Hematological Changes after Caprine Demineralized Bone Matrix Implantation in Ulnar Critical Defect of Rabbit Model.

Objective  Several animal models have been used in fracture healing and bone graft studies, but hematological responses are seldom reported. Therefore, the present study reported the hematological changes observed in rabbits that underwent xenografting of caprine demineralized bone matrix (CDBM). Method  Twenty-four (24) male rabbits (2.5 ± 0.5kg) were acquired for the purpose of this study and were randomly assigned to three groups: autologous bone graft (ABG), unfilled (NC), and caprine demineralized bone matrix (CDBM). Blood samples were collected through cardiac puncture under xylazine-ketamine anesthesia on day 0 (baseline), and on days 28 and 56 postsurgery and were analyzed manually within 2 hours of collection. Statistical analysis was performed using a two-way analysis of variance (ANOVA) with repeated measures, and a p -value < 0.05 was considered significant. Result  There was an overall significant difference in the values of total white blood cell count ( p  = 0.0043), neutrophil count ( p  < 0.0001), monocyte count ( p  = 0.0184), red blood cell count ( p  = 0.003), hemoglobin concentration ( p  < 0.0001) and packed cell volume ( p  < 0.0001) across the days and the treatment groups. There was, however, no overall significant difference in lymphocyte count ( p  = 0.4923), basophil count ( p  = 0.4183), and eosinophil count (0.4806) within days. Conclusion  Response to CDBM grafting in rabbits could, therefore, be said to be characterized by marked leukocytosis with neutrophilia, lymphocytosis, and monocytosis by day 28 of postgrafting. This could form the basis with which hematology can be used to monitor body response of bone graft animal models. Sociedade Brasileira de Ortopedia e Traumatologia. This is an open access article published by Thieme under the terms of the Creative Commons Attribution-NonDerivative-NonCommercial License, permitting copying and reproduction so long as the original work is given appropriate credit. Contents may not be used for commecial purposes, or adapted, remixed, transformed or built upon. ( https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/ ).

Introduction

Blood is a reflector of the status of any animal and has thus been used to know physiologic and pathologic states and for both diagnostic and prognostic evaluations of various conditions in animals. 1 2 3 4 Hematology is, therefore, performed to investigate metabolites in the body, responses to exposure to antigens, and the state of diseases in animals as different pathologic conditions or exposure to certain conditions affect some specific blood parameters. 1 5 6 7

In the use of hemogram for diagnosis in rabbits, care must be taken as the hematological parameters are affected by so many factors. Age, gender, breed, ambient temperature, diurnal rhythm, and even mere transportation have been reported to cause derailment in the hemogram of rabbits. 8 For example, lymphocytopenia, leukocytosis and increased packed cell volume (PCV) have been reported in rabbits transported at 28°C for up to 3 hours, while cold stress was also reported to increase red blood cell (RBC) count. Furthermore, white blood cell count (WBC) varies due to diurnal fluctuations and variation, with total WBC being observed to be at its lowest in the later afternoon and evening when compared with the earlier hours of the day. 8 In addition, the erythrocytes also vary with gender, as the male rabbits have been observed to have a slightly higher erythrocyte count than females. 8 Also, infectious diseases do not typically cause leukocytosis in rabbits but present a shift from lymphocyte-predominant to neutrophil-predominant differential counts; furthermore, acute infections can be characterized by leukopenia with normal differential count. 8 Anemia, neutrophilia, leukocytosis, and monocytosis were reported in hepatic coccidiosis rabbit model contrasting with the eosinophilia known to accompany parasitic diseases in other animals. 8

In fracture healing, monitoring of hematological parameters play a vital role as any deviation from the physiological reference range could be an indication of infection or graft response and, therefore, require urgent attention to avert the possibility of mal-union, delayed union, or non-union. 9 Hematology is, however, characterized by fluctuation within the normal physiological ranges, which may make its use in diagnosis difficult. 9 Decrease in total RBC is seen following trauma and surgery. 9 Stress, trauma, and surgery are known to cause leukocytosis, lymphocytopenia, and neutrophilia, which could also fluctuate within normal ranges after the initial problem subsides. The increase or decrease of basophils, monocytes, and eosinophils could be subjective in fracture healing monitoring. 9 Due to the scarcity of information on hematological response of fracture healing in animal models, we, therefore, report in the present study, the observed hematological changes in rabbits that underwent xenografting of caprine demineralized bone matrix (CDBM).

Materials and Methods

Experimental Design

The present study was approved by the animal research ethics committee of the institution under the number (UDUS/FAREC/2019/AUP-R0–5). Twenty-four (24) male rabbits (2.5 ± 0.5kg) were randomly grouped into 3 groups, with 8 rabbits in each group. The groups were based on the treatment they received: autologous bone graft group (ABG), unfilled negative control group (NC), and CDBM group.

Preparation of CDBM and Critical Bone Defect

The preparation of the DBM, creation of the defect on the ulna, and bone grafting were performed with modifications following Arpağ et al., 10 Monazzah et al., 11 and Bigham-Sadegh and Oryan. 12

Blood Sample Collection and Hematological Analysis

Blood samples were collected presurgery to serve as the baseline data for the hemogram, with specific interest in complete blood count (CBC) and leucocytic differential count. The blood samples were collected through cardiac puncture under xylazine-ketamine anesthesia. The samples were stored in a ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) sample bottle (JRZ Plastilab, Beirut, Lebanon) and processed under two hours of collection as adopted by Chineke et al. 7 The blood samples were subsequently collected on the 28 th and on the 56 th postoperative days for evaluation. This was with modification from Ajai et al., 13 Bigham-Sadegh et al. 14 and Korkmaz et al. 15

Data Analysis

The data generated was analyzed using a repeated measure mixed model approach with two-way analysis of variance (ANOVA) to detect differences in interaction of days and groups concurrently, and significance level was determined at p  < 0.05 using InVivoStat 4.0.2 (Chelmsford, Essex, UK).

Results

The surgery and grafts implantation were performed successfully, and the animals recovered from anesthesia uneventfully. There was an overall significant leukocytosis ( p  = 0.0043) on days 28 and 56 compared with the baseline. On day 56, a significant difference was also observed in the neutrophil count ( p  < 0.0001), while on day 28, significant neutrophilia was observed in the CDBM group when compared with day 0; the number of neutrophils had reduced by day 56 though it was not statistically different from its baseline value. There was significant monocytosis in the ABG and CDBM groups on day 28, which returned to near baseline by day 56. Although there was no overall statistical difference in the lymphocyte count ( p  = 0.4923), on day 28, the lymphocyte counts of the ABG and CDBM groups were significantly higher from their baseline values. Significantly moderate eosinophilia was observed in the NC and CDBM groups on day 56. An overall significant difference was also observed for RBC ( p  = 0.003), hemoglobin concentration ( p  < 0.0001), and packed cell volume ( p  < 0.0001) across the days and the treatment groups. However, there was no overall significant difference in lymphocyte count ( p  = 0.4923), basophil count ( p  = 0.4183), and eosinophil count (0.4806). The result is presented in Table 1 showing the significant differences across the days and among the groups.

Table 1

Hematological results (mean ± SEM) of experimental animals presurgery (day 0), on day 28 and on day 56 ( n  = 8)

	Day 0			Day 28			Day 56
	ABG	NC	CDBM	ABG	NC	CDBM	ABG	NC	CDBM
WBC X 10 9 /L	3.71 ± 0.43	3.76 ± 0.36	4.53 ± 0.37	4.96 ± 0.36 a	4.90 ± 0.72	6.75 ± 0.36* a	5.51 ± 0.34 b	3.81 ± 0.19*	4.11 ± 0.24*
Neut a X 10 9 /L	0.76 ± 0.09	0.68 ± 0.08	0.81 ± 0.09	1.00 ± 0.07	0.84 ± 0.11	1.30 ± 0.11 a	3.09 ± 0.27 a	1.11 ± 0.13* a	1.19 ± 0.13*
Lym c bX 10 9 /L	2.90 ± 0.34	3.01 ± 0.28	3.63 ± 0.29	3.82 ± 0.29 a	3.98 ± 0.61	5.24 ± 0.26* a	2.30 ± 0.09	2.55 ± 0.19	2.73 ± 0.14
Mono c X 10 9 /L	0.04 ± 0.01	0.07 ± 0.02	0.09 ± 0.02*	0.13 ± 0.02 a	0.09 ± 0.01	0.21 ± 0.03 a	0.07 ± 0.01	0.12 ± 0.02	0.12 ± 0.02
Eosin d X 10 9 /L	0.00 ± 0.00	0.00 ± 0.00	0.00 ± 0.00	0.00 ± 0.00	0.00 ± 0.00	0.02 ± 0.01	0.03 ± 0.01	0.03 ± 0.01 a	0.03 ± 0.01 a
Baso e X 10 9 /L	0.00 ± 0.00	0.00 ± 0.00	0.00 ± 0.00	0.00 ± 0.00	0.00 ± 0.00	0.00 ± 0.00	0.00 ± 0.00	0.00 ± 0.00	0.01 ± 0.01
RBC X 10 12 /L	3.47 ± 0.34	3.55 ± 0.12	3.58 ± 0.30	3.10 ± 0.18	3.71 ± 0.31 a	4.51 ± 0.27* a	3.49 ± 0.27	4.97 ± 0.23* a	3.92 ± 0.21
Hg f (g/dL)	9.46 ± 0.46	14.09 ± 0.35*	11.23 ± 0.37*	8.37 ± 0.46	9.67 ± 0.47 a	10.35 ± 0.80	10.43 ± 0.79	10.11 ± 0.39 b	11.55 ± 0.41
PCV (%)	26.00 ± 1.34	35.58 ± 1.24*	31.50 ± 1.32*	24.63 ± 0.57	23.63 ± 0.96 a	28.50 ± 0.87*	29.63 ± 0.94 a	27.63 ± 0.71 b	31.38 ± 1.19

Abbreviations: ABG, autologous bone graft; CDBM, caprine demineralized bone matrix; NC, negative control; PCV, packed cell volume; RBC, red blood cell count; SEM, standard error of the mean; WBC, white blood cell count.

Different alphabets indicate that the means differ significantly ( p  < 0.05) from day 0 within the same group, while the means bearing an asterisk differ significantly ( p  < 0.05) from ABG for their respective days.

Neutrophils.

Lymphocytes.

Monocytes.

Eosinophils.

Basophils.

Hemoglobin concentration.

Discussion

Since blood is a reflector of the health status of animals, responses to exposure to foreign bodies, and the state of disease in animals, 1 2 3 4 5 6 7 we used hematology to evaluate the responses of the experimental rabbits to the grafted caprine DBM, which is expected to initiate some antigenicity. Several reports have documented normal hematological parameters in rabbits in different geographical zones and conditions, 4 7 8 16 but the fluctuation within the normal physiological ranges make its use in diagnosis difficult, 9 especially in rabbits, in which gender, diurnal rhythm, breed, ambient temperature, age, and stress have been reported to affect their haematology. 7 8 16 It is, therefore, imperative to compare hematological responses with the baseline in any experimental condition, as seen in other studies. 1 17 18

Leukocytosis, which is consistent with the stress of surgery, inflammation, and excruciating pain associated with fracture and fracture healing, 1 9 16 18 19 was observed in the three groups. The leukocytosis, which was exceptionally marked and significant in the CDBM group on day 28, could be as a result of the immune reaction to the implanted caprine DBM. The value of the leucocyte count had dropped by day 56 to near baseline value, which is indicative of reduced reaction to the implant. This was the same pattern of reaction that was observed for neutrophil and lymphocyte. This is in accordance with earlier reports, 16 20 which state that in conditions that triggers immunologic response, there is leukocytosis with marked lymphocytosis.

Many factors, such as time of the day of blood sampling and stress, are known to affect monocyte, eosinophil, and basophil counts. 16 20 Despite this, monocytosis has been reported to be consistent with chronic inflammation in rabbits, 16 20 and the same was observed for CDBM on day 28 when compared with its baseline. Eosinophilia and basophilia are markers of allergic and hypersensitive conditions. Mild eosinophilia here was not observed in this study until day 56 in CDBM group. This could be due to reduced immunogenicity of demineralized bone by the process of demineralization as reported. 21 22

The reduced PCV observed on the 28 th day in all the groups was as a result of blood loss to surgery. This is in accordance with the earlier reports 1 20 that anemia occurs when there is external hemorrhage. However, the animals in all the groups have increased PCV values by day 56, though the values were not up to their corresponding baselines. This showed that there was regenerative response to the blood loss. In the same vein, the hemoglobin concentration also decreased on day 28 and had risen to almost above the baseline by day 56. On the contrary, the RBC count increased on days 28 and 56 for all the groups, except for the ABG on day 28, which was lower when compared with the baseline but not statistically significant. The different patterns observed for the RBC could be a result of the time of sampling and ambient temperature that affect the experimental animals. 16 20

The inability to monitor the diurnal rhythm and environmental temperature in relation to the variation of hematological values obtained are the limitations of this study.

Conclusion

Despite several fluctuations that mar the interpretability of hematology in rabbits. It can be concluded from this study, the rabbits responded to the CDBM with marked leukocytosis with neutrophilia, lymphocytosis and monocytosis by day 28, which became near normal by day 56 post-grafting. This could therefore form a hematological basis with which the state of bone grafting animal models could be monitored. It is however strongly recommended that baseline is taken in every study involving hematology in rabbits, putting diurnal rhythm and environmental temperature into consideration.

Introdução

O sangue reflete o estado de qualquer animal e, assim, tem sido usado para conhecer estados fisiológicos e patológicos e em avaliações diagnósticas e prognósticas de várias doenças. 1 2 3 4 A análise hematológica é, portanto, realizada para investigar metabólitos no corpo e respostas à exposição a antígenos e doenças em animais, pois diferentes patologias ou a exposição a certas condições influenciam alguns parâmetros sanguíneos específicos. 1 5 6 7

Deve-se ter cuidado ao usar o hemograma com fins diagnósticos em coelhos, pois os parâmetros hematológicos são afetados por muitos fatores. Idade, sexo, raça, temperatura ambiente, ritmo diurno e até mesmo o transporte foram relatados como causas de alterações no hemograma de coelhos. 8 Linfocitopenia, leucocitose e aumento do hematócrito, por exemplo, foram relatados em coelhos transportados a 28° C por até 3 horas, enquanto o estresse pelo frio aumentou o número de hemácias. Além disso, o número de leucócitos é variável por sofrer flutuações diurnas, sendo menor no final da tarde e à noite em comparação às primeiras horas do dia. 8 O número de hemácias também varia de acordo com o sexo do animal e é ligeiramente maior em coelhos machos em comparação às fêmeas. 8 Doenças infecciosas normalmente não causam leucocitose em coelhos, mas mudam as contagens diferenciais, passando da predominância de linfócitos para a predominância de neutrófilos; ademais, as infecções agudas podem ser caracterizadas por leucopenia com contagem diferencial normal. 8 Anemia, neutrofilia, leucocitose e monocitose foram relatadas em um modelo de coccidiose hepática em coelhos, contrastando com a eosinofilia conhecida por acompanhar as doenças parasitárias em outros animais. 8

O monitoramento dos parâmetros hematológicos tem papel vital na cicatrização de fraturas, já que qualquer desvio do intervalo de referência pode ser uma indicação de infecção ou resposta ao enxerto e, assim, requer atenção urgente para evitar a possibilidade de consolidação inadequada, tardia ou ausente. 9 A hematologia é, no entanto, caracterizada por flutuações dentro das faixas fisiológicas normais, o que pode dificultar sua utilidade diagnóstica. 9 A diminuição no número total de hemácias é observada após trauma e cirurgia. 9 Estresse, trauma e cirurgia são conhecidos por causar leucocitose, linfocitopenia e neutrofilia, com números que também podem flutuar dentro dos limites normais após a diminuição do problema inicial. O aumento ou redução do número de basófilos, monócitos e eosinófilos pode ser subjetivo no monitoramento da consolidação da fratura. 9 Devido à escassez de informações sobre a resposta hematológica à consolidação de fratura em modelos animais, este estudo relata as alterações hematológicas observadas em coelhos submetidos a xenoenxertos de matriz óssea desmineralizada caprina.

Delineamento Experimental

Este estudo foi aprovado pelo comitê de ética em pesquisa com animais da faculdade sob o número UDUS/FAREC/2019/AUP-R0–5. Vinte e quatro coelhos machos (2,5 ± 0,5 kg) foram divididos aleatoriamente em 3 grupos de 8 indivíduos. Cada grupo foi submetido a um tratamento: enxerto ósseo autólogo (EOA), controle negativo sem preenchimento (SP) e matriz óssea desmineralizada caprina (MODC).

Preparo de MODC e Defeito Ósseo Crítico

O preparo da MODC, a criação do defeito na ulna e o enxerto ósseo foram realizados segundo técnica modificada de Arpağ et al., 10 Monazzah et al. 11 e Bigham-Sadegh e Oryan. 12

Coleta de Amostra de Sangue e Análise Hematológica

As amostras de sangue foram coletadas antes da cirurgia para obtenção dos valores basais do hemograma completo e da contagem diferencial de leucócitos. As amostras de sangue foram coletadas por punção cardíaca sob anestesia com xilazina-quetamina. As amostras foram armazenadas em frasco com ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA; JRZ Plastilab, Beirute, Líbano) e processadas até 2 horas após a coleta, como adotado por Chineke et al. 7 As amostras de sangue foram novamente coletadas no 28° e no 56° dia após a cirurgia, conforme Ajai et al., 13 Bigham-Sadegh et al. 14 e Korkmaz et al. 15 com modificações.

Análise de Dados

Os dados gerados foram analisados por uma abordagem de modelo misto de medidas repetidas com análise de variância (ANOVA) de dois fatores para detecção de diferenças na interação simultânea de dias e grupos, com nível de significância determinado como p  < 0,05, em InVivoStat 4.0.2 (Chelmsford, Essex, UK).

Resultados

A cirurgia e o implante dos enxertos foram realizados com sucesso e os animais se recuperaram da anestesia sem intercorrências. Houve uma leucocitose global significativa ( p  = 0,0043) nos dias 28 e 56 em relação aos valores basais. No 56° dia, uma diferença significativa também foi observada no número de neutrófilos ( p  < 0,0001). No 28° dia, uma neutrofilia significativa foi observada no grupo MODC em comparação ao dia 0; o número de neutrófilos caiu no 56° dia e não foi estatisticamente diferente de seu valor basal. Os grupos EOA e MODC apresentaram monocitose significativa no 28° dia, com retorno aos valores basais no 56° dia. Embora não tenha havido diferença estatística geral no número de linfócitos ( p  = 0,4923), os grupos EOA e MODC apresentaram valores significativamente maiores no 28° dia em comparação ao dia 0. Uma eosinofilia moderada foi observada nos grupos SP e MODC no 56° dia. Uma diferença significativa geral também foi observada no número de hemácias ( p  = 0,003), concentração de hemoglobina ( p  < 0,0001) e hematócritos ( p  < 0,0001) ao longo dos dias nos diferentes grupos de tratamento. No entanto, não houve diferença global significativa no número de linfócitos ( p  = 0,4923), basófilos ( p  = 0,4183) e eosinófilos ( p  = 0,4806). Os resultados são apresentados na Tabela 1 , que mostra as diferenças significativas ao longo dos dias e entre os grupos.

Tabela 1

Resultados hematológicos (média ± erro padrão) dos animais experimentais antes da cirurgia (dia 0), no dia 28 e no dia 56 ( n  = 8)

	Dia 0			Dia 28			Dia 56
	EOA	SP	MODC	EOA	SP	MODC	EOA	SP	MODC
Leucócitos X 10 9 /L	3,71 ± 0,43	3,76 ± 0,36	4,53 ± 0,37	4,96 ± 0,36 a	4,90 ± 0,72	6,75 ± 0,36* a	5,51 ± 0,34 b	3,81 ± 0,19*	4,11 ± 0,24*
Neutrófilos X 10 9 /L	0,76 ± 0,09	0,68 ± 0,08	0,81 ± 0,09	1,00 ± 0,07	0,84 ± 0,11	1,30 ± 0,11 a	3,09 ± 0,27 a	1,11 ± 0,13* a	1,19 ± 0,13*
Linfócitos X 10 9 /L	2,90 ± 0,34	3,01 ± 0,28	3,63 ± 0,29	3,82 ± 0,29 a	3,98 ± 0,61	5,24 ± 0,26* a	2,30 ± 0,09	2,55 ± 0,19	2,73 ± 0,14
Monócitos X 10 9 /L	0,04 ± 0,01	0,07 ± 0,02	0,09 ± 0,02*	0,13 ± 0,02 a	0,09 ± 0,01	0,21 ± 0,03 a	0,07 ± 0,01	0,12 ± 0,02	0,12 ± 0,02
Eosinófilos X 10 9 /L	0,00 ± 0,00	0,00 ± 0,00	0,00 ± 0,00	0,00 ± 0,00	0,00 ± 0,00	0,02 ± 0,01	0,03 ± 0,01	0,03 ± 0,01 a	0,03 ± 0,01 a
Basófilos X 10 9 /L	0,00 ± 0,00	0,00 ± 0,00	0,00 ± 0,00	0,00 ± 0,00	0,00 ± 0,00	0,00 ± 0,00	0,00 ± 0,00	0,00 ± 0,00	0,01 ± 0,01
Hemácias X 10 12 /L	3,47 ± 0,34	3,55 ± 0,12	3,58 ± 0,30	3,10 ± 0,18	3,71 ± 0,31 a	4,51 ± 0,27* a	3,49 ± 0,27	4,97 ± 0,23* a	3,92 ± 0,21
Hemoglobina (g/dL)	9,46 ± 0,46	14,09 ± 0,35*	11,23 ± 0,37*	8,37 ± 0,46	9,67 ± 0,47 a	10,35 ± 0,80	10,43 ± 0,79	10,11 ± 0,39 b	11,55 ± 0,41
Hematócrito (%)	26,00 ± 1,34	35,58 ± 1,24*	31,50 ± 1,32*	24,63 ± 0,57	23,63 ± 0,96 a	28,50 ± 0,87*	29,63 ± 0,94 a	27,63 ± 0,71 b	31,38 ± 1,19

Abreviaturas: EOA, enxerto ósseo autólogo; MODC, matriz óssea desmineralizada caprina; SP, sem preenchimento.

Diferentes letras indicam que as médias diferem de forma significativa ( p  < 0,05) das médias do dia 0 no mesmo grupo, enquanto os asteriscos indicam diferença significativa ( p  < 0,05) em EOA nos seus respectivos dias.

Discussão

Como o sangue reflete o estado de saúde dos animais e as respostas à exposição a corpos estranhos e às doenças, 1 2 3 4 5 6 7 usamos a hematologia para avaliação das respostas dos coelhos experimentais ao enxerto de MODC, que tem certa antigenicidade esperada. Vários relatos documentaram parâmetros hematológicos normais em coelhos de diferentes zonas geográficas e condições, 4 7 8 16 mas a flutuação dentro das faixas fisiológicas normais dificulta seu uso diagnóstico, 9 especialmente em coelhos, já que o sexo, o ritmo diurno, a raça, a temperatura ambiente, a idade e o estresse influenciam seus valores hematológicos. 7 8 16 É, portanto, imperativo comparar as respostas hematológicas com os achados basais em qualquer condição experimental, como discutido em outros estudos. 1 17 18

A leucocitose, que condiz com o estresse da cirurgia e a inflamação e a dor excruciante associadas à fratura e sua consolidação, 1 9 16 18 19 foi observada nos três grupos. A leucocitose intensa e significativa apresentada pelo grupo MODC no 28° dia pode ser o resultado da reação imune à MODC implantada. O número de leucócitos caiu no 56° dia e se aproximou ao valor basal, o que é indicativo de redução da reação ao implante. Este foi o mesmo padrão de reação observado para neutrófilos e linfócitos. Isso está de acordo com relatos anteriores 16 20 de leucocitose com linfocitose acentuada em condições que desencadeiam respostas imunes.

Muitos fatores, como o horário da coleta de sangue e o estresse, influenciam o número de monócitos, eosinófilos e basófilos. 16 20 Ainda assim, a monocitose condiz com a inflamação crônica em coelhos, 16 20 como observado no grupo MODC no 28° dia em comparação aos valores basais. A eosinofilia e a basofilia são marcadores de alergias e hipersensibilidades. A eosinofilia branda não foi observada neste estudo até o 56° dia no grupo MODC. Isso pode ter sido causado pela redução da imunogenicidade do osso pelo processo de desmineralização. 21 22

O menor número de hematócritos observado no 28° dia em todos os grupos foi decorrente da perda de sangue à cirurgia. Isso está de acordo com relatos anteriores 1 20 de anemia após hemorragia externa. No entanto, os animais de todos os grupos apresentaram aumento do hematócrito no 56° dia, mas sem chegar aos valores basais correspondentes. Isso mostra que houve resposta regenerativa à perda de sangue. Da mesma forma, a concentração de hemoglobina também diminuiu no dia 28 e subiu até quase superar os valores basais no 56° dia. Por outro lado, o número de hemácias aumentou nos dias 28 e 56 em todos os grupos à exceção do EOA no 28° dia, no qual foi menor em comparação ao valor basal, sem significado estatístico. Os diferentes padrões observados para o número de hemácias podem ser decorrentes do tempo de coleta de amostra e da temperatura ambiente que influenciam os animais experimentais. 16 20

A incapacidade de monitorar o ritmo diurno e a temperatura ambiente em relação à variação dos valores hematológicos obtidos são as limitações deste estudo.

Conclusão

Apesar das várias flutuações que prejudicam a interpretação da análise hematológica em coelhos, este estudo concluiu que os animais responderam à MODC com leucocitose intensa com neutrofilia, linfocitose e monocitose no 28° dia e retorno a valores próximos aos normais no 56° dia após o procedimento. Estes dados podem, portanto, formar uma base hematológica para monitoramento do estado dos modelos animais de enxerto ósseo. No entanto, é fortemente recomendado que os valores basais sejam determinados em todos os estudos hematológicos em coelhos, considerando o ritmo diurno e a temperatura ambiente.