Histomorphometry of Bone Microarchitecture in Rats Treated with Vitamin D and Bisphosphonate in the Management of Osteoporosis.

Objective  To verify how the combined administration of alendronate (ALN) and vitamin D3 (VD) acts on the bone microarchitecture in rats with glucocorticoid-induced osteoporosis. Methods  The experiment used 32 90-day-old female Wistar rats weighing between 300 and 400g. The induction of osteoporosis consisted of intramuscular administration of dexamethasone at a dose of 7.5 mg/kg of body weight once a week for 5 weeks, except for the animals in the control group. The animals were separated into the following groups: G1 (control group without osteoporosis), G2 (control group with osteoporosis without treatment), G3 (group with osteoporosis treated with ALN 0.2 mg/kg), G4 (group with osteoporosis treated with VD 10,000UI/500μL), and G5 (group with osteoporosis treated with ALN + VD). The right femurs of the rats were fixed in 10% buffered formaldehyde, decalcified, and processed for inclusion in paraffin. Histological sections were stained with hematoxylin-eosin for histomorphometric analysis. Cortical thickness and medullary cavity were measured in cross-sections. Results  There was a statistical difference ( p  < 0.05) between groups G3 and G5 compared with the positive control group (G2), both related to the measurement of cortical thickness and to the total diameter of the bone. In the evaluation of the spinal area, only the G3 group has shown to be statistically different from the G2 group. Conclusion  Concomitant treatment with daily ALN and weekly VD is effective in preventing glucocorticoid-induced bone loss. However, there was no difference between the therapy tested and treatment with ALN alone. Sociedade Brasileira de Ortopedia e Traumatologia. This is an open access article published by Thieme under the terms of the Creative Commons Attribution-NonDerivative-NonCommercial License, permitting copying and reproduction so long as the original work is given appropriate credit. Contents may not be used for commecial purposes, or adapted, remixed, transformed or built upon. ( https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/ ).

Introduction

Osteoporosis is a disease marked by loss of mineralized bone mass, making it fragile and vulnerable to fractures. Anatomically, there is a decrease in cortical thickness and porosity, a reduction in the number and size of spongy bone trabeculae, and an enlargement of the medullary spaces. 1 2 Currently, the world is experiencing an expansion of the incidence of osteoporosis in both genders, especially in women > 50 years old, as a result of the continuous aging of the population. 3

Worldwide, osteoporosis is a disease that affects > 200 million people. Even though it is a disease that can affect both genders, postmenopausal women are the main risk group, with an estimated prevalence of 30% in Western countries. 4 For the year 2050, it is estimated that 70% of the hip fractures that will occur in Africa, Asia, and Latin America will be related to osteoporosis; therefore, osteoporosis of great clinical importance. 5

Several effective therapies are competent to produce an attenuation in the risk of fractures, especially in postmenopausal women. Nitrogen bisphosphonates (BFs) are the most recommended class of drugs for the treatment of postmenopausal osteoporosis. They act by inhibiting bone resorption with few side effects. 1 Among the most used BFs, sodium alendronate (ALN) stands out. 1 6

Vitamin D (VD) is a steroid hormone that has varied biological actions in different target tissues. 7 There is already significant evidence that low serum calcium and VD levels accelerate bone loss. 8

The biomechanical competence of bone is related not only to the amount of bone present, but also to its microstructure. 9 Thus, bone histomorphometry is one of the conventional methods to analyze its microarchitecture, which allows, in a safe way, to qualify and quantify bone structures. 10 Thus, it plays a prominent role in the study of certain metabolic disorders and their treatments.

Thus, the aim of the present study was to verify how the combined administration of ALN and VD acts on bone microarchitecture in the treatment groups of Wistar rats with glucocorticoid-induced osteoporosis.

Materials and Methods

All procedures were approved by the Ethics Committee on the Use of Animals (CEUA) of the Universidade Federal de Pernambuco (UFPE, in the Portuguese acronym), Recife, state of Pernambuco, Brazil (Protocol No. 034/2020).

Experimental procedure

An experimental, double-blind animal study (evaluator and pathologist) was carried out. In the present work, 32 female Wistar rats (Rattus norvegicus albinus) between 8 and 10 weeks old and weighing between 300 and 400g from the Physiology Bioterium of the UFPE were used.

The animals were housed in individual polypropylene cages with metal lids, kept in rooms with a controlled ambient temperature of 22°C, with luminosity of 60 lux, kept in a light/dark cycle of 12 hours controlled by time sensor, on a shaving bed, fed with feed for rats and water ad libitum .

After a period of 60 days, the animals were randomly divided into 5 groups, as shown in Table 1. Groups G2, G3, G4, and G5 had osteoporosis induced with the use of intramuscular dexamethasone, while the animals of group G1 were kept without induction of osteoporosis to establish the parameter of the negative control group.

Table 1

Groups used for the tests of the present study

Group	Number of animals	Group description	Induction of osteoporosis
G1	6	Distilled water orally	No
G2	6	Distilled water orally	Yes
G3	7	Oral sodium alendronate	Yes
G4	7	Vitamin D 3 orally	Yes
G5	6	Sodium alendronate and Vitamin D 3 orally	Yes

The process of induction of osteoporosis was performed with the administration of glucocorticoid dexamethasone intramuscularly at a weekly dose of 7.5 mg/kg of body weight for 5 weeks. At the end of the 5 th week of the administration of dexamethasone, the animals were submitted to pharmacotherapeutic treatment.

The daily volume of therapeutic drugs administered to all groups was 0.03mL of vehicle. Sodium alendronate administration alone occurred at a dosage of 0.2mg/kg daily for 45 days. Vitamin D 3 was administered at a dose of 500 μL (10,000IU/500μL) once a week during the 8-week supplementation period. The same period and dosage were used for weekly administration in the combination of the two drugs. The control group animals received distilled water for the same period and in the same amount as the experimental groups. The medications were administered orally (gavage method) by appropriate cannulas.

Histomorphometry

After completing the therapeutic regimen, the rats were euthanized with anesthetic deepening based on xylasin hydrochloride at 2% associated with ketamine hydrochloride 10% for removal of the right and left femurs using a scalpel blade no. 11 and 15 to perform histological analyses, which were stored in 10% formaldehyde in properly labeled containers, according to the sample group of each animal.

After collection of femoral bones, 64 specimens were obtained, fixed in 10% formaldehyde, and kept for a period of 48 hours, necessary for fixation, until the moment of preparation. The 64 specimens were divided as follows: the right femurs were submitted to histological evaluation, while the left femurs were macroscopically evaluated. The preparation followed the routine patterns for histological study in all right femurs. After the fixation period, the 32 femurs were decalcified with a solution of nitric acid (HNO 3 ) at 5%, changed daily, for 5 days.

After decalcification, the samples were washed in distilled water and placed in the histotechnical processor Leica and subsequent inclusion in paraffin Paraplast. With the aid of a microtome (Hestion), all blocks containing the femoral fragments were sectioned longitudinally at a thickness of 4 μm and placed on slides previously greased with Mayer albumin and kept in a regulated oven at 37°C for 24 hours for drying and gluing.

Subsequently, they were cordoned by hematoxylin and eosin (H&E) according to the methodology of Junqueira et al. 11 The samples were then analyzed under a light microscope and the sections were photographed in a Nikon 50E Trinocular Biological Microscope with VT 480 videomicroscopy and image analyzer. All stages of the histological procedure were performed at the Graduate Laboratory in Translational Health of the UFPE.

For the study of the compact bone, cross-sections of the diaphysis of the right femur of each animal were used. In these sections, cortical bone thickness was analyzed by acquiring images of the medial part of the diaphysis. Four measurements were made in each histological section, prioritizing the upper, lower, and lateral regions of each section. 12 To determine the thickness, cortical bone was measured from the periosteal surface to the endosteal surface using the properly calibrated IMAGE-Pro Plus program ( Figure 1A ). From this, the mean cortical thickness for each bone was calculated.

Fig. 1

( A ) Measurement of cortical thickness (μm) in femur under final increase of 40X. ( B ) Automatic measurement of the delineated medullary area (μm 2 ).

In the measurement of the area of the medullary cavity of the bones, the automatic measurement performed by the image analysis system IMAGE-Pro Plus, previously calibrated ( Figure 1B ), and with the functions determined by a specific macro, was used.

For the calculation of bone diameter, the methodology developed by Parfitt et al. was used. 13 In this evaluation, the bone is approximated to a cylinder. Thus, with the measurement of the medullary area, it is possible to calculate the medullary diameter so that, together with the cortical thickness value, it is possible to arrive at the estimate of the bone diameter ( Figure 2 ).

Fig. 2

Histomorphometry of the bone diameter of the femoral diasis of the rats. Average ± standard deviation. Presence of statistically significant difference ( p  < 0.05) between pairs marked with the same superscript symbol.

Statistical analysis

All statistical analyses were performed with the Minitab software, version 19. The data were reported as mean with standard deviation (SD). The variables were also tested for their normality through the Shapiro-Wilk test, obtaining a parametric distribution. For the analysis of the results, the one-way analysis of variance (ANOVA) test was used, followed by the Bonferroni post-test. Statistical significance was defined for a p-value < 0.05. All p-values shown are two-tailed.

Results

In all analyses performed ( Figures 3 , 4 and 5 ), a statistically significant difference was found ( p  < 0.05; one-way ANOVA test) between the tested groups. Analyzing Figure 2 the femoral diaphysis of the rats, a significantly higher value can be observed in the cortical thickness (μm) of groups G1 (648.22 ± 77.51), G3 (643.15 ± 59.03), and G5 (654.57 ± 79.00) compared with that of group G2 (515.53 ± 76.38).

Fig. 3

Cross-sectional representation of femoral diameter for bone diameter calculation. Adapted from Parfitt et al. 13 .

Fig. 4

Histomorphometry of cortical thickness of the femoral diasis of the rats. Average ± standard deviation. Presence of statistically significant difference ( p  < 0.05) between pairs marked with the same superscript symbol.

Fig. 5

Histomorphometry of the area of the medullary cavity of the femoral diasis of the rats. Average ± standard deviation. Presence of statistically significant difference ( p  < 0.05) between pairs marked with the same superscript symbol.

In the measurement of the medullary area (μm 2 ) ( Figure 4 ), the group that underwent monotherapy with ALN (G3) (365.18 ± 49.99) was statistically different only when compared with group G2 (484.02 ± 46.36), which presented the lowest value.

Regarding the analysis of the femoral diameter of the rats ( Figure 5 ), a significantly higher value was observed in groups G1 (1309.54 ± 154.89), G3 (1298.4) 5 ± 117.65), and G5 (654.57 ± 79.00) compared with the group with osteoporosis and without treatment (G2) (1321.97 ± 158.40).

Discussion

Within the spectrum of pharmacological treatments of osteoporosis, therapeutic agents can be divided into two major classes: antiresorptive compounds and bone formation stimulants. 14 The former reduce osteoclastic activity, which forms gaps in the surface of the bones, allowing them to be filled by a new matrix before the remodeling cycle restarts. The second compounds, also called anabolic agents, intensify the action of osteoblasts, which, in each remodeling cycle, increases the deposition of osteoid matrix. 14 15

Among the drugs with antiresorptive action, we can mention BFs, calcitonin, estrogens, and selective modulators of estrogen receptors. Fluoride, parathyroid hormone, and teriparatide are examples of anabolic agents. 15

Bisphosphonates form a class of chemicals that act as inhibitors of bone resorption. 16 Sodium alendronate is a powerful second-generation BF, which initially fixates on the bone matrix and is later assimilated by osteoclasts to, then, inhibit its action. It inhibits farnesyl diphosphate synthesis by blocking the signaling pathway of mevalonate in osteoclasts, also inhibiting the activation factors thereof, such as receptor activator of nuclear factor kappa-Β ligand (RANKL), which is the main mediator of osteoclastic differentiation, activation, and proliferation. 17 However, there are concerns regarding adverse effects related to chronic use of BFs, such as musculoskeletal pain, atypical fracture of the femur, osteonecrosis of the jaw, and severe suppression of bone remodeling. 18

Vitamin D plays a crucial role in a multitude of physiological functions, such as in modulating calcium homeostasis and skeletal phosphate; it exerts a significant influence on the growth and differentiation of various tissues; it has immunomodulatory functions; and it also acts on bone mineralization, muscle functions, and balance. 19 20

Vitamin D deficiency is common in patients with osteoporosis and hip fractures. Inadequate VD levels are considered one of the potential factors for failure of drug treatment of osteoporosis (significant loss of bone mineral density and fractures). 16

1.25 dihydroxycholecalciferol, or calcitriol, is the active metabolite of VD and is responsible for regulating the expression of genes encoding several proteins, including calcium and bone matrix transporters. In addition, VD modulates genes involved in the protein cycle that decrease proliferation and increase cell differentiation, such as osteoclastic precursors. This property may explain the action of VD on bone resorption, on intestinal calcium transport, and on the skin. 21 22

According to Ferreira Junior et al., 23 the histomorphometric study of bone is an extremely valuable method for the dynamic evaluation of the bone remodeling process and to determine the extent of bone loss and of bone tissue formation, being able to identify osteometabolic changes such as osteoporosis.

Dexamethasone-induced osteoporosis is characterized by two phases: a rapid phase in which bone mineral density (BMD) is reduced, probably due to excessive bone resorption, via osteoclasts, and a late, progressive, phase in which BMD decreases due to impairment in bone formation. 24 Analyzing the results obtained for positive control for osteoporosis (G2), it is possible to verify that the osteoporotic induction process was successful, since, when compared with the negative control (G1; without osteoporosis), there was a reduction in cortical thickness and an increase in medullary spaces, both measurements with a statistically significant difference in relation to the negative control group (G1). These characteristics, along with other measurements not explored in the present study, are marks of osteoporosis. 25

The results of the present study also demonstrated that, when analyzing bone cortical thickness, both ALN monotherapy and combination therapy with ALN + VD were able to preserve bone structure. However, there was no difference when commencing these therapeutic regimens. Isolated VD therapy has not been shown to be statistically capable of preserving bone mass in osteoporotic states. This same evaluation can be applied to bone diameter analysis.

Regarding the other histomorphometric measurement evaluated, the area of the medullary cavity, it was observed that only therapy with ALN was able to demonstrate an important effect on the preservation of bone mass. Thus, there was less effect on trabecular bones when neither the combination therapy focused on this study nor the isolated treatment with VD was used. This result differs from others found in the literature, which demonstrated that VD alone was able to significantly increase bone mass in rats. 26 27 28 However, it is noteworthy that, although there was no statistical difference in the paired evaluation, in all global analyses of the three variables (cortical thickness, medullary area, and bone diameter), the p -values were statistically significant.

Conclusion

Together, the data presented in the present study demonstrate that concomitant treatment with daily ALN and weekly VD is effective in the prevention of glucocorticoid-induced bone loss. However, there was no difference between the therapy tested and treatment only with ALN. Since prolonged use of BFs, such as ALN, can cause serious adverse effects, its association with VD may be clinically a good choice to replace ALN, since histomorphometric analyses showed similarities in bone mass preservation results and VD, due to its properties, may possibly avoid and/or minimize these problems associated with ALN therapy.

Introdução

A osteoporose é uma doença marcada pela perda de massa óssea mineralizada, tornando-a frágil e vulnerável a fraturas. Anatomicamente, há diminuição da espessura e da porosidade da cortical, redução do número e do tamanho das trabéculas do osso esponjoso e alargamento dos espaços medulares. 1 2 No momento atual, o mundo vivencia uma expansão da incidência de osteoporose em ambos os sexos, sobretudo em mulheres > 50 anos, sendo isto resultado do contínuo envelhecimento da população. 3

Mundialmente, a osteoporose é uma enfermidade que atinge > 200 milhões de pessoas. Mesmo sendo uma doença que pode afetar ambos os sexos, as mulheres que se encontram na pós-menopausa são o principal grupo de risco, com uma prevalência estimada em 30% nos países ocidentais. 4 Para o ano de 2050, estima-se a probabilidade de que 70% das fraturas de quadril que ocorrerão na África, na Ásia e na América Latina serão relacionadas à osteoporose. Portanto, a osteoporose é de grande importância clínica. 5

Diversas terapias eficazes são competentes em produzir uma atenuação no risco de fratura, sobretudo em mulheres na pós-menopausa. Os bisfosfonatos (BFs) nitrogenados são a classe de droga mais recomendada para o tratamento da osteoporose pós-menopausa. Eles atuam inibindo a reabsorção óssea com poucos efeitos colaterais. 1 Dentre os BFs mais comumente usados, destaca-se o alendronato de sódio (ALN). 1 6

A vitamina D (VD) é um hormônio esteroidal que tem variadas ações biológicas em diferentes tecidos alvo. 7 Já existem evidências significativas que apontam que baixos níveis séricos de cálcio e de vitamina D aceleram a perda óssea. 8

A competência biomecânica do osso está relacionada não só com a quantidade de osso presente, como também com a sua microestrutura. 9 Assim, a histomorfometria óssea é um dos métodos convencionais para analisar sua microarquitetura, o que permite, de forma segura, qualificar e quantificar as estruturas ósseas. 10 Desta forma, ela exerce um papel de destaque no que diz respeito ao estudo de determinados distúrbios metabólicos e seus tratamentos.

Sendo assim, o objetivo do presente estudo foi verificar como a administração conjunta ALN e VD age na microarquitetura óssea nos grupos de tratamento de ratas Wistar com osteoporose induzida por glicocorticoide.

Materiais e Métodos

Todos os procedimentos foram aprovados pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) da Universidade Federal de Pernambuco (UFPE) (Protocolo N° 034/2020).

Procedimento experimental

Foi realizado um estudo animal experimental duplo-cego (avaliador e o patologista). No presente trabalho, foram utilizadas 32 ratas ( Rattus norvegicus albinus ) da linhagem Wistar com idades entre 8 e 10 semanas, pesando entre 300 e 400g, fêmeas, provenientes do Biotério de Fisiologia – UFPE.

Os animais foram alojados em gaiolas individuais de polipropileno com tampas metálicas, mantidas em salas com temperatura ambiente de 22°C controlada, com luminosidade de 60 lux, mantidos em ciclo claro/escuro de 12 horas controlados por sensor de tempo, em cama de maravalha, alimentados com ração para ratas e água ad libitum .

Após um período de 60 dias, os animais foram divididos aleatoriamente em 5 grupos, como consta na Tabela 1 . Os grupos G2, G3, G4 e G5 tiveram osteoporose induzida com o uso de dexametasona intramuscular, enquanto os animais do grupo G1 foram mantidos sem indução de osteoporose para estabelecer o parâmetro do grupo controle negativo.

Tabela 1

Grupos utilizados para os testes do presente trabalho

Grupo	N° de animais	Descrição do grupo	Indução da osteoporose
G1	6	Água destilada por via oral	Não
G2	6	Água destilada por via oral	Sim
G3	7	Alendronato sódico por via oral	Sim
G4	7	Vitamina D 3 por via oral	Sim
G5	6	Alendronato sódico e vitamina D 3 por via oral	Sim

O processo de indução da osteoporose foi realizado a partir da administração do glicocorticoide dexametasona, por via intramuscular, na dose semanal de 7,5 mg/kg de peso corporal, durante 5 semanas. Ao final da 5ª semana de administração de dexametasona, os animais foram submetidos ao tratamento farmacoterapêutico.

O volume diário de drogas terapêuticas administrado a todos os grupos foi de 0,03mL de veículo. A administração do ALN de forma isolada foi efetuada na dosagem de 0,2mg/kg, diariamente, por 45 dias. A VD foi administrada na dosagem de 500 μL (10.000UI/500μL), uma vez por semana, durante o período de 8 semanas de suplementação. Os mesmos período e dosagem foram utilizados para a administração semanal na associação dos dois fármacos. Os animais dos grupos-controle receberam água destilada pelo mesmo período e na mesma quantidade que os grupos experimentais. As medicações foram administradas por via oral (método de gavagem) por meio de cânulas apropriadas.

Histomorfometria

Completado o esquema terapêutico, as ratas foram eutanasiadas com aprofundamento anestésico à base de cloridrato de xilasina a 2% associado a cloridrato de quetamina 10% para a retirada os fêmures direitos e esquerdos utilizando lâmina de bisturi n° 11 e 15 para realização das análises histológicas, sendo armazenados em formol 10% em recipientes devidamente etiquetados, segundo o grupo amostral de cada animal.

Após coleta dos ossos femorais, foram obtidos 64 espécimes, fixados em formol 10% e mantidos por um período de 48 horas, necessário para a fixação, até o momento da sua preparação. Os 64 espécimes foram divididos da seguinte maneira: os fêmures direitos foram submetidos à avaliação histológica enquanto os fêmures esquerdos foram avaliados macroscopicamente. A preparação seguiu os padrões rotineiros para o estudo histológico em todos os fêmures direitos. Após o período de fixação, os 32 fêmures foram descalcificados com uma solução de ácido nítrico (HNO 3 ) a 5%, trocado diariamente, por 5 dias.

Após a descalcificação, as amostras foram lavadas em água destilada e colocadas no processador histotécnico Leica e, posteriormente, incluídas em parafina Paraplast. Com o auxílio de um micrótomo (Hestion), todos os blocos contendo os fragmentos femorais foram seccionados longitudinalmente com 4μm de espessura, colocados em lâminas previamente untadas com albumina de Mayer e mantidos em estufa regulada à temperatura de 37°C, durante 24 horas, para secagem e colagem.

Posteriormente, foram corados com hematoxilina e eosina (H&E) segundo a metodologia de Junqueira et al. 11 As amostras foram então analisadas em microscópio de luz e os cortes fotografados em um Microscópio Biológico Trinocular Nikon 50E com videomicroscopia VT 480 e analisador de imagem IMAGELAB. Todas as etapas para o procedimento histológico foram realizadas no Laboratório de Pós-Graduação em Saúde Translacional/UFPE.

Para o estudo do osso compacto, foram utilizados cortes transversais das diáfises do fêmur direito de cada animal. Nestes cortes, a espessura do osso cortical foi analisada por meio da aquisição de imagens da parte medial das diáfises. Foram efetuadas quatro medições em cada corte histológico, priorizando as regiões superior, inferior e lateral de cada corte. 12 Para determinar a espessura, o osso cortical foi medido desde a superfície periosteal até a superfície endosteal utilizando-se o programa IMAGE-Pro Plus adequadamente calibrado ( Figura 1A ). A partir disso, a espessura média da cortical para cada osso foi calculada.

Fig. 1

( A ) Medição da espessura cortical (μm) em fêmur sob aumento final de 40X. ( B ) Medição automática da área medular delineada (μm 2 ).

Na mensuração da área da cavidade medular dos ossos, foi utilizada a medida automática realizada pelo sistema de análise de imagens IMAGE-Pro Plus previamente calibrado ( Figura 1B ) e com as funções determinadas por uma macro específica.

Para o cálculo do diâmetro ósseo, foi utilizada a metodologia desenvolvida por Parfitt et al. 13 Nesta avaliação, o osso é aproximado para um cilindro. Assim, com a medida da área medular, é possível calcular o diâmetro medular para que, junto com o valor da espessura da cortical, possa-se chegar à estimativa do diâmetro ósseo ( Figura 2 ).

Fig. 2

Histomorfometria do diâmetro ósseo das diáfises femorais das ratas. Média ± desvio padrão. Presença de diferença estatisticamente significativa ( p  < 0,05) entre os pares assinalados com o mesmo símbolo sobrescrito.

Análise estatística

Todas as análises estatísticas foram realizadas com o software Minitab versão 19. Os dados foram relatados como média com desvio padrão (DP). As variáveis também foram testadas quanto à sua normalidade por meio do teste de Shapiro-Wilk, obtendo-se uma distribuição paramétrica. Para a análise dos resultados, foi utilizado o teste de análise de variância (ANOVA, na sigla em inglês) one-way, seguido do pós-teste de Bonferroni. A significância estatística foi definida para um valor de p  < 0,05. Todos os valores de p mostrados são bicaudais.

Resultados

Em todas as análises realizadas ( Figuras 3 , 4 e 5 ), foi constatada uma diferença estatisticamente significativa ( p  < 0,05; teste ANOVA one-way) entre os grupos testados. Analisando a Figura 3 em relação às diáfises femorais das ratas, pode-se notar um valor significativamente superior na espessura cortical (µm) dos grupos G1 (648,22 ± 77,51), G3 (643,15 ± 59,03) e G5 (654,57 ± 79,00) em relação ao grupo G2 (515,53 ± 76,38).

Fig. 3

Representação de corte transversal de diáfise de fêmur para cálculo de diâmetro ósseo. Adaptado de Parfitt et al. 13 .

Fig. 4

Histomorfometria da espessura cortical das diáfises femorais das ratas. Média ± desvio padrão. Presença de diferença estatisticamente significativa ( p  < 0,05) entre os pares assinalados com o mesmo símbolo sobrescrito.

Fig. 5

Histomorfometria da área da cavidade medular das diáfises femorais das ratas. Média ± desvio padrão. Presença de diferença estatisticamente significativa ( p  < 0,05) entre os pares assinalados com o mesmo símbolo sobrescrito.

Na medição da área medular (µm 2 ) ( Figura 4 ), o grupo G3, que recebeu monoterapia com ALN (365,18 ± 49,99), se mostrou estatisticamente diferente apenas em relação ao grupo G2 (484,02 ± 46,36), que apresentou o menor valor.

Quanto à análise do diâmetro ósseo das diáfises femorais das ratas ( Figura 5 ), observa-se um valor significativamente superior nos grupos G1 (1309,54 ± 154,89), G3 (1298,45 ± 117,65) e G5 (654,57 ± 79,00) em relação ao grupo G2, com osteoporose e sem tratamento (1321,97 ± 158,40).

Discussão

Dentro do espectro de tratamentos farmacológicos da osteoporose, os agentes terapêuticos podem ser divididos em duas grandes classes: os compostos antirreabsortivos e os estimulantes da formação óssea. 14 Os primeiros reduzem a atividade osteoclástica, que forma lacunas na superfície dos ossos, permitindo um preenchimento destas por uma nova matriz antes do reinício do ciclo de remodelação. Já os segundos compostos, também chamados de agentes anabólicos, intensificam a ação dos osteoblastos, a qual, em cada ciclo de remodelação, aumenta a deposição de matriz osteoide. 14 15

Dentre os fármacos com ação antirreabsortiva, pode-se citar os BFs, a calcitonina, os estrogênios e os moduladores seletivos dos receptores de estrogênio. Os fluoretos, o paratormônio e a teriparatida são exemplos de agentes anabólicos. 15

Os BFs formam uma classe de substâncias químicas que agem como inibidores da reabsorção óssea. 16 O ALN é um BF de segunda geração potente, que inicialmente se fixa na matriz óssea e, posteriormente, é assimilado pelos osteoclastos para, em seguida, inibir sua ação. Ele inibe a farnesil difosfato sintetase, bloqueando a via de sinalização do mevalonato nos osteoclastos, inibindo também os fatores de ativação dos mesmos, tal como o ligante do receptor do ativador do fator nuclear kappa-B (em inglês, receptor activator of nuclear factor kappa-Β ligand [RANKL, na sigla em inglês), que é o mediador principal da diferenciação, da ativação e da proliferação osteoclástica. 17 Entretanto, existem preocupações em relação aos efeitos adversos relacionados ao uso crônico dos BFs, como dor musculoesquelética, fratura atípica do fêmur, osteonecrose da mandíbula e supressão severa da remodelação óssea. 18

A VD desempenha um papel crucial em uma infinidade de funções fisiológicas, como na modulação da homeostase do cálcio e do fosfato esquelético, exerce uma influência significativa no crescimento e na diferenciação de vários tecidos, possui funções imunomodulatórias e tem ação na mineralização óssea, em funções musculares e no equilíbrio. 19 20

A deficiência de VD é comum em pacientes com osteoporose e fraturas de quadril. A inadequação dos níveis de vitamina D é tida como um dos potenciais fatores para falha do tratamento medicamentoso da osteoporose (perda significativa de densidade mineral óssea e fraturas). 16

O 1,25 di-hidroxicolecalciferol ou calcitriol é o metabólito ativo da vitamina D e é responsável por regular a expressão de genes que codificam diversas proteínas, incluindo transportadores de cálcio e da matriz óssea. Além disso, a VD modula genes envolvidos no ciclo proteico que diminuem a proliferação e aumentam a diferenciação celular, como a de precursores osteoclásticos. Esta propriedade pode explicar a ação da VD na reabsorção óssea, no transporte de cálcio intestinal e na pele. 21 22

De acordo com Ferreira Junior et al., 23 o estudo histomorfométrico do osso é um método de extrema valia para a avaliação dinâmica do processo de remodelação óssea, para a determinação da extensão da perda óssea e da formação do tecido ósseo, sendo capaz de identificar mudanças osteometabólicas como a osteoporose.

A osteoporose induzida pela dexametasona é caracterizada por duas fases: uma rápida, na qual a densidade mineral óssea (DMO) é reduzida, provavelmente devido à reabsorção óssea excessiva, via osteoclastos, e uma tardia, progressiva, na qual a DMO diminui devido ao prejuízo na formação óssea. 24 Analisando os resultados obtidos para o controle positivo para osteoporose (G2), é possível constatar que o processo de indução osteoporótica foi bem sucedido, uma vez que, ao comparar com o controle negativo (G1–sem osteoporose), houve redução da espessura da cortical e aumento dos espaços medulares, ambas as medidas com diferença estatisticamente significativa em relação ao grupo controle negativo (G1). Tais características, junto com outras medidas não exploradas no presente trabalho, são marcas da osteoporose. 25

Os resultados do presente estudo também demonstraram que, ao analisar a espessura cortical óssea, tanto a monoterapia com ALN quanto a terapia combinada com ALN + VD foram capazes de preservar a estrutura óssea. No entanto, não houve diferença quando se comparou estes esquemas terapêuticos. A terapia isolada com VD não demonstrou ser estatisticamente capaz de preservar a massa óssea em estados osteoporóticos. Esta mesma avaliação pode ser aplicada à análise do diâmetro ósseo.

Em relação à outra medida histomorfométrica avaliada, a área da cavidade medular, observou-se que apenas a terapia com ALN foi capaz de demonstrar um efeito importante na preservação da massa óssea. Assim, houve menor efeito nos ossos trabeculares quando não se utilizou nem a terapia combinada foco do presente estudo, tampouco o tratamento isolado com VD. Este resultado difere de outros encontrados na literatura, os quais demonstraram que a apenas a VD foi capaz de aumentar significativamente a massa óssea em ratas. 26 27 28 No entanto, cabe ressaltar que, apesar de não ter existido diferença estatística na avaliação pareada, em todas as análises globais das três variáveis (espessura cortical, área medular e diâmetro ósseo), o valor de p mostrou-se estatisticamente significativo.

Conclusão

Em conjunto, os dados apresentados no presente estudo demonstram que o tratamento concomitante com ALN diário e VD semanal é eficaz para prevenir a perda óssea induzida por glicocorticoide. No entanto, não houve diferença entre esta terapia testada e o tratamento apenas com o ALN. Como o uso prolongado de BFs, como o ALN, pode provocar efeitos adversos graves, a associação deste com a VD pode ser clinicamente uma boa escolha para substituir o ALN, uma vez que as análises histomorfométricas mostraram semelhanças nos resultados de preservação de massa óssea e a VD, que, devido às suas propriedades, pode, possivelmente, evitar e/ou minimizar tais problemas associados à terapia com ALN.