The Importance of Time-Course Studies Using Experimental Models of Cardiac Diseases.

De acordo com o American College of Cardiology , a Síndrome de Insuficiência Cardíaca (IC) é definida como uma síndrome clínica complexa que resulta de qualquer comprometimento estrutural ou funcional do enchimento ventricular ou da ejeção de sangue.[1] O agente etiológico da síndrome clínica da IC pode ter diferentes origens, as quais impactam no prognóstico e impõem a necessidade de estratégias de tratamento específicas. Deve-se ressaltar a relevância de dados específicos para enfatizar essas diferenças na IC, incluindo sua evolução temporal.[2] Esta visão é similar à atual diretriz brasileira para IC.[3] Apesar da melhora no tratamento e gestão da IC, com uma redução na taxa de mortalidade geral ao longo do tempo,[4] o número de mortes e os custos econômicos ainda são altos. Em 2014, uma revisão profunda, incluindo 197 países, mostrou que o custo econômico global da IC em 2012 foi estimado em US $ 108 bilhões por ano.[5] É importante ressaltar que os gastos da IC foram muito diferentes em países de alta, média e baixa renda.[5] Por exemplo, entre 2014-2020, os custos médicos totais medianos anuais para atendimento à insuficiência cardíaca foram estimados em US $ 24.383 por paciente nos Estados Unidos da América,[6] enquanto no Brasil em 2015, o custo médio por paciente com IC foi de 1569 US $, considerando a taxa de câmbio de 2015.[7] O alto custo por paciente provavelmente está relacionado à falta de terapias eficazes para melhorar a saúde humana durante a IC. Então, desvendar as bases moleculares da remodelação cardíaca encontrada na doença é um dos principais desafios da medicina cardiovascular.

Nos últimos anos, avanços significativos na compreensão dos mecanismos moleculares da hipertrofia compensada e descompensada e da insuficiência cardíaca em resposta aos sinais de estresse mostraram que muitos fatores extracelulares e vias de sinalização estão envolvidos na remodelação dos cardiomiócitos, as células contráteis funcionais encontradas no tecido cardíaco. Como o curso da IC é etiológico-dependente, é fundamental entender como a síndrome de IC se desenvolve em diferentes modelos. Por exemplo, a dinâmica intracelular do Ca2 é modificada nas diferentes etiologias de IC com fração de ejeção reduzida (HFrEF) ou preservada (HFpEF). Em modelos animais de HFpEF e HFrEF diabéticos ou hipertensos, os estudos mostraram que a magnitude e a cinética da liberação de Ca2permanecem inalteradas em ambos os modelos de HFpEF, mas prejudicadas em HFrEF. Embora a densidade da proteína Sarco/retículo endoplasmático Ca2 adenosina trifosfatase-2a (SERCA) tenha sido reduzida nesses modelos HFrEF e HFpEF, no modelo HFpEF para hipertensão, isso é compensado pelo aumento da fosforilação PLB (Fosfolamban é uma proteína capaz de modular a SERCA2A), mas não em HFrEF e HFpEF diabéticos, resultando em retardo da recaptação de Ca2 intracelular por SERCA.[8]

Um dos modelos animais mais usados para estudar a IC consiste na colocação de uma faixa constritiva de diâmetros variáveis ao redor da aorta ascendente.[9] É importante ressaltar que a idade do animal, o diâmetro da banda e o posicionamento da constrição impactam no desfecho da doença. Isso provavelmente explica a variedade de fenótipos encontrados em estudos básicos disponíveis na literatura. Um dos primeiros estudos usando este modelo descreveu alterações morfológicas precoces no coração, o qual foi notável 2 meses após a bandagem aórtica com aumento de 80% do peso da massa do ventrículo esquerdo. A seguir, a literatura explorou vários aspectos da síndrome de IC usando esse modelo animal. Um dos modelos mais estudados neste cenário é o modelo do rato usando uma faixa de prata (0,6–0,7 mm de diâmetro interno) colocada 3 mm distante da raiz da aorta ascendente. Artigos anteriores encontraram mudanças estruturais no coração logo 3 semanas após o procedimento cirúrgico,[10] e a gravidade da remodelação cardíaca aumentou ao longo do tempo. No entanto, os autores não exploraram as alterações estruturais do coração mais tardiamente no modelo experimental em seu estudo seminal. Como o estágio final da síndrome de IC pode variar desde os estágios iniciais, é importante compreender os mecanismos moleculares subjacentes envolvidos na fase crônica da IC induzida pela estenose aórtica.

A este respeito, o estudo recente de da Silva et al.,[11] avançou nesse campo. Usando o mesmo modelo de rato descrito anteriormente, eles relataram que 28 semanas após a estenose aórtica em ratos foi encontrada na avaliação ecocardiográfica, atenuação significativa da fração de encurtamento e da fração de ejeção do ventrículo esquerdo, juntamente com o aumento do diâmetro diastólico do ventrículo esquerdo, um achado comum em vários modelos animais de IC.[12] De fato, usando ensaio isolado do músculo papilar do ventrículo esquerdo, eles descobriram no ensaio de contração pós-repouso clássico que o músculo papilar tinha capacidade mecânica reduzida em comparação com o grupo de controle usando baixa concentração de cálcio extracelular. Uma vez que os níveis de cálcio foram aumentados, os valores foram semelhantes aos do grupo controle, sugerindo prejuízo na dinâmica do Ca 2 no grupo experimental, como é esperado durante a IC. Foi curioso que o nível de expressão do canal de cálcio do tipo L foi avaliado, ele foi encontrado aumentado no grupo experimental, o que não está de acordo com o ensaio do músculo papilar. No entanto, é importante destacar que proteínas auxiliares adicionais dão origem à função do canal de cálcio tipo L in vivo, e essas proteínas podem modular a função do canal.[13] Assim, estudos funcionais usando a técnica de patch-clamp podem revelar esse resultado aparentemente contraditório. Além disso, os autores descobriram que o nível de expressão da principal bomba de extrusão citoplasmática de Ca2 encontrada nos cardiomiócitos, a SERCA2A, estava aumentada. No entanto, a proporção fosforilada de fosfolambam (PLB) na treonina-17 sobre o nível de PLB total foi atenuada. A PLB fosforilada em treonina-17 pode aumentar a atividade de SERCA2A. Assim, o resultado indica extrusão prejudicada do cálcio citoplasmático nos cardiomiócitos, como encontrado em outros modelos de IC.[12 , 14 , 15] Na verdade, o resultado está bem alinhado com o aumento do tempo de decaimento do Ca2 avaliado em cardiomiócitos isolados carregados com experimentos fura-2AM. Portanto, independentemente da etiologia da insuficiência cardíaca, arritmias ventriculares são frequentemente observadas e refletidas em um distúrbio uniforme da homeostase do Ca2. O efeito bifásico observado da atividade SERCA sobre a propensão de ondas arritmogênicas de Ca2 adiciona detalhes importantes para um melhor entendimento da homeostase do Ca2 em diferentes modelos cardíacos.[8]

Assim, futuras investigações estudando o modelo animal na evolução temporal da doença podem contribuir significativamente para a compreensão dos mecanismos moleculares envolvidos no desenvolvimento da insuficiência cardíaca.

According to the American College of Cardiology, Heart Failure (HF) Syndrome is defined as a complex clinical syndrome that results from any structural or functional impairment of ventricular filling or ejection of blood.[1] The etiological agent of the clinical syndrome of HF may result from different causes, which impact the prognosis and impose the necessity for specific treatment strategies, underlining the relevance of specific data elements for emphasizing these differences in HF, including the time course evolution of HF.[2] This view is similar to the current Brazilian guideline for HF.[3] Despite improvement in HF treatment and management, with a reduction in overall mortality rate over time,[4] the death number and economic costs are still high. In 2014 a deep revision including 197 countries showed that HF’s overall global economic cost in 2012 was estimated at $108 billion per annum.[5] Importantly, HF spending was largely different in high-income, middle, and low-income countries.[5] For example, between 2014-2020, the annual median total medical costs for heart failure care were estimated at $24,383 per patient in the United States of America,[6] meanwhile in Brazil in 2015, the average cost per patient with HF was 1,569 US$, taking into account the exchange rate in 2015.[7] The high cost per patient is probably related to the lack of effective therapies to improve human health during HF. Then unveiling the molecular basis of cardiac remodeling found in the disease is one of the main challenges in cardiovascular medicine.

In the last years, significant advances in understanding molecular mechanisms of adaptive and maladaptive hypertrophy and heart failure in response to stress signals have shown that many extracellular factors and signaling pathways are involved in the remodeling of cardiomyocytes, the working cells found in the heart tissue. Since the time course of HF is etiological-dependent, it is fundamental to understand how the HF syndrome develops. For example, the intracellular dynamics of Ca2are modified in the different etiologies of HF with reduced (HFrEF) or preserved (HFpEF) ejection fraction. In animal models of diabetic or hypertensive HFpEF and HFrEF, studies have shown that magnitude and kinetics of Ca2release remain unchanged in both HFpEF models but impaired in HFrEF. Although Sarco/endoplasmic reticulum Ca2adenosine triphosphatase-2a (SERCA) protein density was reduced in these HFrEF and HFpEF models, in the HFpEF model for hypertension, this is offset by increased PLB phosphorylation (Phospholamban is a protein able to modulate SERCA2A), but not in diabetic HFrEF and HFpEF resulting in delay intracellular Ca2reuptake by SERCA.[8]

One of the most used animal models to study HF relies on placing a constricting band of variable diameters around the ascending aorta.[9] It is important to highlight that animal age, the diameter of the band, and positioning of the constriction impact the outcome of the disease. It probably explains the variety of phenotypes found in basic studies available in the literature. One of the first studies using this model described early morphological changes in the heart, which was remarkable 2 months after aortic banding with 80% of left ventricular mass weight increment. Following, the literature explored several aspects of HF syndrome using this animal model. One of the most studied models in this setting is the rat model using a silver band (0.6–0.7 mm internal diameter) placed 3 mm around the root of ascending aorta. Previous reports had found structural changes in the heart as early as 3 weeks after the surgery procedure,[10] and the severity of heart remodeling increased over time. However, the authors did not explore the structural heart changes at a later time in their seminal study. Since the end stage of HF syndrome may vary from the initial stages, it is important to understand the underlying molecular mechanisms involved in the chronic phase of HF induced by aortic stenosis.

In this regard, the recent study by da Silva et al.[11] advanced in that field. Using the same rat model previously described, they reported that 28 weeks after aortic stenosis in rats was found in the echocardiographic evaluation, significant attenuation of fractional shortening and ejection fraction of the left ventricle, along with the enhanced left ventricular diastolic diameter, a common finding in several animal models of HF.[12] Indeed, using isolated left ventricular papillary muscle assay, they found in the classical post rest contraction assay that papillary muscle had reduced mechanical capacity compared to the control group using low extracellular calcium concentration. Once the calcium levels were enhanced, the values were like the control group, suggesting impairment in Ca2dynamics in the experimental group, as expected during HF. Intriguing, once the expression level of the L-type calcium channel was evaluated, it was found enhanced in the experimental group, which is not in accordance with papillary muscle assay. However, it is important to highlight that additional auxiliary proteins give rise to the function L-type calcium channel in vivo, and these proteins can modulate the channel function.[13] Thus, functional studies using the patch-clamp technique could uncover this apparently contradictory result. Also, the authors found that the expression level of the main cytoplasmic Ca2extrusion pump found in cardiomyocytes, SERCA2A, was increased. However, the phospholamban (PLB) phosphorylated ratio at threonine-17 over the total PLB level was attenuated. PLB phosphorylated at threonine-17 can enhance SERCA2A activity. Thus, the result indicates impaired extrusion of cytoplasmic calcium in cardiomyocytes, as found in other HF models.[12 , 14 , 15] Indeed, the result is well-aligned with increased time to Ca2decay evaluated in isolated cardiomyocytes loaded with Fura-2AM experiments. Therefore, regardless of the etiology of heart failure, ventricular arrhythmias are frequently observed and reflected in a uniform disturbance of Ca2homeostasis. The observed biphasic effect of SERCA activity on the propensity of arrhythmogenic Ca2waves add important details for a better understanding of Ca2homeostasis in different heart models.[8]

Thus, future investigation studying the animal model later in the time course of the disease could significantly contribute to the understanding of the molecular mechanisms involved in the development of heart failure.