[Double N501Y mutation hindering its detection by RT-PCR kit widely used at Clinical Microbiology laboratories].

Las nuevas tecnologías de secuenciación (NGS, del inglés Next Generation Sequencing) se han convertido en una herramienta indispensable para el estudio y control de la pandemia causada por el virus SARS-CoV-2. La secuenciación del genoma completo viral ha sido vital no solo para el desarrollo de vacunas y fármacos específicos, sino también para el descubrimiento y la monitorización de las variantes de interés que, desde la aparición de la ahora conocida como variante alpha, han ido sucediéndose y relacionándose con los recrudecimientos puntuales de la pandemia. No obstante, y pese a los esfuerzos realizados por los laboratorios de Microbiología en todo el mundo, no se dispone de la capacidad de secuenciación suficiente para caracterizar todas las muestras positivas a SARS-CoV-2 con esta tecnología. Por ello se han desarrollado diferentes estrategias para la caracterización del virus mediante RT-PCR de combinaciones conocidas de mutaciones3, 4, 5; sin embargo, no debemos olvidar las limitaciones que este tipo de estudios presentan y que pueden llevar a una asignación de variante errónea6, 7.

En la actualidad, en nuestro servicio se caracterizan todas las primeras muestras de un episodio con Cts por debajo de 32 mediante los paneles AllplexTM Variants I&II (Seegene, Corea) que estudian las mutaciones de la espícula más relevantes en las últimas variantes de interés (H69/V70-, W152C, K417N, K417T, L452R, E484K y N501Y). A partir de febrero de 2022, en un escenario totalmente dominado por la variante ómicron, aquellas muestras que presentaron las mutaciones H69/V70-, K417N y N501Y fueron clasificadas como variante ómicron mediante RT-PCR. En caso de no presentar la deleción se consideró que pertenecían a la subvariante BA.2 mediante RT-PCR.

Ante la aparición de una muestra con H69/V70- y K417N, pero sin N501Y, se optó por secuenciar esta muestra ya que estos resultados no permitían asignarla a ninguna variante mediante RT-PCR. Para ello se utilizó una adaptación del protocolo ARTIC para Oxford Nanopore mediante la ampliación del genoma completo con el esquema VarSkip. La librería resultante se procesó en un secuenciador MinION mk1c (Oxford Nanopore). Las lecturas obtenidas fueron posteriormente ensambladas mediante el pipeline de ARTIC para datos obtenidos de secuenciadores con tecnología de Oxford Nanopore y se analizaron mediante la webApp de Nextstrain comprobando su consistencia mediante el programa Integrative Genomics Viewer (IGV).

La secuencia obtenida (depositada en GISAID como EPI_ISL_10968563) pertenece al clado 21K (ómicron) y al linaje BA.1.17 y presentaba entre otras mutaciones características en la espícula las tres mutaciones empleadas por el esquema de Allplex Variants I&II: H69/V70-, K417N y N501Y; si bien, la mutación N501Y, además del cambio habitual A23063T, presentaba también T23065C. Todas las mutaciones se encontraron con suficiente cobertura. En este caso T23065C acompañando a A23063T produce una mutación silente ya que el codón que conforman sigue codificando una tirosina y mantiene la mutación N501Y.

Por lo tanto, es de esperar que esta mutación no suponga una ventaja evolutiva para el virus ni un cambio fundamental para su comportamiento. No obstante, sí que puede suponer un problema para los esquemas de caracterización que se basen en el estudio de mutaciones concretas, como el que empleamos en nuestro laboratorio en la actualidad; ya que, si este cambio se hubiese dado, por ejemplo, en una variante del linaje BA.2 en los paneles Allplex Variants I&II solo sería positiva la mutación K417N.

En resumen, creemos que este caso se trata de un ejemplo más de la enorme utilidad que presentan las NGS en los laboratorios de Microbiología Clínica en la actualidad, ya que nos permiten no solo la correcta asignación de las variantes circulantes, sino también la monitorización de la evolución de esas mismas variantes.