Development of a Device to Obtain Platelet-Rich Plasma (PRP).

Objective  To present an innovative device that applies the double centrifugation method to obtain platelet-rich plasma (PRP), assessing whether there was an effective increase in the concentration of platelets. Method  Ten volunteers underwent blood collection. The samples were separated in 20 ml syringes, sealed and subjected to the double centrifugation protocol at 1,100 revolutions per minute (rpm) for 15 minutes, resulting in the separation of red blood cells, plasma with platelets, and leukocytes. Then, 10 ml syringes were added to remove 9 ml, respecting the "buffy coat" parameter, collecting 8 ml above and 1 ml below for the second centrifugation and transferring again to the 20 ml syringe. The plasma was again centrifuged at 1,550 rpm for 10 minutes; as a result, it was divided into two parts: at the top, consisting of low platelet plasma (LPP), and at the bottom, by the platelet button. Part of the LPP was discarded, leaving only 3 ml with the platelet button. The cells were then counted. Results  This innovative device was able to increase the concentration of platelets by almost three times compared with the baseline. In addition, the preparation time for the PRP was adequate, lasting only 35 to 40 minutes. Conclusions  Platelet-rich plasma was successfully obtained by the double centrifuge protocol, allowing its clinical use. In addition, obtaining through the presented device promotes greater applicability in the preparation of PRP in specific centers, furthermore, being a quick and economical way to obtain PRP. Sociedade Brasileira de Ortopedia e Traumatologia. This is an open access article published by Thieme under the terms of the Creative Commons Attribution-NonDerivative-NonCommercial License, permitting copying and reproduction so long as the original work is given appropriate credit. Contents may not be used for commercial purposes, or adapted, remixed, transformed or built upon. ( https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/ ).

Introduction

Platelet-rich plasma (PRP), due to its regenerative capacity in different tissues, is considered a technology with great potential. The local action of growth factors, the results on cell differentiation and proliferation, as well as the modulation in the inflammatory response are some of the biological reasons for its clinical use. 1 Platelet-rich plasma is defined as a plasma volume with more platelets than that found in peripheral blood. 2 The most recent literature opts for a more quantitative definition, and it is believed that a platelet concentration between 200 × 10 3 and 1000 × 10 3 /μL is considered therapeutically effective, while higher concentrations would be biologically unfavorable. 3 4 5 Studies developed in the field of orthopedics point to the promising use of PRP. Sánchez et al. 6 demonstrated that, after 6 months of treatment of hip osteoarthritis with PRP, there was a decrease in pain intensity in 40% of patients. Mishra et al. 7 evaluated the effect of PRP when treating chronic elbow tendinosis, observing a reduction in pain, in addition to a therapeutic alternative before the surgical intervention. Sánchez et al. 8 treated patients with Achilles tendon rupture with PRP. In their study, athletes treated only with surgery were compared to those treated with PRP and surgery. It was observed that those treated with surgery and PRP showed improvement of healing and functional recovery. Platelet-rich plasma has also been used in orthopedic surgeries, such as total joint replacement and osteochondral defects correction by arthroscopy. 9 10

Platelet-rich plasma is obtained through the patient's blood through a process that uses cell separation by centrifugation, which can be classified as single or double centrifugation. Although there is no consensus as to which of them would be the most advantageous to obtain PRP, Macedo 11 demonstrated that double centrifugation has a higher platelet concentration capacity. In his study, when analyzing two protocols, he observed that the platelet count increased by 143% with the single centrifuge, while the double showed an increase of 327%. The obtainment of PRP by the various protocols existing in the literature is an object of interest, as it can result in compounds of different platelet concentrations. 12

A study by Perez et al., 13 which used 3.5 ml of blood and centrifugal force of 100 G during 10 minutes in a first centrifugation, and of 400 G during 10 minutes in the second centrifugation, resulted in a 5-fold higher concentration of platelets. Kececi et al. 14 used, as a protocol for the first centrifugation, parameters of between 250 and 270 G during 10 minutes; in the second centrifugation, the force varied to 300 G, 500 G, 750 G, 1000 G, 1500 G and 2000 G during 10 minutes. Platelet concentration followed the increase in the second centrifugal force, increasing by 1.92 times, 2.16 times, 2.80 times, 3.48 times, 3.67 times and 3.76 times, respectively. Thus, it was concluded that obtaining a certain concentration of platelets can be possibly adjusted, individually, according to the centrifugation force used. As seen, the different platelet concentrations obtained depend on the protocol used, making it difficult to evaluate which is best to obtain the PRP.

The present study aimed to present an innovative device for PRP preparation, composed by a set of parts adaptable to common-use syringes, which in turn are adaptable to the centrifuge, accelerating the preparation time and reducing the chance of activation of platelets. This is a low-cost alternative. In addition, we tested its effectiveness through a double centrifuge protocol for PRP production, evaluating the effective increase in platelet concentration.

Material and Methods

Selection of patients

The PRP preparation process was carried out at the Unit Lab of Universidade de Tiradentes (Unit, in the Portuguese acronym), Farolândia Campus. The present study was approved by the Research Ethics Committee, under the number 3,801,134. Ten volunteers, aged between 18 and 70 years old, participated in the present study after undergoing a medical consultation in an orthopedic outpatient clinic. None of the participants used oral anticoagulants, nor had flu-like symptoms in the previous 30 days before the collection. In addition, only those who had total blood platelets greater than 50,000/μL and who did not manifest any type of blood dyscrasia were included in the present study.

Method of Obtaining PRP

First, with a 20 ml syringe, we aspirated 1 ml from the vial containing anticoagulant citrate acid dextrose (ACD). Then, after antisepsis in the antecubital region with alcohol-soaked cotton, a venous puncture of 14 ml of blood from each volunteer was performed with the 20 ml syringe, gently shaking to join the anticoagulant to the blood ( Fig. 1A ). A 3 ml sample was separated into a sterile tube to determine the initial platelet count. The 20 ml syringe was used in the double centrifugation process to obtain the PRP in a laboratory centrifuge with a mold that allowed its easy adaptation ( Fig. 1B ). The 20 ml syringes were taken to a centrifuge and, with the lid closed, subjected to 1,100 revolutions per minute (rpm) (224 G) for 15 minutes, giving rise to 3 columns due to differences in the density of blood components: the lower, red, with red blood cells; and the upper one, yellow, with plasma and platelets. Between these two columns is a narrow whitish band, known as the “buffy coat”, which has white blood cells and concentrated platelets ( Fig. 1C ). From the 15 ml contained in the 20 ml syringe, 8 ml were removed above the mist zone and 1 ml below it, totaling 9 ml. These 9 ml were subjected to a new centrifugation of 1,550 revolutions per minute (444 G) for 10 minutes, giving rise to 2 columns: the upper one, formed by platelet-poor plasma (PPP); and the lower one, by the erythrocytic-platelet button ( Fig. 1D ). The volume of 6 ml that would correspond to the PPP was inspired with a 10 ml syringe, discarding it, leaving 3 ml next to the erythrocytic-platelet button. This material was slowly agitated to enable platelet resuspension, resulting in PRP. After this method to obtain PRP, the 3 ml were transferred to a sterile tube and the platelet count was performed in an automatic device.

Fig. 1

Images of the platelet-rich plasma (PRP) preparation. ( A ) Positioning of venipuncture. ( B ) Adapted centrifuge used to obtain the PRP. ( C ) Blood sample after the first centrifugation. ( D ) Blood sample after second centrifugation.

Statistical Analysis

Data analysis was performed using the Student t-test for dichotomous variables and the Pearson correlation coefficient for categories, with a significance level of 5% ( p  < 0.05). The software handled was the IBM SPSS Statistics for Windows, version 25.0 (IBM Corp., Armonk, NY, USA).

Results

The sociodemographic profile of the volunteers is shown below ( Table 1 ).

Table 1

Volunteer data

	Female	Male
Gender	8	2
Average age	29.30
Average body mass index	25.7783

Platelet Count after Application of the Protocol

In the blood samples of the 10 volunteers, the initial amount of platelets was within normal parameters (200,000–385,000 platelets/μL). After double centrifuging the 14 ml of blood samples, we obtained an average value of 694,200 platelets/uL (standard deviation [SD] = 57,019 platelets/μL). The platelet count obtained initially and subsequently the application of the platelet concentration protocol using this new device is explained in Table 2 .

Table 2

Results of the initial platelet count and after application of the PRP obtainment protocol

Voluntary	Initial platelet count (x10 3 platelets/μl)	Platelet count in PRP (x10 3 platelets/μl)	Increase in platelet count (x10 3 platelets/μl)
1	291	595	304
2	224	623	399
3	291	849	558
4	222	549	327
5	266	760	494
6	200	507	307
7	318	673	355
8	385	829	444
9	339	717	378
10	283	840	557
Average	281.9	694.2	412.3

Abbreviation: PRP: platelet-rich plasma.

This double centrifugation protocol led to an increase in platelet count of at least 2 times over the initial platelet value in the blood sample. The mean platelet values before and after the application of our protocol for obtaining PRP are shown in Figure 2 .

Fig. 2

Result after the application of the protocol for obtaining platelet-rich plasma, promoting an increase in the mean platelet count of at least twice the initial value.

Counting of other Cells after Application of the Protocol

When analyzing hemoglobin (HB), hematocrit (HCT), leukocytes (LEUCO) and neutrophil (NEUTRO) values, we observed a reduction of 25.12% in the HB value and of 24.1% in the HCT value. Regarding LEUCO and NEUTRO, there was an increase of 104.98% and 72.58%, respectively.

Some Correlations

There was a correlation between the amount of platelets and the amount of basal hemoglobin ( p  = 0.023). In addition, the percentage increase in platelets has a higher mean among men (169.5%), and there was no significant correlation in relation to age, weight or body mass index (BMI).

Platelet Preservation and Time to Obtain PRP

The volume of ACD used in platelet conservation was 1 ml. Obtaining the PRP, from the initial stage with anticoagulant aspiration to obtaining PRP, lasted from 35 to 40 minutes.

Discussion

In the literature, the clinical applications of PRP are diverse; they involve skin, bone, dental, ophthalmic injuries, nerve injuries, burns, vascular and aesthetic surgeries, as well as tendon, muscle and cartilage injuries. The results found were optimistic and promising in most studies. However, it is difficult to choose the method to be used due to numerous alternative protocols for obtaining PRP and the standardization absent among them, which may justify the lack of effectiveness observed by some authors. 15 The methods described for obtaining PRP can be divided into two groups: centrifugation and apheresis. A study by Malavolta et al. 16 analyzed the use of PRP obtained through apheresis in arthroscopic repair of complete rotator cuff tears, showing that it is associated with significant functional improvement and incomplete tear. By this method, ∼ 400 ml of blood were drained into a separation device under continuous centrifugation at 5,800 rpm for 15 minutes, through a peripheral access. After separation of blood elements by density, an optical analyzer determined the platelet layer by the characteristic of its refraction and separated it in a sterile collection bag, obtaining ∼ 30 ml of PRP; the other blood components were returned via the same venous access. Apheresis, although it can generate higher concentrations of platelets compared to centrifugation, is not a practical and less expensive method like centrifugation. Thus, by using centrifugation, the present study presents a less expensive and highly practical method for the preparation of platelet-rich plasma (PRP), together with a protocol that aims to guarantee a minimum effectiveness of the final product. The blood punctured for PRP formulation was added to the syringe containing ACD, which has a greater capacity for platelet concentration compared to other anticoagulants, such as sodium citrate (CS). 17 The use of anticoagulants is important because, by binding with calcium, they prevent the beginning of the coagulation cascade, making it impossible to transform prothrombin into thrombin. It is important to emphasize that the use of an anticoagulant is not in fact mandatory in the creation of PRP; however, in its absence, the coagulation cascade will begin within 30 seconds to several minutes. 3 The choice of ACD in the present study aims to preserve platelets, avoiding changes in their structure and functionality.

The initial platelet count was at least 2 times lower than that present after PRP preparation. The conclusions of the present work are in line with those presented by Nagata et al., 18 in which the final amount of PRP platelets was substantially greater than the platelet count of the initial blood sample. In addition, Franco 19 also obtained similar values when assessing the effectiveness of PRP after total knee arthroplasty. A volume of 20 ml of peripheral blood was collected and centrifuged at 1,200 rpm for 10 minutes. The plasma (the most superficial layer) was transferred to another sterile 10 ml tube and centrifuged at the same rotation for 5 minutes. In the end, half of the upper plasma layer obtained was discarded, leaving a platelet concentrate of two to four times the value of the plasma. The study pointed out that, although PRP was not effective in reducing bleeding or improving knee function after arthroplasty, there was a better response in assessing pain after 24 and 48 hours, 1 and 3 weeks and 2 months after the operation ( p  < 0.05). Regarding the centrifugation method, it can be single or double centrifugation. The present study opted for the double centrifugation protocol, recommended by Landsberg et al. 20 and by Garcez et al., 21 having been shown to be effective, since an increase of at least 100% in the number of platelets was observed. There were also increases in the amount of platelets close to 200%, making it possible to obtain even more favorable results. Furthermore, the double centrifugation proved to be superior in a study comparing both methods. A volume of 8.5 ml of blood was submitted to 1,300 rpm for 10 minutes and, for a second centrifugation, 2,000 rpm for 10 minutes. In the single centrifugation, the volume was 3.5 ml, with parameters of 1,500 rpm for 7 minutes. At the end, there was an increase of 336% in the number of platelets with 2 centrifugations and of 227% with only one. 22 Platelet-rich plasma is more difficult and expensive when obtained by automated methods that require exclusive kits, which require greater amounts of blood to obtain an adequate platelet concentration and high PRP volumes. 23 24

After countless studies in search of the most appropriate collection method linked to the lowest cost, such as those bt Weibrich et al. 25 and by Vendramin et al., 23 which originated protocols for preparing PRP using laboratory centrifuges, the present study was carried out to develop a new device for obtaining PRP, whose method is simple, fast and low-cost. Although a centrifugation protocol has not yet been produced, some studies suggest single centrifugation, while others indicate double centrifugation. 20 26 27 28 Since there is no consensus regarding the number of centrifugations (single or double) and the speed of rotation and established time, this protocol standardized double centrifugation to obtain PRP, guaranteeing double the initial platelet count in peripheral blood. A speed of 1,100 rpm was used for 15 minutes in the first centrifugation and of 1,550 rpm for 10 minutes in the second. The choice of double centrifugation was due to its applicability in studies with promising results, such as the use of PRP adjuvant to the treatment of tibial pseudoarthrosis. Through peripheral access puncture, 55 ml of blood was collected and passed through a first centrifugation of 3,650 rpm for 12 minutes, discarding the erythrocyte layer, the remainder being subjected to a second centrifugation of 3,000 rpm, where the two upper thirds of PPP were discarded and the rest was mixed with thrombocyte concentrate, producing PRP. In this study, the use of PRP led to a shorter consolidation time (7 months) when compared to 13 months in patients who did not use it ( p  > 0.01). 29 A study by Denieli 30 also strengthens the choice for double centrifugation, in which the effect of the surgical application of PRP on chondral lesions of the knee was evaluated. A total of 20 ml of blood was punctured in a peripheral vein and centrifuged at 1,200 rpm for 10 minutes. The most superficial layer (plasma) was used, discarding the “buffy coat” and red blood cells in the second centrifugation for 5 minutes at the same speed. After the second centrifugation, the lower half (PRP) was used for application, noting better and faster results of the functionality compared with those who did not use the PRP. These results already appear 3 months after surgery and last up to 12 months.

The present work achieved an increase in the initial platelet count between 104.47% and 196.82% by using the double centrifugation protocol and applying the mentioned speeds. Although some authors state that the number of platelets contained in the PRP must be > 1,000,000 platelets/μL, others claim that it is possible to obtain a therapeutic effect with a minimum value of 300,000 platelets/μL. 31 In the present work, a final platelet count in the PRP between 507,000 and 849,000 platelets/μL was achieved, which is similar to the literature. 32 The preparation time for the PRP in the present study, from the collection of the anticoagulant before the venipuncture until obtaining it, was of 35 to 40 minutes. Time is a crucial factor when considering the use of PRP in surgical procedures. Regarding the duration to obtain the PRP, the present study showed similarities to those of Garcez et al. 33 and Morato et al., 34 who observed a variation of 30 to 50 minutes in this time.

Several devices for preparing PRP are commercially available, which operate from a small collected blood volume (20–60 ml) and use the single or double centrifugation protocol. By varying the method and time of centrifugation for preparing the PRP, these systems differ in relation to their potential for concentrating platelets. As an effect, there is variation in the amount of platelets present in the PRP. Thus, it becomes complex to assess which kit would be the best for obtaining the PRP. 35 PRGF (BTI Biotechnology Institute, Porto, Portugal), Harvest SmartPReP (Harvest Technologies Corporation, Viena, Áustria), Vivostat (Vivostat A/S, Copenhague, Dinamarca) and Regen (Regenlab, Lausanne, Suíça) are some of the automated systems commercialized for PRP preparation; however, they are expensive and difficult to handle, which can lead to sterility compromised by an inexperienced operator or to shifting quality.

Conclusions

The conclusions presented from the present study indicate that obtaining PRP by the device presented, following this double centrifuge protocol, is of excellent applicability in specific centers that operate in the production of PRP, in addition to being an easy and economical way to prepare it. By using the double centrifugation method, we achieved a significant increase in platelet count in the PRP compared to the initial amount of platelets in the peripheral blood. In addition, obtaining PRP takes approximately 35 to 40 minutes, which can be considered an acceptable and fast time.

Introdução

O plasma rico em plaquetas (PRP), devido à sua capacidade regenerativa em diferentes tecidos, é considerado uma tecnologia com grande potencial. A ação local de fatores de crescimento, os resultados na diferenciação e proliferação celular, bem como a modulação na resposta inflamatória, são algumas das razões biológicas para seu uso clínico. 1 O PRP é definido como um volume de plasma com mais plaquetas do que o encontrado no sangue periférico. 2 A literatura mais recente opta por uma definição mais quantitativa, e acredita-se que uma concentração de plaquetas entre 200 × 10 3 e 1000 × 10 3 /µL é considerada terapeuticamente eficaz, enquanto concentrações mais elevadas seriam biologicamente desfavoráveis. 3 4 5 Estudos desenvolvidos no campo da ortopedia apontam para o uso promissor do PRP. Sánchez et al. 6 demonstraram que, após 6 meses de tratamento da osteoartrite do quadril com PRP, houve diminuição da intensidade da dor em 40% dos pacientes. Mishra et al. 7 avaliaram o efeito do PRP no tratamento da tendinose crônica do cotovelo, observando uma redução da dor, além de uma alternativa terapêutica antes da intervenção cirúrgica. Sánchez et al. 8 trataram pacientes com ruptura do tendão de Aquiles com PRP. Em seu estudo, os atletas tratados apenas com cirurgia foram comparados aos tratados com PRP e cirurgia. Observou-se que os tratados com cirurgia e PRP apresentaram melhora da cicatrização e recuperação funcional. O PRP também tem sido utilizado em cirurgias ortopédicas, como substituição total da articulação e correção de defeitos osteocondrais por artroscopia. 9 10

O PRP é obtido do sangue do paciente por meio de um processo que utiliza separação celular por centrifugação, que pode ser classificada como centrifugação única ou dupla. Embora não haja consenso sobre qual delas seria a mais vantajosa para obter PRP, Macedo 11 demonstrou que a centrifugação dupla tem maior capacidade de concentração de plaquetas. Em seu estudo, ao analisar dois protocolos, observou que a contagem de plaquetas aumentou 143% com a centrifugação única, ao passo que com a centrifugação dupla apresentou um aumento de 327%. A obtenção de PRP pelos diversos protocolos existentes na literatura é objeto de interesse, pois pode resultar em compostos de diferentes concentrações de plaquetas. 12

Um estudo de Perez et al., 13 que usou 3,5 mL de sangue e força centrífuga de 100 G durante 10 minutos em uma primeira centrifugação, e de 400 G durante 10 minutos na segunda centrifugação, resultou em uma concentração 5 vezes maior de plaquetas. Kececi et al. 14 utilizaram, como protocolo para a primeira centrifugação, parâmetros de 250 a 270 G durante 10 minutos; na segunda centrifugação, a força variou para 300 G, 500 G, 750 G, 1000 G, 1500 G e 2000 G durante 10 minutos. A concentração de plaquetas acompanhou o aumento da força durante a segunda centrifugação, aumentando 1,92 vezes, 2,16 vezes, 2,80 vezes, 3,48 vezes, 3,67 vezes e 3,76 vezes, respectivamente. Assim, concluiu-se que a obtenção de uma certa concentração de plaquetas pode ser possivelmente ajustada, individualmente, de acordo com a força de centrifugação utilizada. Como visto, as diferentes concentrações de plaquetas obtidas dependem do protocolo utilizado, dificultando a avaliação de qual o melhor para obter o PRP.

O presente estudo teve como objetivo apresentar um dispositivo inovador para a preparação de PRP, composto por um conjunto de peças adaptáveis às seringas de uso comum, que por sua vez são adaptáveis à centrífuga, acelerando o tempo de preparo e reduzindo a chance de ativação de plaquetas. Esta é uma alternativa de baixo custo. Além disso, testamos sua eficácia através de um protocolo de centrifugação dupla para produção de PRP, avaliando o aumento efetivo da concentração de plaquetas.

Seleção de pacientes

O processo de preparação do PRP foi realizado no UnitLab da Universidade Tiradentes (Unit), Campus Farolândia, Aracaju, SE. O presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa sob o parecer número 3.801.134. Dez voluntários, entre 18 e 70 anos, participaram do estudo após passarem por consulta médica em ambulatório de ortopedia. Nenhum dos participantes usou anticoagulantes orais, nem apresentou sintomas gripais nos últimos 30 dias de coleta. Além disso, foram incluídos no presente estudo apenas aqueles que possuíam plaquetas sanguíneas totais > 50.000/µL e que não manifestaram nenhum tipo de discrasia sanguínea.

Método de Obtenção de PRP

Primeiro, com uma seringa de 20 mL, aspiramos 1 mL do frasco contendo o anticoagulante citrato ácido dextrose (ACD). Em seguida, após a antissepsia da região antecubital com algodão encharcado de álcool, foi realizada punção venosa de 14 mL de sangue de cada voluntário com a seringa de 20 mL, agitando suavemente para unir o anticoagulante ao sangue ( Fig. 1A ). Uma amostra de 3 mL foi separada em um tubo estéril para determinar a contagem inicial de plaquetas. A seringa de 20 mL foi utilizada no processo de centrifugação dupla para obter o PRP em uma centrífuga de laboratório com um molde que permitiu sua fácil adaptação ( Fig. 1B ). As seringas de 20 mL foram levadas para uma centrífuga e, com a tampa fechada, submetidas a 1,100 revoluções por minuto (224 G) por 15 minutos, dando origem a 3 colunas devido a diferenças na densidade dos componentes sanguíneos: a inferior, vermelha, com hemácias; e a superior, amarela, com plasma e plaquetas. Entre essas duas colunas está uma faixa estreita esbranquiçada, conhecida como "buffy coat", que tem glóbulos brancos e plaquetas concentradas ( Fig. 1C ). Dos 15 mL contidos na seringa de 20 mL, 8 mL foram removidos acima da zona de neblina e 1 mL abaixo dela, totalizando 9 mL. Estes 9 mL foram submetidos a uma nova centrifugação de 1.550 revoluções por minuto (rpm) (444 G) por 10 minutos, dando origem a duas colunas: a superior, formada por plasma pobre em plaquetas (PPP); e a inferior, pelo botão eritrócito-plaquetário ( Fig. 1D ). O volume de 6 mL que corresponderia ao PPP foi aspirado com uma seringa de 10 mL, descartando-a, deixando 3 mL ao lado do botão eritrócito-plaquetário. Este material foi lentamente agitado para permitir a ressuspensão plaquetária, resultando em PRP. Após este método para obtenção de PRP, os 3 mL foram transferidos para um tubo estéril e a contagem de plaquetas foi realizada em um dispositivo automático.

Fig. 1

Imagens da preparação do plasma rico em plaquetas (PRP). ( A ) Posicionamento da venipuntura. ( B ) Centrífuga adaptada utilizada para obter o PRP. ( C ) Amostra de sangue após primeira centrifugação. ( D ) Amostra de sangue após segunda centrifugação.

Análise Estatística

A análise dos dados foi realizada utilizando-se o teste t de Student para variáveis dicotômicas e o coeficiente de correlação de Pearson para categorias, com nível de significância de 5% ( p  < 0,05). O software utilizado foi o IBM SPSS Statistics for Windows, versão 25.0 (IBM Corp., Armonk, NY, EUA).

Resultados

O perfil sociodemográfico dos voluntários é mostrado a seguir ( Tabela 1 ).

Tabela 1

Dados dos voluntários

	Feminino	Masculino
Sexo	8	2
Idade média	29,30
Índice de massa corporal médio	25,7783

Contagem de plaquetas após aplicação do protocolo

Nas amostras de sangue dos 10 voluntários, a quantidade inicial de plaquetas estava dentro dos parâmetros normais (200.000–385.000 plaquetas/µL). Após a centrifugação dupla dos 14 mL de amostras de sangue, obtivemos um valor médio de 694.200 plaquetas/µL (desvio padrão [DP] = 57.019 plaquetas/µL). A contagem de plaquetas obtida inicialmente e posteriormente à aplicação do protocolo de concentração de plaquetas usando este novo dispositivo se encontra na Tabela 2 .

Tabela 2

Resultados da contagem inicial de plaquetas e após aplicação do protocolo de obtenção do PRP

Voluntário	Contagem inicial de plaquetas (x10 3 plaquetas/µL)	Contagem de plaquetas no PRP (x10 3 plaquetas/ µL)	Aumento na contagem de plaquetas (x10 3 plaquetas/ µL)
1	291	595	304
2	224	623	399
3	291	849	558
4	222	549	327
5	266	760	494
6	200	507	307
7	318	673	355
8	385	829	444
9	339	717	378
10	283	840	557
Média	281,9	694,2	412,3

Abreviação: PRP, plasma rico em plaquetas.

Este protocolo de centrifugação dupla levou a um aumento na contagem de plaquetas de pelo menos 2 vezes em relação ao valor inicial de plaquetas na amostra de sangue. Os valores médios das plaquetas antes e depois da aplicação do nosso protocolo para obtenção de PRP são mostrados na Figura 2 .

Fig. 2

Resultado após aplicação do protocolo de obtenção de plasma rico em plaquetas (PRP), promovendo um aumento na contagem média de plaquetas de pelo menos o dobro do valor inicial.

Contagem de outras células após a aplicação do protocolo

Ao analisar os valores de hemoglobina (HB), hematócrito (HCT), leucócitos (LEUCO) e neutrófilos (NEUTRO), observou-se uma redução de 25,12% no valor do HB e de 24,1% no valor de HCT. Em relação ao LEUCO e NEUTRO, houve aumento de 104,98% e de 72,58%, respectivamente.

Algumas correlações

Houve correlação entre a quantidade final de plaquetas e a quantidade de hemoglobina basal ( p  = 0,023). Além disso, o aumento percentual das plaquetas tem maior média entre os homens (169,5%), e não houve correlação significativa em relação à idade, peso ou índice de massa corporal (IMC).

Preservação de plaquetas e tempo para obtenção de PRP

O volume de ACD usado na conservação de plaquetas foi de 1 mL. A obtenção do PRP, desde a fase inicial com aspiração anticoagulante à obtenção de PRP, durou de 35 a 40 minutos.

Discussão

Na literatura, as aplicações clínicas do PRP são diversas; envolvem lesões cutâneas, ósseas, dentárias, oftalmológicas, lesões nervosas, queimaduras, cirurgias vasculares e estéticas, além de lesões tendinosas, musculares e de cartilagens. Os resultados encontrados foram otimistas e promissores na maioria dos estudos. No entanto, é difícil escolher o método a ser utilizado devido a inúmeras alternativas de protocolos para obtenção de PRP e a padronização ausente entre eles, o que pode justificar a falta de eficácia observada por alguns autores. 15 Os métodos descritos para a obtenção de PRP podem ser divididos em dois grupos: centrifugação e aférese. Um estudo de Malavolta et al. 16 analisou o uso de PRP obtido através de aférese no reparo artroscópico de rompimento completo do manguito rotador, mostrando que está associado a uma melhora funcional significativa e sem rompimento completo. Por este método, ∼ 400 mL de sangue foram drenados em um dispositivo de separação sob centrifugação contínua a 5.800 rpm por 15 minutos, através de um acesso periférico. Após a separação dos elementos sanguíneos por densidade, um analisador ótico determinou a camada plaquetária pela característica de sua refração e a separou em um saco de coleta estéril, obtendo cerca de 30 mL de PRP; os outros componentes sanguíneos foram devolvidos através do mesmo acesso venoso. A aférese, embora possa gerar maiores concentrações de plaquetas em comparação com a centrifugação, não é um método prático e menos caro como a centrifugação. Assim, utilizando a centrifugação, o presente estudo apresenta um método menos oneroso e altamente prático para a preparação do PRP, juntamente com um protocolo que visa garantir uma eficácia mínima do produto final. O sangue puncionado para formulação do PRP foi adicionado à seringa contendo o ACD, que tem maior capacidade de concentração de plaquetas quando comparado a outros anticoagulantes, como citrato de sódio (SC). 17 O uso de anticoagulantes é importante pois, ao se ligarem ao cálcio, impedem o início da cascata de coagulação, impossibilitando a transformação de protrombina em trombina. É importante ressaltar que o uso de um anticoagulante não é de fato obrigatório na criação do PRP; no entanto, em sua ausência, a cascata de coagulação começará em torno de 30 segundos a vários minutos. 3 A escolha do ACD no presente estudo visa preservar plaquetas, evitando mudanças em sua estrutura e funcionalidade.

A contagem inicial de plaquetas foi pelo menos 2 vezes menor do que a presente após a preparação do PRP. As conclusões do presente trabalho estão em consonância com as apresentadas por Nagata et al., 18 nas quais a quantidade final de plaquetas no PRP foi substancialmente maior do que a contagem de plaquetas da amostra de sangue inicial. Além disso, Franco 19 também obteve valores semelhantes ao avaliar a eficácia do PRP após artroplastia total do joelho. Um volume de 20 mL de sangue periférico foi coletado e centrifugado a 1.200 rpm durante 10 minutos. O plasma (a camada mais superficial) foi transferido para outro tubo estéril de 10 mL e centrifugado na mesma rotação durante 5 minutos. Ao final, metade da camada de plasma superior obtida foi descartada, deixando um concentrado de plaquetas com duas a quatro vezes o valor do plasma. O estudo apontou que, embora o PRP não tenha sido eficaz na redução do sangramento ou na melhora da função do joelho após a artroplastia, houve uma melhor resposta na avaliação da dor após 24 e 48 horas, 1 e 3 semanas e 2 meses após a operação ( p  < 0,05). Em relação ao método de centrifugação, pode ser centrifugação única ou dupla. O presente estudo optou pelo protocolo de centrifugação dupla, recomendado por Landesberg et al. 20 e Garcez et al., 21 tendo se mostrado eficaz, com aumento de ao menos 100% no número de plaquetas. Também houve aumento na quantidade de plaquetas próximo a 200%, possibilitando a obtenção de resultados ainda mais favoráveis. Além disso, a centrifugação dupla mostrou-se superior em estudo comparando ambos os métodos. Um volume de 8,5 mL de sangue foi submetido a 1.300 rpm por 10 minutos e, para uma segunda centrifugação, 2.000 rpm por 10 minutos. Na centrifugação única, o volume foi de 3,5 mL, com parâmetros de 1.500 rpm por 7 minutos. Ao final, houve um aumento de 336% no número de plaquetas com a centrifugação dupla e de 227% com a única. 22 O PRP é mais difícil e caro quando obtido por métodos automatizados que requerem kits exclusivos, os quais necessitam de quantidades maiores de sangue, a fim de obter uma concentração de plaquetas adequada e grandes volumes de PRP. 23 24

Após inúmeros estudos em busca do método de coleta mais adequado vinculado ao de menor custo, como os de Weibrich et al. 25 e de Vendramin et al. 23 , que originaram protocolos para o preparo de PRP usando centrífugas de laboratório, o presente estudo foi realizado para desenvolver um novo dispositivo para a obtenção de PRP, cujo método é simples, rápido e de baixo custo. Embora um protocolo de centrifugação ainda não tenha sido produzido, alguns estudos sugerem uma centrifugação única, enquanto outros indicam centrifugação dupla. 20 26 27 28 Como não há consenso quanto ao número de centrifugações (única ou dupla) e a velocidade de rotação e tempo estabelecido, este protocolo padronizou a centrifugação dupla para obter PRP, garantindo o dobro da contagem inicial de plaquetas no sangue periférico. Uma velocidade de 1.100 rpm foi usada durante 15 minutos na primeira centrifugação, e 1.550 rpm durante 10 minutos na segunda. A escolha da centrifugação dupla deveu-se à sua aplicabilidade em estudos com resultados promissores, como o uso de PRP adjuvante para o tratamento da pseudoartrose tibial. Por meio de punção de acesso periférico, 55 mL de sangue foram coletados e passaram por uma primeira centrifugação de 3.650 rpm por 12 minutos, descartando a camada de eritrócitos, sendo o restante submetido a uma segunda centrifugação de 3.000 rpm, onde dois terços superiores do PPP foram descartados e o resto foi misturado com concentrado trombótico, produzindo PRP. Neste estudo, o uso de PRP levou a um menor tempo de consolidação (7 meses) em comparação aos 13 meses em pacientes que não o utilizaram ( p  > 0,01). 29 Um estudo realizado por Denieli 30 também reforça a escolha pela centrifugação dupla, no qual foi avaliado o efeito da aplicação cirúrgica de PRP em lesões condrais do joelho. Um total de 20 mL de sangue foi puncionado em veia periféricae centrifugado a 1.200 rpm por 10 minutos. A camada mais superficial (plasma) foi utilizada, descartando a “buffy coat” e as hemácias, na segunda centrifugação por 5 minutos na mesma velocidade. Após a segunda centrifugação, a metade inferior (PRP) foi utilizada para aplicação, observando resultados melhores e mais rápidos da funcionalidade em comparação com aqueles que não utilizaram o PRP. Esses resultados já aparecem 3 meses após a cirurgia e duram até 12 meses.

O presente trabalho obteve um aumento na contagem inicial de plaquetas entre 104,47% e 196,82% por meio do protocolo de centrifugação dupla e da aplicação das velocidades mencionadas. Embora alguns autores afirmem que o número de plaquetas contidas no PRP deve ser > 1.000.000 plaquetas/µL, outros afirmam que é possível obter um efeito terapêutico com um valor mínimo de 300.000 plaquetas/μL. 31 No presente trabalho, foi alcançada uma contagem final de plaquetas no PRP entre 507.000 e 849.000 plaquetas/µL, semelhante à literatura. 32 O tempo de preparação para o PRP no presente estudo, desde a coleta do anticoagulante antes da venipuntura até a obtenção, foi de 35 a 40 minutos. O tempo é um fator crucial quando se considera o uso de PRP em procedimentos cirúrgicos. Quanto à duração para obtenção do PRP, o presente estudo mostrou semelhanças com os de Garcez et al. 33 e Morato et al., 34 que observaram uma variação de 30 a 50 minutos neste tempo.

Vários dispositivos para preparação de PRP estão disponíveis comercialmente, os quais operam a partir de um pequeno volume sanguíneo coletado (20–60 mL) e usam o protocolo de centrifugação única ou dupla. Variando o método e o tempo de centrifugação para a preparação do PRP, esses sistemas diferem em relação ao seu potencial de concentração de plaquetas. Como efeito, há variação na quantidade de plaquetas presentes no PRP. Assim, torna-se complexo avaliar qual kit seria o melhor para a obtenção do PRP. 35 PRGF (BTI Biotechnology Institute, Porto, Portugal), Harvest SmartPReP (Harvest Technologies Corporation, Viena, Áustria), Vivostat (Vivostat A/S, Copenhague, Dinamarca) e Regen (Regenlab, Lausanne, Suíça) são alguns dos sistemas automatizados comercializados para preparação de PRP; no entanto, são caros e difíceis de manusear, o que pode levar à esterilidade comprometida por um operador inexperiente ou a uma qualidade inconstante.

Conclusões

As conclusões apresentadas no presente estudo indicam que a obtenção do PRP pelo dispositivo apresentado, seguindo o protocolo de centrifugação, é de excelente aplicabilidade em centros específicos que atuam na produção de PRP, além de ser uma forma fácil e econômica de prepará-lo. Usando o método de centrifugação dupla, obtivemos um aumento significativo na contagem de plaquetas no PRP em comparação a quantidade inicial de plaquetas no sangue periférico. Além disso, a obtenção do PRP leva aproximadamente 35 a 40 minutos, o que pode ser considerado um tempo aceitável e rápido.