms) (IIQ)	198 (45)	188 (57)	0,531
E' lateral (cm/s) (IIQ)	12,2 (3)	12,5 (3,5)	0,414
A' lateral (cm/s) (IIQ)	9,35 (2,5)	9,0 (3)	0,515
S' lateral (cm/s) (IIQ)	9,5 (2)	10,0 (2,1)	0,066
TAPSE (cm) (IIQ)	2,19 (0,44)	2,16 (0,40)	0,537
PSAP (mmHg)	23,79±5,13	25,14±5,63	0,268
DFM (%)	9,52±5,98	12,01±6,18	0,010

*DDFVE: diâmetro diastólico final do ventrículo esquerdo; DSFVE: diâmetro sistólico final do ventrículo esquerdo; PP: parede posterior; SIV: septo interventricular; FE: fração de ejeção; IIQ: intervalo interquartil; TD: tempo de desaceleração; E': pico de velocidade diastólica inicial do tecido miocárdico; A': pico de velocidade diastólica final do tecido miocárdico; S': velocidade miocárdica sistólica do anel mitral; DFM: dilatação fluxo-mediada; TAPSE: excursão sistólica do plano do anel tricúspide; PSAB: pressão sistólica da artéria pulmonar.

Parâmetros significativamente diferentes na análise de regressão univariada (glicose, creatinina, linfócitos, relação neutrófilos/linfócitos e DFM) foram incluídos na análise de regressão multivariada e apenas o valor da DFM foi significativamente diferente no grupo controle em relação ao grupo COVID-19 (1,086 (1,026–1,149), p=0,04) (Tabela 4).

Tabela 4

Preditores independentes de COVID-19 na análise de regressão logística multivariada

	OR (IC95%)	p
Glicose	0,981 (0,957–1,005)	0,116
Linfócitos	1,022 (0,646–1,616)	0,926
Relação neutrófilos/linfócitos	0,895 (0,744–1,077)	0,240
Creatinina	0,093 (0,005–1,595)	0,101
DFM	1,086 (1,026–1,149)	0,004

DFM: dilatação fluxo-mediada; IC: intervalo de confiança; OR (odds ratio): razão de chances.

O teste de correlação de Spearman indicou que a DFM (r=0,27, p=0,006) apresentou correlação positiva fraca com a presença de COVID-19.

Discussão

O objetivo deste trabalho foi avaliar as repercussões vasculares da COVID-19, utilizando a DFM comprometida como marcador substituto da disfunção endotelial. Este estudo demonstrou que o valor da DFM foi menor em pacientes do grupo COVID-19 em comparação ao grupo controle. Os resultados apontam para um comprometimento vascular por COVID-19, avaliado pela DFM, mesmo em pacientes com quadros leves. Até onde sabemos, este é o primeiro estudo a determinar a disfunção endotelial vascular por DFM comprometida entre pacientes jovens que se recuperam de uma infeção leve de COVID-19.

Foi detectada uma redução significativa na DFM mesmo em pacientes pouco afetados logo após a recuperação. Isso levanta a questão sobre a possibilidade de a doença ter efeitos anormais de longo prazo na função vascular. Achados semelhantes foram reportados por Ergul et al.,[8] que avaliaram 63 pacientes que tiveram COVID-19 dois meses após a recuperação e identificaram a infeção por COVID-19 e o aumento do índice de massa corporal como preditores independentes de disfunção endotelial avaliados pela DFM.[8]

Da mesma forma, Riou et al.,[9] encontraram uma redução significativa na DFM de 16 pacientes com COVID-19 leve a moderada, enquanto a DFM tendia a ser menor em nove pacientes com COVID-19 grave a crítica três meses após o início da doença.[9] Ao contrário desses relatos, o presente estudo se concentrou em pacientes com COVID-19 leve, não hospitalizados, 35 dias (25–178) após o início da doença.

Sabe-se que a disfunção endotelial, associada ao estresse oxidativo, é o primeiro fator de muitas doenças.[14] Embora a inflamação faça parte da resposta natural de recuperação do corpo à cura e seja essencial para proteger o corpo contra infeções e substâncias ambientais perigosas, seria bastante otimista dizer que é completamente benéfica. Quando ela sai do controle, pode se tornar prejudicial e destrutiva para o corpo.[15] A inflamação sistemicamente fora de controle também está associada a desfechos adversos da COVID-19.[16]

Em um estudo em que a DFM foi usada para predizer eventos cardiovasculares futuros em pacientes submetidos à cirurgia de revascularização miocárdica, a menor taxa de evento foi encontrada em pacientes com DFM normal (>8%), enquanto a taxa de evento moderada e a maior taxa de evento foram detectadas em pacientes com DFM de 4 a 8% e <4%, respetivamente.[17] Em outra pesquisa, pacientes com DFM inferior a 6,2% obtiveram um índice tornozelo-braquial significativamente menor em relação aos com DFM superior a 6,2%.[18] Além disso, Maruhashi et al.,[19] demonstraram que a DFM apresentou correlação inversa com o Escore de Risco de Framingham, comumente usado como calculadora de risco e índice de risco cardiovascular cumulativo para avaliar a probabilidade de ataque cardíaco ou morte por cardiopatia dentro de 10 anos.[19]

Fatores independentes preditivos de mortalidade por COVID-19 incluem idade avançada, comorbidades como diabetes mellitus (DM), doença cardiovascular, câncer e doença pulmonar obstrutiva crônica na apresentação.[20] Entretanto, bebês e crianças não tiveram aumento significativo tanto em morbidade quanto em mortalidade durante a pandemia de COVID-19.[21]

Com o aumento da idade e das doenças relacionadas à idade, o estado inflamatório crônico torna-se dominante e a resposta anti-inflamatória do sistema imunológico torna-se irregular e incapaz de suprimir o episódio inflamatório de forma rápida e eficaz.[22] O presente estudo buscou excluir os efeitos de inflamações relacionadas à idade mais avançada, incluindo indivíduos com menos de 45 anos de idade.

Embora ainda dentro dos limites da normalidade, pacientes do grupo COVID-19 apresentaram níveis significativamente mais elevados de glicose e creatinina do que os do grupo controle.

Durante a fase aguda da infeção, os níveis de glicemia podem aumentar de forma anormal em pacientes sob estresse da COVID-19, mesmo que não tenham diagnóstico de DM. Também há relatos de impactos anormais na função renal. Altos níveis de glicemia em pacientes com COVID-19 podem ser preditivos de piores desfechos, independentemente do histórico de DM.[23] A doença renal está associada ao aumento de mortalidade por COVID-19.[24] Verificou-se que 14,4% de 701 pacientes hospitalizados com COVID-19 apresentaram aumento nos níveis séricos de creatinina, 13,1% tiveram redução na taxa de filtração glomerular e aproximadamente 5% apresentaram insuficiência renal aguda.[24] Resultados histopatológicos revelaram lesões tubulares agudas, diferentes comprometimentos glomerulares, necrose tubular e glomeruloesclerose.[25] Neste estudo, o achado de níveis levemente aumentados de glicemia e creatinina pode ser incidental, mas também pode sugerir lesão renal subclínica e/ou estresse contínuo.

A linfopenia tem sido usada no diagnóstico de COVID-19 e associada a um pior prognóstico.[26] A gravidade da COVID-19 também foi correlacionada com a relação neutrófilos/linfócitos e a relação linfócitos/proteína C reativa.[27] Assim, em comparação com o grupo controle, as contagens de linfócitos diminuíram e a relação neutrófilos/linfócitos aumentou nos participantes do estudo que tiveram COVID-19 leve.

Limitações

As principais limitações desta pesquisa são a sua realização em centro único e o número relativamente pequeno de pacientes. Os resultados são limitados a um momento inicial do processo da doença e não podem ser extrapolados para refletir achados de longo prazo. Outra limitação é o fato de os parâmetros laboratoriais não terem sido aferidos simultaneamente com a medição da DFM. Devido aos critérios de exclusão e ao limite de idade, a população do estudo foi estritamente selecionada; portanto, os achados podem não representar todos os pacientes com COVID-19.

Conclusão

Este estudo mostrou uma diminuição da DFM em pacientes jovens com quadro leve de COVID-19 na fase inicial de recuperação. Assim, esse parâmetro pode ser usado como marcador para disfunção endotelial induzida pela COVID-19. Sem dúvida, o monitoramento cardiovascular de rotina em pacientes com histórico de COVID-19 pode identificar indivíduos com risco de eventos cardiovasculares futuros. Para entender melhor os possíveis efeitos cardiovasculares nesses pacientes, deve-se considerar estudos de larga escala, incluindo seguimento a longo prazo.

Introduction

A new type of coronavirus disease emerged in December 2019 and was named COVID-19 by the WHO. It primarily infects the respiratory tract and has spread rapidly around the world.[1]

As RNA viruses that can rapidly mutate and recombine, coronaviruses are known to primarily infect the respiratory tract or intestinal tract in humans and animals.[2] Coronaviruses enter the host cell by binding to the zinc peptidase angiotensin-converting enzyme 2, a surface molecule found in the endothelial cells of arteries and vessels, the respiratory tract epithelium, the arterial smooth muscle, the small intestinal epithelium, and immune cells.[3-5]

Endothelial activation and dysfunction develop as a result of endothelial cells being infected with COVID-19.[6] They lead to increased levels of pro-inflammatory cytokines (tumor necrosis factor-alpha, interleukin-1, and interleukin-6), chemokines (monocyte chemoattractant protein-1), von Willebrand factor (vWF) antigen, vWF activity, anti-hemophilic factor (AHF), and acute-phase reactants (IL-6, C-reactive protein, and D-dimer).[6]

Although COVID-19 primarily affects the upper and lower respiratory tracts, the vascular endothelium is another known target. Endothelial dysfunction may be caused directly by the activity of the virus or by the resulting systemic inflammatory response. Flow-mediated dilatation (FMD), which is a non-invasive ultrasonographic method, has been widely used to evaluate endothelial dysfunction due to its simplicity and cost-efficiency.[7] Several studies have addressed the effect of FMD on various inflammatory diseases such as rheumatoid arthritis, peripheral vascular disease, coronary artery disease, diabetes mellitus, and hypertension. To date, as far as we know, there are only a few reports on FMD being used to evaluate COVID-19.[8,9]

In this study, we used FMD to investigate the potential abnormal effects of COVID-19 on the vascular function of patients recovered from a COVID-19 infection.

Methods

This single-centered study was carried out at Abant Izzet Baysal University Training and Research Hospital between October 2020 and February 2021. The study included 80 subjects diagnosed with COVID-19 within the last six months who did not require hospitalization and 81 healthy control subjects, with an age distribution of > 18 and < 45 years. All the COVID-19 patients were cured and free from symptoms at the time of study entry.

The exclusion criteria were as follows: age > 45 years, any presence of coronary artery disease, left ventricle systolic dysfunction (EF < 50%), moderate to severe valvular disease, congenital heart disease, atrioventricular conduction abnormality, moderate to severe kidney or liver disease, thyroid disease, electrolytic imbalance, systemic inflammatory disease, or poor acoustic echocardiography window. The study protocol was approved by the Local Ethics Committee and a written informed consent form was signed by each subject before participation.

Based on the COVID-19 Diagnosis and Treatment Plan by the National Health Commission (7th edition), COVID-19 cases were classified into four clinical types: mild (characterized by mild clinical symptoms without pneumonia on radiological imaging), common (characterized by fever, involvement of the respiratory tract, and other symptoms with pneumonia on radiological imaging), severe (characterized by respiratory distress, respiratory rate of ≥ 30 times/min, oxygen saturation ≤ 93% at rest, PaO2/FiO2 ≤ 300 mmHg), and critical (characterized by respiratory failure requiring mechanical ventilation, shock, and failure of another organ requiring monitoring and treatment at an intensive care unit).[10]

Lung involvement was classified using the “total severity score” (TSS) based on an assessment of chest computed tomography (CT) imaging. For this purpose, the percentages of involvement calculated for each of the five lobes were converted into one of the following score categories: none (0%) (Score 0), minimal (1-25%) (Score 1), mild (26-50%) (Score 2), moderate (51-75%) (Score 3), and severe (76-100%) (Score 4). Finally, the sum of all the scores yielded a TSS value ranging from 0 to 20.[11]

Laboratory parameters were obtained from hospital medical records at COVID-19 infection diagnosis. Laboratory data from the control group were obtained at study entry.

Patients and control subjects were evaluated with echocardiography and brachial Doppler ultrasonography for FMD measurement at study entry.

Echocardiographic evaluation

We used a Vivid S6 4-Mhz transducer (GE Vingmed, N-3191 Horten-Norway) to perform the required echocardiographic procedures.

All echocardiographic images were obtained using continuous ECG monitoring by a single-blind cardiologist with the subjects in the left lateral position. We considered the mean of three consecutive cardiac cycles and measured left ventricular end-diastolic and end-systolic diameters, left ventricular posterior wall thickness, left ventricular septum thickness, and left atrium diameters. A biplane modfied simpson’s method was applied for measuring left ventricular ejection fraction. We performed two-dimensional and pulsed Doppler measurements based on the American Society of Echocardiography criteria[12].

Ultrasonographic evaluation

The parameters were measured in a quiet, dark, and air-conditioned room (i.e. room temperature of 22 - 25°C) after a rest period of at least 15 minutes. In addition, subjects were asked to fast and to avoid exercising, smoking, and consuming alcohol or caffeine for at least 8 hours before FMD measurements. We used a 7.5 MHz linear array transducer (GE Healthcare, M4S-RS, Tokyo, Hino-Shi, Japan) to measure the brachial artery diameter at the antecubital fossa. The skin was marked with a pencil, and thus all measurements were performed on the same line. We started with the basal diameter and flow rate of the brachial artery and then increased the pressure up to 50 mmHg above systolic blood pressure, and waited for 5 minutes at this level, so the arm remained ischemic. Then cuff pressure was lowered, and the diameter and flow rate of the brachial artery were measured again at 1 minute after pressure decrease.

FMD was calculated using the following equation:

Statistical analysis

All statistical analyses were performed using SPSS 18.0 Statistical Package Software for Windows (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Normality data of the variables were evaluated with the Kolmogorov-Smirnov test. Continuous variables with normal distribution were described using the mean and standard deviation; continuous variables without normal distribution were described using the median and interquartile range. The data are shown as numbers or percentages for qualitative variables. To analyze differences between independent groups, we used the Student’s t-test (two-tailed) for normally distributed quantitative variables, the Mann-Whitney’s U-test for variables without normal distribution, and the Chi-square test for qualitative variables. Spearman’s correlation analyses were conducted to evaluate correlations between COVID-19 and lymphocyte level, neutrophil/lymphocyte ratio, glucose and creatinine levels, and FMD. For variables found to be significant in the univariate regression analysis, we employed multivariate logistic regression with the forward stepwise model to establish the independent prognostic factors of COVID-19. Spearman’s correlation test was also performed between FMD and time elapsed from diagnosis. All results were considered statistically significant at the level of p < 0.05.

Results

Baseline clinical characteristics were similar between both groups. Among laboratory parameters, glucose, creatinine, and neutrophil/lymphocyte ratio were significantly higher; lymphocyte counts were significantly lower in the COVID-19 group compared to the control group (Table 1).

Table 1

Demographic and laboratory variables of the study population

Variables			COVID-19 (n= 80)	Control Group (n=81)	p
Demographics
Age (years)			32.10±5.87	30.51±7.33	0.407
Male/Female (n(%))			32/48 (40/60%)	36/45 (44/56%)	0.313
SBP (mmHg) (IIQ)			105 (14)	110 (22)	0.307
DBP (mmHg) (IIQ)			70 (15)	70 (20)	0.343
Height (cm)			169.36±8.72	169.36±9.30	0.997
Weight (kg)			73.81±13.73	71.30±16.09	0.289
BMI (kg/m2)			25.63±3.74	25.00±4.13	0.198
Hypertension n (%)		No	78 (97.5%)	79 (97.5%)	1.000
		Yes	2 (2.5%)	2 (2.5%)
Diabetes mellitus n (%)		No	78 (97.5%)	81 (100.0%)	0.245
		Yes	2 (2.5%)	0 (0.0%)
Hyperlipidemia n (%)		No	79 (98.8%)	80 (98.8%)	1.000
		Yes	1 (1.3%)	1 (1.2%)
Family History of CAD n (%)		No	54 (67.5%)	59 (72.8%)	0.459
		Yes	26 (32.5%)	22 (27.2%)
Smoking n (%)		No	61 (76.3%)	58 (48.7%)	0.502
		Yes	19 (23.8%)	23 (28.4%)
Laboratory parameters
	Fasting Plasma Glucose (mg/dL) (IIQ)		93.50 (16.75)	91 (14)	0.038
	Creatinine (mg/dL) (IIQ)		0.78 (0.19)	0.74 (0.11)	0.042
	Hemoglobin (g/dL) (IIQ)		14.20 (2.05)	14.40 (1.95)	0.875
	Hematocrit (%) (IIQ)		42.30 (5.51)	42.90 (5.40)	0.851
	Platelet counts (K/uL) (IIQ)		250 (90.25)	263 (76.50)	0.659
	Lymphocyte counts (K/uL) (IIQ)		1.83 (1.14)	2.24 (0.89)	0.017
	Neutrophil counts (K/uL) (IIQ)		4.15 (2.12)	3.82 (1.73)	0.291
	Neutrophil/ lymphocyte ratio (IIQ)		2.05 (1.63)	1.30 (1.06)	0.044

*IIQ: Interquartile Range; SBP: systolic blood pressure; DBP: diastolic blood pressure; BMI: body mass index.

Myalgia (65 %) and loss of smell and/or taste (61 %) were the most common symptoms in COVID-19 patients, whereas sweating was (8 %) the least common one (Table 2). None of the COVID-19 patients had a serious infection that required hospitalization. In our study, the patients belonged either to the mild type or the common type, according to the clinical classification, with TSS scores ranging from 0 to 5.

Table 2

Symptoms experienced by the COVID-19 patients

Symptoms	Number	%
Myalgia	52/80	65
Loss of smell and/or taste	49/80	61
Weakness	33/80	41
Headache	32/80	40
Cough	28/80	35
Fever	25/80	31
Dyspnea	19/80	24
Sore throat	15/80	19
Nausea	15/80	19
Diarrhea	13/80	16
Sweating	7/80	8

Echocardiography and FMD of the COVID-19 group were performed 35 days (25-178; IIQ: 38.5) after diagnosis. Echocardiographic measurements were similar between the two groups, whereas compared to the control group FMD (%), it was significantly lower in the COVID-19 patients (9.52 ± 5.98 vs. 12.01 ± 6.18, p=0.010) (Table 3). Spearman’s correlation test showed that there was no statistically significant relation between FMD and the time elapsed after COVID-19 diagnosis (r=0.064; p=0.527).

Table 3

Echocardiographic measurements of the study population

Variables	COVID-19 (n= 80)	Control Group (n= 81)	p
Left atrium diameter (cm)	3.03±0.5	2.92±0.32	0.332
LVDD (cm)	4.48±0.45	4.45±0.42	0.281
LVSD (cm)	2.80±0.30	2.81±0.29	0.711
PW (cm)	0.96±0.14	0.96±0.13	0.550
IVS (cm)	0.92±0.16	0.90±0.14	0.742
EF (%)	67.27±5.02	65.90±4.64	0.151
Transmitral E wave (cm/s) (IIQ)	96.9 (23.3)	94.7 (22.5)	0.409
Transmitral A wave (cm/s) (IIQ)	68.0 (16.1)	69.0 (15.3)	0.533
Mitral DT (ms) (IIQ)	198 (45)	188 (57)	0.531
Lateral E’ (cm/s) (IIQ)	12.2 (3)	12.5 (3.5)	0.414
Lateral A’ (cm/s) (IIQ)	9.35 (2.5)	9.0 (3)	0.515
Lateral S’ (cm/s) (IIQ)	9.5 (2)	10.0 (2.1)	0.066
TAPSE (cm) (IIQ)	2.19 (0.44)	2.16 (0.40)	0.537
sPAB (mmHg)	23.79±5.13	25.14±5.63	0.268
FMD (%)	9.52±5.98	12.01±6.18	0.010

*LVDD: left ventricular diastolic diameter; LVSD: Left ventricular systolic diameter; PW: posterior wall; IVS: interventricular septum; EF: Ejection fraction; IIQ: Interquartile Range; DT: deceleration time; E’: peak early diastolic myocardial tissue velocity; A’: peak late diastolic myocardial tissue velocity; S: mitral annular systolic myocardial velocity; FMD: Flow-mediated dilatation; TAPSE: tricuspid annular plane systolic excursion; sPAB: systolic pulmonary artery pressure.

Significantly different parameters in the univariate regression analysis (glucose, creatinine, lymphocyte, neutrophil/lymphocyte ratio, and FMD) were included in the multivariable regression analysis and only the FMD value was significantly different in the control group compared to the COVID-19 group (1.086 (1.026 – 1.149), p=0.04) (Table 4).

Table 4

Independent predictors of COVID-19 by multivariate logistic regression analysis

	OR (95%CI)	p
Glucose	0.981 (0.957–1.005)	0.116
Lymphocyte	1.022 (0.646–1.616)	0.926
Neutrophil/lymphocyte ratio	0.895 (0.744–1.077)	0.240
Creatinine	0.093 (0.005–1.595)	0.101
FMD	1.086 (1.026–1.149)	0.004

*FMD: flow-mediated dilatation; CI: Confidence interval; OR: Odds ratio.

Spearman’s correlation test showed that FMD (r=0.27, p=0.006) had a weak positive correlation with the presence of COVID-19.

Discussion

The purpose of this study was to assess the vascular repercussions of COVID-19 using impaired FMD as a surrogate marker of endothelial dysfunction. Our study demonstrated that the FMD value was lower in COVID-19 patients compared to the control group. These results point to vascular involvement by COVID-19, as assessed by FMD, even in mildly affected patients. Within the limits of our knowledge, this is the first study to show vascular endothelial dysfunction defined by impaired FMD among young patients recovering from a mild COVID-19 infection.

We found a significant reduction in FMD even in such mildly affected patients early after recovery. This raises the question of whether the disease may have long-term abnormal effects on vascular function. Similarly to our findings, Ergul et al.[8] included 63 COVID-19 patients two months after recovery and found COVID-19 infection and increased body mass index as independent predictors of endothelial dysfunction evaluated by FMD.[8]

Likewise, Riou et al.[9] found a significant decrease in FMD among 16 mild-to-moderate COVID-19 patients, whereas FMD tended to be lower among 9 severe-to-critical COVID-19 patients three months after disease onset.[9] Contrary to these reports, we studied mildly affected non-hospitalized COVID-19 patients 35 days (25-178) after disease onset.

Endothelial dysfunction, associated with oxidative stress, is known to be the earliest factor for many diseases.[14] Although inflammation is part of the body’s normal repair response to healing and is essential in protecting our body from infections and dangerous environmental substances, it would be overly optimistic to say that it is completely beneficial. When it gets out of control, it can become detrimental and destructive to the body.[15] Likewise, it is known that systemically out-of-control inflammation is associated with adverse COVID-19 outcomes.[16]

In a study where FMD was used to predict future cardiovascular events in patients who had undergone coronary bypass surgery, the lowest event rate was determined in patients with normal FMD (>8%), while a moderate event rate and the highest event rate were found in patients with an FMD value of 4 to 8% and <4%, respectively.[17] In another study, patients with an FMD less than 6.2% had significantly lower ankle/brachial index compared to those with an FMD greater than 6.2%.[18] In addition, Maruhashi et al.[19] showed that FMD had an inverse correlation with the Framingham Risk Score, commonly used as a risk calculator and an index of cumulative cardiovascular risk for assessing the probability of a heart attack or death from heart disease within 10 years.[19]

Independent predictive factors of mortality from COVID-19 include advanced age, comorbidities such as diabetes mellitus (DM), cardiovascular disease or cancer, and chronic obstructive pulmonary disease at presentation.[20] However, neither infants nor children showed a significant increase in both morbidity and mortality during the COVID-19 pandemic.[21]

With increased age and age-related diseases, the chronic inflammatory state becomes dominant, and the anti-inflammatory response of the immune system becomes erratic and unable to suppress the inflammatory episode in a timely and effective manner.[22] In our study, we aimed to exclude the effects of such advanced age-related inflammation by including subjects under the age of 45 years.

Although still within the normal range, the COVID-19 patients had significantly slightly higher levels of blood glucose and creatinine than those of the control group. During the acute phase of infection, blood glucose levels may rise abnormally in patients under COVID-19 stress, even if they are not diagnosed with diabetes mellitus. Renal function has been also reported to be abnormally affected. High levels of blood glucose in COVID-19 patients can predict worse outcomes regardless of a DM history.[23] Kidney disease is associated with increased mortality from COVID-19.[24] It was found that 14.4% of 701 hospitalized patients with COVID-19 had increased serum creatinine levels, 13.1% had a decreased glomerular filtration rate, and approximately 5% had acute kidney injury.[24] Histopathological findings revealed acute tubular injuries, different impairments of the glomeruli, tubular necrosis, and glomerulosclerosis.[25] Our finding of slightly increased blood glucose and creatinine levels may be an incidental finding but also may suggest subclinical kidney injury and/or ongoing stress.

Lymphopenia has been used in the diagnosis of COVID-19 and has been associated with a poor prognosis.[26] The severity of COVID-19 was also correlated with the neutrophil/lymphocyte ratio and the lymphocyte/CRP ratio.[27] Accordingly, compared to the control group, lymphocyte counts were decreased and NLR was increased in our mild COVID-19 study subjects.

Limitations

The main limitations of this study lie in the fact that it is single-centered and that it was conducted on a relatively small number of patients. The results are limited to an early point in time during the disease process and cannot be extrapolated to reflect long-term findings. Another limitation is that laboratory parameters were not measured simultaneously with FMD measurement. Due to the exclusion criteria and age limit, the study population was strictly selected, and therefore the results can not represent all COVID-19 patients.

Conclusion

This study showed a decrease in FMD in young patients who were mildly affected by COVID-19 in the early recovery phase. Therefore, this parameter may be used as a marker for COVID-19-induced endothelial dysfunction. Undoubtedly, routine cardiovascular monitoring in patients with a history of COVID-19 may identify patients at risk of future cardiovascular events. To better understand the possible cardiovascular effects in these patients, larger-scale studies including long-term follow-up should be considered.