Antihypertensive Activity of Sauromatum guttatum Mediated by Vasorelaxation and Myocardial Depressant Effects.

BACKGROUND: Sauromatum guttatum (S. guttatum) is used in the treatment of blood disorders and reportedly has a spasmolytic activity through Ca2+ channel inhibition.
OBJECTIVES: The aim of this study was to investigate the antihypertensive potential of S. guttatum in high salt-induced hypertensive Sprague-Dawley (SD) rat model (HSHRs).
METHODS: SD rats were divided into normotensive, hypertensive, S. guttatum and verapamil treated groups. S. guttatum crude extract (Sg.Cr) (100, 150 and 300 mg/kg/day) and verapamil (5, 10 and 15 mg/kg/day) were administered orally along with NaCl. Aortic rings and right atrial strips from normotensive rats were used to investigate the underlying mechanisms. The level of statistical significance was set at 5%.
RESULTS: Mean arterial pressure decreased in the Sg.Cr and verapamil-treated hypertensive groups in a dose-dependent manner (p < 0.001). In the vascular reactivity study, acetylcholine induced relaxations with an EC50 value of 0.6 µg/mL (0.3-1.0) in Sg.Cr-treated hypertensive rats (300 mg/kg), suggesting endothelial preservation. In isolated normotensive rat aorta, Sg.Cr-treated rats showed vasorelaxation with an EC50 value of 0.15 mg/mL (0.10-0.20), ablated by endothelial denudation or pretreatment with L-NAME and atropine. Sg.Cr treatment caused relaxation against high K+-induced contractions, like verapamil. Sg.Cr showed negative inotropic (82%) and chronotropic effects (56%) in isolated rat atrial preparations reduced with atropine. The phytochemical investigation indicated presence of alkaloids, flavonoids and tannins.
CONCLUSION: S. guttatum has a vasodilatory effect through endothelial function preservation, muscarinic receptor-mediated NO release and Ca2+ movement inhibition, while atrial myocardial depressant effect can be linked to the muscarinic receptor. These findings provide pharmacological base for using S. guttatum extract as an antihypertensive medication.

Introdução

A hipertensão é um fator de risco importante para doenças cardiovasculares e mortalidade devido aos danos em órgãosalvo.[1] Existem muitos fatores ambientais que contribuem para a etiologia da hipertensão, incluindo ingestão elevada de sal. A alta ingestão de sal continua sendo o fator mais importante na etiologia da hipertensão em humanos.[2] Em ratos, a alta ingestão de sal também promove a hipertensão, fornecendo um modelo conveniente para estudar a hipertensão humana.[3] O consumo contínuo de uma dieta rica em sal leva à disfunção endotelial, o que pode representar um fator de risco particularmente significativo no desenvolvimento da hipertensão,[4] afetando negativamente a qualidade de vida.[5] As medidas para o manejo da hipertensão incluem ajuste no estilo de vida, modificação da dieta, exercícios físicos, bem como terapias convencionais e alternativas, incluindo remédios fitoterápicos.[6-8] A Sauromatum guttatum (S. guttatum) pertence à família Araceae, e é comumente conhecida como “lírio vodu” e “monarca do Oriente”. A Sauromatum guttatum é conhecida como “Sanp ki Booti” no Paquistão e na Índia, onde é onipresente. A S. guttatum é tradicionalmente utilizada para tratar inflamação, dificuldades respiratórias,[9] problemas gástricos,[10] tuberculose, doenças do sangue, picadas de cobra e infecções de pele.[11] A S. guttatum contém lectinas, dimetilsulfetos, cariofileno, indol, escatol, amônia, trimetilamina e aminas primárias.[12-14] Os cormos ou bulbos contêm carbono, magnésio, enxofre, oxigênio, fósforo, potássio e cloro. Estudos in vitro revelaram atividades mitogênica,[15] antiproliferativa,[16] herbicida,[17] inibidora da lipoxigenase,[18] antioxidante, antibacteriana,[19] espasmolítica[18,20] e inseticida da S. guttatum.[17,21] É tradicionalmente utilizada para o tratamento de doenças do sangue. Foi relatado anteriormente que seu efeito espasmolítico é mediado pelo bloqueio de entrada de Ca2+ na musculatura lisa do intestino.[20] Os bloqueadores de entrada de Ca2+ também têm papel terapêutico importante no tratamento da hipertensão. Todas essas observações fornecem uma base sólida para nossa hipótese de que o extrato de S. guttatum pode ter propriedades anti-hipertensivas. O objetivo deste estudo foi investigar o potencial anti-hipertensivo da S. guttatum e revelar os mecanismos subjacentes utilizando métodos in vivo e in vitro.

Materiais e métodos

Preparação do extrato bruto e análise fitoquímica

Cormos de S. guttatum foram adquiridos em Nathia Gali, Paquistão (junho-julho de 2018), identificados e validados pelo Dr. Abdul Nazir, Professor Assistente do Departamento de Biotecnologia, COMSATS University Islamabad, Abbottabad Campus, Paquistão. CHUA-112 é o código de voucher para o espécime no herbário do Departamento de Farmácia, COMSATS University Islamabad, Abbottabad Campus, Paquistão. Cormos frescos foram picados e submetidos à secagem na sombra em temperatura ambiente. Em seguida, o material seco foi pulverizado, mergulhado em metanol aquoso (70%) com agitação ocasional durante quinze, sete e três dias. O macerado foi filtrado em um tecido de musselina e, em seguida, com um papel filtro qualitativo (Whatman, Grau 1).[22] Esse processo foi repetido três vezes. Em seguida, um evaporador rotativo (-760 mmHg a 37°C) foi utilizado para concentrar o extrato líquido. O extrato bruto foi analisado fitoquimicamente para todos os constituintes importantes, como flavonoides, alcaloides, saponinas, fenóis e taninos.[23]

Animais

Todos os experimentos foram realizados em conformidade com as orientações da Commission on Life Sciences, Institute of Laboratory Animal Resources, National Research Council [24] e aprovadas pelo Comitê de Ética. Os ratos Sprague-Dawley (SD) foram mantidos no Biotério com comida e água disponíveis ad libitum.

Investigações farmacológicas

Medicamentos e padrões

Os medicamentos e padrões foram adquiridos das seguintes fontes: cloreto de acetilcolina, cloridrato de fenilefrina, sulfato de atropina e o pentotal sódico dos Laboratórios Abbott, Paquistão; o cloridrato de isoprenalina, cloreto de potássio, cloridrato de éster metílico de Nω-Nitro-L-arginina (L-NAME) e cloridrato de verapamil da empresa Sigma Chemicals, EUA.

Estudos in vivo

Modelo e grupos de ratos com hipertensão induzida por dieta com alto teor de sal (HIDATS)

Ratos SD (200-250 g) (n = 60) foram divididos aleatoriamente em oito grupos (n = 5-7 em cada grupo). A amostragem foi feita por conveniência. O Grupo 1 (grupo controle normal) recebeu dieta normal. O Grupo 2 (grupo de hipertensos) recebeu NaCl (8% na dieta + 1% na água de beber) por 8 semanas. Os grupos 3-5 (grupo tratado com S. guttatum) receberam Na Cl (8% na dieta + 1% na água potável) e diferentes doses orais de extrato bruto de S. guttatum (100 mg/kg/dia, 150 mg/kg/dia e 300 mg/kg/dia) uma vez por dia durante 8 semanas. Os grupos 6 a 8 (grupo com tratamento padrão) receberam por via oral doses diárias de verapamil (5 mg/kg/dia, 10 mg/kg e 15 mg/kg/dia) junto com dieta de NaCl contendo 8% NaCl + 1% NaCl na água de beber por 8 semanas.[25-27]

Registro invasivo de pressão arterial em ratos com HIDATS

A intubação traqueal de ratos SD anestesiados (pentotal, 40–100 mg/kg, IP) foi realizada com tubo de polietileno (PE-20). Para monitorar a pressão arterial, a artéria carótida direita foi canulada com tubo de polietileno (PE-50) e afixada no PowerLab Data Acquisition System (ADInstrument, Austrália), através de um transdutor de pressão (MLT 0699). Uma lâmpada suspensa foi utilizada para manter a temperatura corporal do animal. A pressão arterial média foi monitorada por 30 minutos em cada grupo.[25,28]

Perfil de peso corporal

O peso corporal de todos os grupos foi determinado no início do experimento e posteriormente monitorado semanalmente. Após 8 semanas de tratamento, a mudança no peso corporal foi calculada.

Estudos in vitro

Estudos de reatividade vascular

Para investigar o efeito da preservação do endotélio induzido pelo extrato bruto em ratos com HIDATS, isolamos a aorta dos grupos normotenso, hipertenso e tratados. Os anéis aórticos foram suspensos em banhos teciduais (10 mL), contendo carbogênio (5% CO2 e 95% O2) solução de Krebs normal aerada, composta por NaCl, 118,2 mM; KCl, 4,7 mM; MgSO4, 1,2 mM; KH2PO4, 1,3 mM; NaHCO3, 25,0 mM; Glicose, 11,7 mM; CaCl2, 2,5 mM, mantido a 37ºC. A força foi monitorada pelo PowerLab Data Acquisition System (ADInstrument, Austrália) e um amplificador em ponte (N12128) através de um transdutor de deslocamento de força (MLT 0201). Os anéis aórticos foram estabilizados em tensão isométrica a 2 g por 60-90 minutos, com troca da solução de Krebs a cada 15 minutos. Para determinar a integridade do endotélio, diferentes concentrações de acetilcolina foram utilizadas em anéis aórticos pré-constritos com fenilefrina (1 µM).[25,28]

Preparações isoladas de aorta de rato SD

Os anéis aórticos foram suspensos em banhos teciduais contendo 10 mL de carbogênio (5% CO2 e 95% O2) e solução de Krebs normal aerada mantida a 37°C, fixada no PowerLab Data Acquisition System (ADInstrument, Austrália) e um amplificador em ponte (N12128) através de um transdutor de deslocamento de força (MLT 0201). Os anéis foram equilibrados por 60-90 minutos a uma tensão isométrica de 2 g, enquanto a solução foi trocada a cada 15 minutos. Diferentes concentrações (0,1–10 mg/mL) de S. guttatum foram adicionadas aos anéis pré-constritos com fenilefrina (FE). Para determinar o mecanismo subjacente, os anéis aórticos foram pré-tratados com atropina 1 µM ou L-NAME 10 µM por 30 minutos. Em alguns experimentos, anéis desnudados de endotélio de ratos normotensos foram utilizados.[25,28,29]

Preparações isoladas do átrio direito

Os átrios direitos de ratos SD normotensos foram dissecados. As preparações atriais foram suspensas em banhos teciduais contendo 10 mL de solução aerada de Krebs, mantida a 32°C, ligada ao PowerLab (ML 846) Data Acquisition System (ADInstrument, Austrália) e amplificador em ponte (N12128), através de um transdutor de força (MLT 0201). Os tecidos foram estabilizados em uma tensão de repouso de 1 g por 30 minutos. O envolvimento do receptor muscarínico foi estudado em preparações atriais pré-tratadas com atropina (1 µM).[25,28]

Análise estatística

Os dados tinham distribuição normal, como determinado pelo teste de normalidade de Shapiro-Wilk. Os dados foram expressos como média ± desvio padrão (DP) e as medianas das concentrações efetivas (valores de CE50) com intervalo de confiança (IC) de 95%. A porcentagem de mudança nos perfis de pressão arterial média (PAM) ou peso corporal foram calculados por análise de variância (ANOVA) de uma via (seguida por teste post-hoc de Tukey HSD). A porcentagem de vasorrelaxamento em ratos normotensos e hipertensos foi calculada por ANOVA de duas vias (seguida pelo teste post-hoc de Bonferroni) utilizando o software SPSS 21 (EUA). O nível de significância estatística aceito foi de 5%.

Resultados

Constituintes fitoquímicos

A análise fitoquímica preliminar realizada no extrato de cormos de S. guttatum identificou alcaloides, flavonoides, fenóis, fitosteróis, saponinas e taninos.

Monitoramento invasivo de pressão arterial

Os valores da pressão arterial média (PAM) medidos nos diferentes grupos experimentais são mostrados nas Figuras 1 e 2. A PAM do grupo de ratos com HIDATS apresentou elevação de 67,7% da pressão arterial em comparação ao grupo controle normotenso. Esta elevação na PAM foi revertida pelo tratamento com Sg.B de maneira dose-dependente (p <0,01) até a concentração de 300 mg/kg, onde atingiu seu efeito máximo de redução da PAM (p<0,001). A PAM em ratos tratados com verapamil (5 mg/kg e 10 mg/kg) também diminuiu de maneira dose-dependente (p<0,01 e p<0,001 respectivamente) atingindo o efeito máximo na concentração de 15 mg/kg (p<0,001).

Figura 1

Pressão arterial média em ratos normotensos, hipertensos e ratos tratados com extrato bruto de Sauromatum guttatum (Sg.Cr) para hipertensão induzida por dieta com alto tear de sal, em doses de 100 mg/kg, 150 mg/kg e 300 mg/kg (n = 5- 7; média ± EPM). Comparado com os valores do grupo controle hipertensivo, **p <0,01 e ***p <0,001

Figura 2

Pressão arterial média em ratos normotensos, hipertensos e com hipertensão induzida por dieta com alto teor de sal tratados com verapamil nas doses de 5 mg/kg, 10 mg/kg e 15 mg/kg) (n = 5-7; média ± EPM). Comparado com os valores do grupo controle hipertenso, **p<0,01 e ***p<0,001

A alta ingestão de sal por 8 semanas causou uma diminuição significativa (p < 0,001) no peso corporal no grupo controle hipertenso (Tabela 1). O tratamento de ratos hipertensos com extrato bruto de Sauromatum guttatum (Sg.B) evitou alteração significativa no peso corporal em todas as doses, enquanto os animais tratados com verapamil na dose de 5 mg/kg apresentaram redução significativa no peso corporal (p < 0,05). Os animais nos grupos tratados com verapamil (ambos, 10 mg/kg e 15 mg/kg) não apresentaram alteração significativa no peso corporal (Tabela 1).

Tabela 1

Efeito no peso corporal dos grupos controle normal, controle hipertenso e ratos tratados com diferentes doses do extrato bruto de Sauromatum guttatum (Sg.B) e verapamil. Os valores sao expressos como média ± DP (n = 5-7).

Grupos	Peso (g)	Peso (g) após 8 semanas
Controle normal	244,66 ± 6,36	267,61 ± 3,08
Grupo hipertenso	249,28 ± 3,25	182,10 ±5,09***
Tratado com Sg.B 100 mg/kg	241,66 ±3,81	245,01 ± 4,66
Tratado com Sg.B 150 mg/kg	245,93 ± 6,43	250,90 ± 3,53
Tratado com Sg.B 300 mg/kg	239,43 ± 1,48	248,63 ± 4,52
Tratado com Verapamil 5 mg/kg	240,50 ± 1,41	214,23 ± 3,53*
Tratado com Verapamil 10 mg/kg	242,25 ± 5,65	247,68 ± 2,96
Tratado com Verapamil 15 mg/kg	245,83 ± 6,36	254,48 ± 3,32

Sg.B: Extrato bruto de Sauromatum guttatum. Os valores são expressos como média ± DP (n = 5-7).

p<0,05,

p<0,01 e

p<0,001

vs. valores de pré-tratamento (análisc ANOVA de uma via seguida de teste post-hoc de Tukcy HSD)

Estudos de reatividade vascular in vitro

Em aortas isoladas do grupo normotenso, a acetilcolina causou relaxamento completo com valor de CE50 de 0,2 µM (0,1–0,3) (Figura 3). Por outro lado, as aortas de ratos do grupo controle hipertenso exibiram apenas 5,5% de relaxamento dependente de acetilcolina, como mostrado na Figura 3. O tratamento com extrato bruto de S. guttatum de 100 mg/kg e 150 mg/kg restaurou parcialmente o relaxamento induzido por acetilcolina para 38,5 % e 45,5%, respectivamente. Entretanto, os anéis de ratos SD tratados com 300 mg/kg de extrato bruto de S. guttatum mostraram 100% de relaxamento dependente de acetilcolina, com valor de CE50 de 0,6 µM (0,3-1,0) (Figura 3). O tratamento com verapamil 5 mg/kg causou apenas um relaxamento insignificante, enquanto o tratamento com 10 mg/kg induziu relaxamento de até 16%. Curiosamente, o aumento da concentração de verapamil para 15 mg/kg não aumentou ainda mais o relaxamento induzido pela acetilcolina (Figura 3).

Figura 3

Traçados e gráficos típicos mostram o efeito da acetilcolina (ACh) contra as contrações induzidas por fenilefrina nos anéis aórticos isolados de ratos normotensos, grupo controle hipertenso (A) e de ratos tratados com extrato bruto de Sauromatum guttatum (Sg.Cr) com hipertensão induzida por dieta com alto teor de sal, em doses de 100 mg/kg, 150 mg/kg e 300 mg/kg (B) e em ratos tratados com verapamil com hipertensão induzida por dieta com alto teor de sal em doses de 5 mg/kg, 10 mg/kg e 15 mg/kg (C) (n = 5-7; média ± DP). Em comparação com os valores do grupo controle hipertenso, *p <0,05, **p <0,01 e ***p <0,001

Estudos in vitro da aorta de rato

Estudos farmacológicos foram realizados na aorta de ratos normotensos para investigar o efeito anti-hipertensivo do extrato bruto S. guttatum. Relaxamentos induzidos pela adição cumulativa de extrato bruto em anéis aórticos pré-constritos com FE apresentaram um valor de CE50 de 0,15 mg/mL (0,10-0,20) (Figura 4). Os anéis pré-tratados com L-NAME (10 µM) mostraram relaxamento com valor de CE50 de 5,1 mg/mL (3,0-7,1) (Figura 4). O extrato bruto de S. guttatum não foi capaz de induzir relaxamento em anéis pré-tratados com atropina (1 µM) e anéis desnudados de endotélio. O pré-tratamento com atropina (1 µM) e a remoção do endotélio diminuíram o relaxamento induzido pelo extrato bruto em 26% e 14%, respectivamente (Figura 4). O extrato bruto de S. guttatum também produziu vasorrelaxamento em anéis aórticos pré-constritos com alta concentração de K+ com valor de CE50 de 9,03 mg/mL (8,06-10,00). Em comparação, o verapamil relaxou as aortas pré-constritas com níveis altos de K+ com valor de CE50 de 2,02 µM (1,02-3,02) (Figura 5).

Figura 4

O traçado (A) e o gráfico (B) mostram o efeito do extrato bruto de Sauromatum guttatum em aorta intacta, pré-tratada com L-NAME (10 µM) e atropina (1 µM) e em aorta de rato normotenso com endotélio desnudado versus contrações induzidas por fenilefrina (n = 5-7; média ± DP). *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001 vs. Controle (valores pré-tratados). Análise ANOVA de duas vias seguida pelo teste post-hoc de Bonferroni.

Figura 5

O traçado (A) e os gráficos (B, C) mostram o efeito do extrato bruto de Sauromatum guttatum nas contrações induzidas por potássio elevado (K+) (80 mM) na preparação da aorta intacta de rato (n = 5-7; média ± DP). *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001 vs. Controle (valores pré-tratados). Análise ANOVA de duas vias seguida pelo teste post-hoc de Bonferroni.

Estudo in vitro do átrio direito em ratos

Tiras do átrio direito de ratos normotensos foram utilizadas para investigar os efeitos cronotrópicos e inotrópicos de S. guttatum. O extrato bruto mostrou uma diminuição dose-dependente na força de contração e na frequência cardíaca com valor de CE50 de 2,99 mg/mL (1,08-4,90) e 1,83 (1,02-2,64), respectivamente (Figura 6). Em tecidos pré-tratados com atropina, a diminuição da força de contração e da frequência cardíaca foi de 29% e 44%, respectivamente (Figura 6).

Figura 6

O traçado (A) e os gráficos (B, C) mostram os efeitos inotrópico e cronotrópico do extrato bruto de Sauromatum guttatum sem e com atropina (1 µM) no átrio direito de ratos normotensos pré-tratados (n = 5-7; média ± DP) *p <0,05, ** p <0,01 e ***p <0,001 vs. controle (valores pré-tratados). Análise ANOVA de duas vias seguida pelo teste post-hoc de Bonferroni

Discussão

A S. guttatum tem sido tradicionalmente utilizada no tratamento de doenças do sangue. Ela contém uma grande quantidade de magnésio e potássio.[11,15] Além disso, seu efeito antioxidante, espasmolítico e como bloqueador de entrada de Ca2+ já foi relatado.[19,20]

Plantas com propriedades antioxidantes, a dieta DASH (Dietary Approaches to Stop Hypertension.) rica em potássio e magnésio e bloqueadores de entrada de Ca2+ são recomendados para o manejo da hipertensão.[8,30,31] O presente estudo, utilizando o modelo de rato SD hipertenso, foi realizado para explorar o extrato bruto de S. guttatum como um potencial medicamento anti-hipertensivo. Diferentes doses de extrato bruto de S. guttatum foram administradas por via oral a ratos SD com hipertensão induzida por dieta com alto teor de sal. Esse tratamento resultou em diminuição significativa na pressão arterial média, com efeito máximo observado com uma dose de 300 mg/kg. Este efeito do extrato bruto foi comparável ao do verapamil, que é um fármaco anti-hipertensivo padrão e bloqueador dos canais de cálcio.[31] Esse achado revelou que o extrato de S. guttatum é eficaz contra o desenvolvimento de hipertensão experimental induzida por dieta rica em sal. No entanto, são necessários mais estudos para identificar o possível mecanismo de ação subjacente.

Uma vez que a pressão arterial é o produto de elevada resistência vascular periférica e alto débito cardíaco,[32] outros experimentos foram realizados utilizando preparações vasculares e cardíacas isoladas. Primeiro, foi feita uma tentativa de estabelecer como a alta ingestão de sal induz a disfunção endotelial. A integridade do endotélio foi confirmada pela aplicação de concentrações submáximas de acetilcolina em anéis aórticos pré-constritos com fenilefrina em ratos com HIDATS. A acetilcolina não foi capaz de induzir relaxamento nos anéis aórticos do grupo de ratos com HIDATS, indicando que o endotélio foi danificado. Esse achado é corroborado por estudos anteriores.[33-35] Em anéis aórticos de ratos normotensos, por outro lado, as mesmas concentrações de acetilcolina induzem relaxamento, indicando a presença de endotélio funcional. Nos grupos tratados com extrato, a resposta à acetilcolina foi restaurada. Esses resultados indicam que o tratamento com extrato bruto pode reverter o dano endotelial e também evitar a elevação da pressão arterial média observada in vivo. Em comparação, o verapamil falhou em induzir vasorrelaxamento em anéis aórticos de ratos com HIDATS do grupo controle ou ratos tratados, indicando que seu mecanismo de ação é diferente do extrato bruto. O extrato de S. guttatum exerce sua função anti-hipertensiva na hipertensão experimental através da preservação parcial da função endotelial.

Outros estudos in vitro foram realizados na aorta para investigar o(s) mecanismo(s) de ação(ões) subjacente(s). Em anéis aórticos pré-constritos com acetilcolina de ratos normotensos, a adição cumulativa de concentrações de extrato bruto induziu vasorrelaxamento. A remoção do endotélio reverteu completamente esse efeito, sugerindo que fatores derivados do endotélio vascular podem desempenhar um papel. No entanto, a alta concentração de acetilcolina ainda induziu relaxamento, sugerindo envolvimento de diferentes mecanismos. Para estudar o envolvimento do óxido nítrico, os anéis aórticos foram pré-tratados com L-NAME, um inibidor de óxido nítrico sintase.[36] Curiosamente, o efeito vasorrelaxante do extrato de S. guttatum foi reduzido em cerca de 75% na concentração de 1 mg/mL, embora em concentrações mais altas ele tenha desviado a curva de resposta para a direita. Esses achados sugerem que o extrato de S. guttatum induz vasorrelaxamento através tanto da via dependente do endotélio (em concentração mais baixa) como da via independente do endotélio (em concentração mais alta). O componente dependente do endotélio pode ser atribuído ao óxido nítrico. Em células endoteliais vasculares, a liberação de óxido nítrico é acoplada a receptores muscarínicos.[37] Para verificar se o efeito do extrato bruto de S. guttatum está ligado a receptores muscarínicos e ao óxido nítrico, os anéis aórticos foram contraídos com atropina, um antagonista do receptor muscarínico.[37] Este pré-tratamento aboliu o vasorrelaxamento associado ao extrato bruto de S. guttatum, indicando assim uma ação através da via do óxido nítrico (NO) ligada ao receptor muscarínico. A Atropina ou o L-NAME não foram capazes de inibir o relaxamento em concentrações mais elevadas do extrato bruto, sugerindo ainda que o extrato também pode atuar nos músculos lisos vasculares. Para testar essa hipótese, anéis aórticos foram contraídos com alta concentração de K+. Curiosamente, a adição cumulativa do extrato bruto induziu um efeito vasorrelaxante 10 vezes menos potente do que contra a FE. O K+ elevado foi utilizado para induzir contrações, pois ativa os canais de cálcio dependentes de voltagem (Cav) e a liberação de Ca2+ através da despolarização, resultando em vasoconstrição.[38,39] Esses achados indicam que o extrato bruto de S. guttatum também inibe a entrada de Ca2+ pelos canais dependentes da voltagem. Também sugere que o NO vascular desempenha um papel dominante no efeito vasorrelaxante e anti-hipertensivo de S. guttatum, além do efeito nos músculos lisos vasculares.

Para investigar o efeito do extrato de S. guttatum nos parâmetros cardíacos, foram utilizadas tiras atriais isoladas de ratos. O extrato de S. guttatum mostrou efeitos negativos inotrópicos (82%) e cronotrópicos (56%) quando adicionado cumulativamente às tiras do átrio direito que se contraem espontaneamente. Para testar o possível papel dos receptores muscarínicos cardíacos, as tiras atriais foram pré-tratadas com atropina. Este pré-tratamento inibiu parcialmente o efeito do extrato bruto de S. guttatum, indicando assim a possibilidade de que o efeito negativo inotrópico ou cronotrópico observado seja devido à ativação de receptores muscarínicos cardíacos. Entretanto, nossos achados revelaram que o extrato é mais seletivo para os receptores muscarínicos vasculares do que para os receptores cardíacos.

O extrato de S. guttatum também foi testado quanto à presença de constituintes fitoquímicos. Foi verificado que ele contém flavonoides, fenóis e taninos. Estudos anteriores revelaram o efeito terapêutico de flavonoides, fenóis e taninos na hipertensão.[40-42] Portanto, esses constituintes podem ser os agentes ativos responsáveis pela redução da pressão arterial e efeitos vasculares na hipertensão induzida por alto teor de sal. Os estudos fitoquímicos futuros serão concentrados no isolamento dos componentes ativos e na exploração dos mecanismos subjacentes, como o bloqueio do cálcio e a via do óxido nítrico a nível molecular.

Conclusão

Esses achados indicam que S. guttatum possui atividade anti-hipertensiva, resultando em efeitos vasodilatadores e depressores do miocárdio atrial ligados a receptores muscarínicos. A preservação da função endotelial, a liberação de NO dependente do receptor muscarínico e a inibição do movimento de Ca+2 são os mecanismos subjacentes de vasodilatação. O extrato de S. guttatum também exerce efeitos negativos inotrópico e cronotrópico, possivelmente devido à ativação de receptores muscarínicos cardíacos. Nossos resultados, observados no modelo de rato SD, fornecem uma explicação farmacológica para o potencial anti-hipertensivo de S. guttatum.

Introduction

Hypertension is an important risk factor for cardiovascular disease and mortality due to target-organ damage.[1] There are many environmental factors that contribute to the etiology of hypertension, including high salt intake. High salt intake has remained the most important factor in the etiology of hypertension in humans.[2] In rats, high salt intake also promotes hypertension, providing a convenient model to study human hypertension.[3] Sustained consumption of a high-salt diet leads to endothelial dysfunction, which may pose a particularly significant risk factor in the development of hypertension,[4] negatively affecting the quality of life.[5] Hypertension management measures include lifestyle adjustments, diet modification, exercise, as well as conventional and alternative therapies, including herbal remedies.[6-8] Sauromatum guttatum (S. guttatum) belongs to the Araceae family, and is commonly known as “Voodoo Lilly”. Sauromatum guttatum is known as “Sanp ki Booti” in Pakistan and India, where it is ubiquitous. S. guttatum is traditionally used for treating inflammation, breathing difficulties,[9] gastric troubles,[10] tuberculosis, blood disorders, snakebites and skin infections.[11] S. guttatum contains lectins, dimethyl sulphides, caryophyllene, indole, skatole, ammonia, trimethylamine and primary amines.[12-14] The corms contain carbon, magnesium, sulfur, oxygen, phosphorus, potassium and chlorine. In vitro studies revealed S. guttatum's mitogenic,[15] antiproliferative,[16] herbicidal,[17] lipoxygenase inhibitor,[18] antioxidant, antibacterial,[19] spasmolytic[18,20] and insecticidal activities.[17,21] It is traditionally used to manage blood disorders. It has been previously reported that its spasmolytic effect is mediated through Ca2+ entry blockade in the smooth muscles of the intestine.[20] Ca2+ entry blockers also have an important therapeutic role in the management of hypertension. All these observations provide a solid foundation for our hypothesis that S. guttatum extract might have antihypertensive properties. The objective of this study was to investigate the antihypertensive potential of S. guttatum and to reveal the underlying mechanisms by using in vivo and in vitro methods.

Materials and methods

Preparation of crude extract and phytochemical screening

S. guttatum corms were procured in Nathia Gali, Pakistan (June-July, 2018), identified and validated by Dr. Abdul Nazir, Assistant Professor, Department of Biotechnology, COMSATS University Islamabad, Abbottabad Campus, Pakistan. CHUA-112 is voucher code for the specimen in the herbarium, Department of Pharmacy, COMSATS University Islamabad, Abbottabad Campus, Pakistan. Fresh corms were chopped and dried under the shade at room temperature. Then the dry material was powdered, soaked in a (70%) aqueous methanol solution, with occasional shaking for fifteen, seven and three days. The macerate was filtered through a muslin cloth and then through a qualitative filter paper (Whatman, Grade 1).[22] This process was repeated thrice. Then, a rotary evaporator (-760 mmHg at 37°C) was used to concentrate the liquid extract. The crude extract was analyzed phytochemically for all important constituents such as flavonoids, alkaloids, saponins, phenols and tannins.[23]

Animals

All the experiments were performed in conformity with the guidelines from the Commission on Life Sciences, Institute of Laboratory Animal Resources, National Research Council[24] and approved by the Ethical Committee. Sprague-Dawley (SD) rats were kept in the Animal House with food and water available ad libitum.

Pharmacological investigations

Drugs and standards

Drugs and standards were purchased from the following sources: acetylcholine chloride, phenylephrine hydrochloride, atropine sulfate, pentothal sodium from Abbott Laboratories, Pakistan; while isoprenaline hydrochloride, potassium chloride, Nω-nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride (L-NAME) and verapamil hydrochloride were obtained from Sigma chemicals company, USA.

In vivo studies

High salt-induced hypertensive rat (HSHR) model and grouping

SD rats (200-250 g) (n=60) were divided randomly into eight groups (n=5-7 in each group). The sampling was done by convenience sampling. Group 1 (normal control group) was given a normal diet. Group 2 (hypertensive group) was given NaCl (8% in diet + 1% in drinking water) for 8 weeks. Groups 3-5 (S. guttatum-treated group) were given NaCl (8% in diet + 1% in drinking water) and different oral doses of S. guttatum crude extract (100 mg/kg/day, 150 mg/kg/day and 300 mg/kg/day) once daily for 8 weeks. Groups 6-8 (standard treated group) were given oral daily doses of verapamil (5 mg/kg/day, 10 mg/kg and 15 mg/kg/day) along with a NaCl diet containing 8% NaCl + 1% NaCl in drinking water for 8 weeks.[25-27]

Invasive blood pressure recording in HSHR

The tracheal intubation of anesthetized (pentothal, 40–100 mg/kg, i.p) SD rats were performed using polyethylene tubing (PE-20). To monitor blood pressure, the right carotid artery was canulated using polyethylene tubing (PE-50) and affixed to a PowerLab Data Acquisition System (ADInstrument, Australia), through a pressure transducer (MLT 0699). An overhead lamp was used to maintain the animal's body temperature. Mean arterial pressure was monitored for 30 minutes in each group.[25,28]

Body weight profile

Body weight was determined at the beginning of the experiment in all groups and subsequently monitored weekly. After 8 weeks of treatment, the change in body weight was calculated.

In vitro studies

Vascular reactivity studies

To investigate the crude extract-induced endothelium preservation effect in HSHR, we isolated aortae from the normotensive, hypertensive and treated groups. Aortic rings were hanged in tissue baths (10 mL), containing carbogen (5% CO2 and 95% O2) aerated normal Kreb's solution consisting of NaCl, 118.2 mM; KCl, 4.7 mM; MgSO4, 1.2 mM; KH2PO4, 1.3 mM; NaHCO3, 25.0 mM; Glucose, 11.7 mM; CaCl2, 2.5 mM, and kept at 37°C. The force was monitored by the PowerLab Data Acquisition System (ADInstrument, Australia) and a bridge amplifier (N12128) using a force displacement transducer (MLT 0201). Aortic rings were stabilized at 2 g isometric tension for 60-90 minutes by changing the Kreb's solution every 15 minutes. To determine the endothelial integrity, different concentrations of acetylcholine were used on phenylephrine (1 µM) pre-constricted aortic rings.[25,28]

Isolated SD rat aortic preparations

Aortic rings were hanged in tissue baths filled with 10 mL of carbogen (5% CO2 and 95% O2) aerated normal Kreb's solution maintained at 37°C, affixed to a PowerLab Data Acquisition System (ADInstrument, Australia) and a bridge amplifier (N12128) using a force displacement transducer (MLT 0201). The rings were equilibrated for 60-90 minutes at an isometric tension of 2 g, while the solution was changed after every 15 minutes. Different concentrations (0.1–10 mg/mL) of S. guttatum were added to PE preconstricted rings. To determine the underlying mechanism, aortic rings were pre-treated with 1 µM atropine or 10 µM L-NAME for 30 minutes. In some experiments, endothelium-denuded rings from normotensive rats were used.[25,28,29]

Isolated right atrial preparations

The right atria from normotensive SD rats were dissected. The atrial preparations were hanged in tissue baths containing 10 mL of aerated Kreb's solution, maintained at 32°C, linked to PowerLab (ML 846) Data Acquisition System (ADInstrument, Australia) and bridge amplifier (N12128) via force transducer (MLT 0201). The tissues were stabilized at the resting tension of 1 g for 30 minutes. The muscarinic receptor involvement was studied in atropine (1 µM) pre-treated atrial preparations.[25,28]

Statistical analysis

Data were normally distributed, as determined by the Shapiro-Wilk's test of normality. Data were expressed as mean ± standard deviation (SD) and the median effective concentrations (EC50 values) with the 95% confidence interval (CI). The % of change in MAP or body weight profiles were calculated by one-way analysis of variance (ANOVA) (followed by post-hoc Tukey HSD test). The % of vasorelaxation in normotensive and hypertensive rats were calculated by two-way ANOVA (followed by post-hoc Bonferroni test) using SPSS software, v. 21 (USA). The accepted level of statistical significance was set at 5%.

Results

Phytochemical constituents

Preliminary phytochemical analysis performed on S. guttatum corms extract indicated presence of alkaloids, flavonoids, phenols, phytosterols, saponins and tannins.

Invasive blood pressure monitoring

The mean arterial pressure (MAP) values measured in different experimental groups are shown in Figures 1 and 2. The MAP of the HSHR group showed a 67.7% elevation in blood pressure as compared to the normotensive control group. This elevation in MAP was reversed by Sg.Cr treatment in a dose-dependent manner (p < 0.01) with up to 300 mg/kg concentration, where it reached its maximal MAP lowering effect (p < 0.001). The MAP in verapamil-treated rats (5 mg/kg and 10 mg/kg) also decreased in a dose-dependent manner (p < 0.01 and p < 0.001 respectively) reaching the maximal effect at a 15 mg/kg concentration (p < 0.001).

Figure 1

Mean arterial pressure in the normotensive, hypertensive and Sauromatum guttatum crude extract (Sg.Cr)-treated high salt-induced hypertensive rats at doses of 100 mg/kg, 150 mg/kg and 300 mg/kg (n=5-7; mean ± SEM). Compared with hypertensive control values, **p < 0.01 and ***p < 0.001

Figure 2

Mean arterial pressure in the normotensive, hypertensive and verapamil-treated high salt-induced hypertensive rats at doses of 5 mg/kg, 10 mg/kg and 15 mg/kg) (n=5-7; mean ± SEM). Compared with hypertensive control values, **p < 0.01 and ***p < 0.001

High salt intake for 8 weeks caused a significant (p < 0.001) decrease in body weight in the hypertensive control group (Table.1). The treatment of hypertensive rats with Sauromatum guttatum crude extract (Sg.Cr) prevented significant changes in body weight at all doses, while verapamil-treated animals at 5 mg/kg showed a significant decrease in body weight (p < 0.05). Animals in the verapamil-treated groups (both 10 mg/kg and 15 mg/kg) did not show any significant changes in body weight (Table.1).

Table 1

Effect on body weight in normal control, hypertensive control and rats treated with different doses of the crude extract of Sauromatum guttatum (Sg.Cr) and verapamil. Values are expressed as mean ± SD (n=5-7)

Groups	Weight (g)	Weight (g) after 8 weeks
Normal control	244.66 ± 6.36	267.61 ± 3.08
Hypertensive group	249.28 ± 3.25	182.10 ± 5.09***
Sg.Cr 100 mg/kg treated	241.66 ± 3.81	245.01 ± 4.66
Sg.Cr 150 mg/kg treated	245.93 ± 6.43	250.90 ± 3.53
Sg.Cr 300 mg/kg treated	239.43 ± 1.48	248.63 ± 4.52
Verapamil 5 mg/kg treated	240.50 ± 1.41	214.23 ± 3.53*
Verapamil 10 mg/kg treated	242.25 ± 5.65	247.68 ± 2.96
Verapamil 15 mg/kg treated	245.83 ± 6.36	254.48 ± 3.32

Sg.Cr: Crude extract of Sauromatum guttatum. Values are expressed as mean ± SD (n=5-7).

p < 0.05,

p < 0.01 and

p < 0.001

vs. pretreatment values (One-way ANOVA analysis followed by Tukey HSD post-hoc test).

In vitro vascular reactivity studies

In aortas isolated from the normotensive group, acetylcholine caused complete relaxation with an EC50 value of 0.2 µM (0.1–0.3) (Figure 3). Aortas from hypertensive control rats, on the other hand, displayed only 5.5% acetylcholine-dependent relaxation as shown in Figure 3. S. guttatum crude extract treatment at doses of 100 mg/kg and 150 mg/kg partially restored the acetylcholine-induced relaxation to 38.5%, and 45.5%, respectively. However, rings from SD rats treated with 300 mg/kg S. guttatum crude extract showed 100% acetylcholine-dependent relaxation with an EC50 value of 0.6 µM (0.3–1.0) (Figure 3). Treatment with 5 mg/kg verapamil caused only a negligible relaxation, while treatment with 10 mg/kg induced relaxation up to 16%. Interestingly, the increase in verapamil concentration up to 15 mg/kg did not further increase the acetylcholine-induced relaxation (Figure 3).

Figure 3

Typical tracings and graphs show the effect of acetylcholine (ACh) against phenylephrine-induced contractions in isolated rat aortic rings in normotensive, hypertensive control (A) and Sauromatum guttatum crude extract (Sg.Cr) treated high salt-induced hypertensive rats at doses of 100 mg/kg, 150 mg/kg and 300 mg/kg (B) and verapamil treated high salt-induced hypertensive rats at doses of 5 mg/kg, 10 mg/kg and 15 mg/kg (C) (n=5-7; mean ± SD). Compared with hypertensive control values, *p < 0.05, **p < 0.01 and ***p < 0.001.

In vitro rat aorta studies

Pharmacological studies were performed in normotensive rat aortae to investigate the antihypertensive effect of the S. guttatum crude extract. Relaxation induced by the cumulative addition of the crude extract on PE-preconstricted aortic rings showed an EC50 value of 0.15 mg/mL (0.10-0.20) (Figure 4). L-NAME (10 µM) pre-treated rings showed relaxation with EC50 value of 5.1 mg/mL (3.0-7.1) (Figure 4). S. guttatum crude extract failed to induce relaxation in atropine (1 µM) pretreated and endothelial denuded rings. Both atropine pretreatment (1 µM) and endothelium removal decreased the crude extract-induced relaxation by 26% and 14%, respectively (Figure 4). S. guttatum crude extract also produced vasorelaxation in aortic rings preconstricted with high K+ concentration, with an EC50 value of 9.03 mg/mL (8.06-10.00). In comparison, verapamil relaxed the high K+ preconstricted aortas with EC50 value of 2.02 µM (1.02-3.02) (Figure 5).

Figure 4

Tracing (A) and graph (B) show the effect of Sauromatum guttatum crude extract on intact, L-NAME (10 µM) and atropine (1µM) pretreated and endothelium denuded normotensive rat aorta against phenylephrine-induced contractions (n=5-7; mean ± SD). *p < 0.05, **p < 0.01 and ***p < 0.001 vs Control (pretreated values). Two-way ANOVA analysis followed by Bonferroni's post-hoc test.

Figure 5

Tracing (A) and graph (B, C) show the effect of Sauromatum guttatum crude extract on high potassium (K+) (80 mM)-induced contractions in intact rat aortic preparation (n=5-7; mean ± SD). *p < 0.05, **p < 0.01 and ***p < 0.001 vs. Control (pretreated values). Two-way ANOVA analysis followed by Bonferroni's post-hoc test

In vitro rat right atrial study

Right atrial strips from normotensive rats were used to investigate chronotropic and inotropic effects of S. guttatum. The crude extract showed a dose-dependent decrease in force of contraction and heart rate with an EC50 value of 2.99 mg/mL (1.08-4.90) and 1.83 (1.02-2.64), respectively (Figure 6). In atropine pre-treated tissues, the decrease in force of contraction and heart rate was shown to be 29% and 44%, respectively (Figure 6).

Figure 6

Tracing (A) and graph (B, C) show the inotropic and chronotropic effects of Sauromatum guttatum crude extract without and with atropine (1 µM) pre-treated normotensive rat right atria (n=5-7; mean ± SD). *p < 0.05, **p < 0.01 and ***p < 0.001 vs. control (pretreated values). Two-way ANOVA analysis followed by Bonferroni's post-hoc test.

Discussion

Traditionally, S. guttatum has been used in the management of blood disorders. It contains ample amounts of magnesium and potassium.[11,15] Additionally, it has been reported as an antioxidant, spasmolytic and Ca2+ entry blocker agent.[19], [20] Plants with antioxidant properties, DASH diet rich in potassium and magnesium and Ca2+ entry blockers are recommended for hypertension management.[8,30,31] The present study, using the hypertensive SD rat model, was carried out to explore the use of the crude extract from S. guttatum as a potential antihypertensive drug. Different doses of S. guttatum crude extracts were given orally to high salt diet-induced hypertensive SD rats. This treatment resulted in a significant decrease in the mean arterial pressure, with a maximum effect observed at the dose of 300 mg/kg. This effect of the crude extract was comparable to that of verapamil, which is a standard antihypertensive drug and calcium channel blocker.[31] This finding revealed that S. guttatum extract is effective against the development of high salt diet-induced experimental hypertension. However, further studies were needed to identify the possible underlying action mechanism.

Since blood pressure is the product of elevated peripheral vascular resistance and high cardiac output,[32] further experiments were carried out using isolated vascular and cardiac preparations. First, an attempt was made to establish how high salt intake induces endothelial dysfunction. Endothelial integrity was confirmed by applying sub maximum concentrations of acetylcholine on phenylephrine-preconstricted aortic rings from HSHR. Acetylcholine failed to induce relaxation in aortic rings in the HSHR group, indicating that the endothelium was damaged. This finding is supported by previous studies.[33-35] In aortic rings from normotensive rats, on the other hand, same concentrations of acetylcholine induced relaxation, indicating the presence of a functional endothelium. In the extract-treated groups, the response to acetylcholine was restored. These results indicate that the crude extract treatment can reverse the endothelial damage and also prevent the elevation in mean arterial pressure observed in in-vivo. In comparison, verapamil failed to induce vasorelaxation in aortic rings in HSHR control or treated rats, indicating that its action mechanism is different from that of the crude extract. S. guttatum extract exerts its antihypertensive function on experimental hypertension by partially preserving the endothelial function.

Further in vitro studies were carried out in the aorta to investigate the underlying action mechanism(s). In acetylcholine-preconstricted aortic rings of normotensive rats, the cumulative additions of crude extract concentrations induced vasorelaxation. Endothelial denudation completely reversed this effect, suggesting that vascular endothelial-derived factors might play a role. However, high concentrations of acetylcholine still induced relaxation, suggesting the involvement of different mechanisms. To study the involvement of nitric oxide, aortic rings were pretreated with L-NAME, a nitric oxide synthase inhibitor.[36] Interestingly, the vasorelaxant effect of S. guttatum extract was reduced by about 75% at 1 mg/mL concentration, while higher concentrations shifted the response curve to the right. These findings suggest that S. guttatum induces vasorelaxation through both an endothelium-dependent (at a lower concentration) and endothelium-independent (at a higher concentration) pathways. The endothelium-dependent component could be attributed to nitric oxide. In vascular endothelial cells, nitric oxide release is coupled to muscarinic receptors.[37] To see if the effect of S. guttatum crude extract is linked to muscarinic receptors and nitric oxide, aortic rings were precontracted with atropine, a muscarinic receptor antagonist.[37] This pretreatment abolished vasorelaxation associated to the crude extract of S. guttatum, thus indicating an action through a muscarinic receptor-linked NO pathway. Atropine or L-NAME failed to inhibit relaxation at higher concentrations of the crude extract, further suggesting that the extract might also act on vascular smooth muscles. To test this hypothesis, aortic rings were precontracted with high K+ concentration. Interestingly, the cumulative addition of the crude extract induced a vasorelaxant effect that was 10 times less potent than against PE. High K+ was used to induce contractions, as it activates voltage-dependent calcium channels (VDCs) and Ca2+ release through depolarization, resulting in vasoconstriction.[38,39] These findings indicate that the crude extract of S. guttatum also inhibit Ca2+ entry through VDCs. It also suggests that vascular NO plays a dominant role in the vasorelaxant and antihypertensive effects of S. guttatum, in addition to the effect on vascular smooth muscles.

To investigate the effect of S. guttatum extract on cardiac parameters, isolated rat atrial strips were used. S. guttatum showed negative inotropic (82%) and chronotropic (56%) effects when added cumulatively to spontaneously contracting right atrial strips. To test the possible role of cardiac muscarinic receptors, atrial strips were pretreated with atropine. This pretreatment partially inhibited the effect of the crude extract of S. guttatum, thus indicating a possibility that the observed negative inotropic or chronotropic effect is due to cardiac muscarinic receptor activation. However, our findings revealed that the extract is more selective for the vascular than cardiac muscarinic receptors.

S. guttatum was also tested for the presence of phytochemical constituents. It was found to contain flavonoids, phenols, and tannins. Previous studies revealed the therapeutic effect of flavonoids, phenols and tannins on hypertension.[40-42] So, these constituents might be the active agents responsible for lowering blood pressure and the vascular effects in high salt-induced hypertension. Future phytochemical studies will be focused on isolating the active components and exploring the underlying mechanisms, such as calcium blocking and nitric oxide pathway at the molecular level.

Conclusion

These findings indicate that S. guttatum has antihypertensive activity resulting from the vasodilatory and atrial myocardium depressant effects linked to muscarinic receptors. Endothelial function preservation, muscarinic receptor dependent NO release and Ca+2 movement inhibition are the underlying mechanisms of vasodilation. S. guttatum also exerts negative inotropic and chronotropic effects, possibly due to activation of cardiac muscarinic receptors. Our results observed in the SD rat model provide pharmacological explanation for S. guttatum antihypertensive potential.