The Dysfunctional Scenario of the Major Components Responsible for Myocardial Calcium Balance in Heart Failure Induced by Aortic Stenosis.

BACKGROUND: Maladaptive cardiac remodelling is characterized by diastolic and systolic dysfunction, culminating in heart failure. In this context, the dysfunctional scenario of cardiac calcium (Ca2+) handling has been poorly studied. An experimental model of aortic stenosis has been extensively used to improve knowledge about the key mechanisms of cardiac pathologic remodelling.
OBJECTIVE: To understand the dysfunctional process of the major components responsible for Ca2+ balance and its influence on cardiac function in heart failure induced by aortic stenosis.
METHODS: Male 21-day-old Wistar rats were distributed into two groups: control (sham; n= 28) and aortic stenosis (AoS; n= 18). Cardiac function was analysed by echocardiogram, isolated papillary muscle, and isolated cardiomyocytes. In the papillary muscle assay, SERCA2a and L-type Ca2+ channel activity was evaluated. The isolated cardiomyocyte assay evaluated Ca2+ handling. Ca2+ handling protein expression was analysed by western blot. Statistical significance was set at p <0.05.
RESULTS: Papillary muscles and cardiomyocytes from AoS hearts displayed mechanical malfunction. AoS rats presented a slower time to the Ca2+ peak, reduced Ca2+ myofilament sensitivity, impaired sarcoplasmic reticulum Ca2+ influx and reuptake ability, and SERCA2a and L-type calcium channel (LTCC) dysfunction. Moreover, AoS animals presented increased expression of SERCA2a, LTCCs, and the Na+/Ca2+ exchanger.
CONCLUSION: Systolic and diastolic heart failure due to supravalvular aortic stenosis was paralleled by impairment of cellular Ca2+ influx and inhibition of sarcoplasmic reticulum Ca2+ reuptake due to LTCC and SERCA2a dysfunction, as well as changes in Ca2+ handling and expression of the major proteins responsible for cellular Ca2+ homeostasis.

Introdução

A insuficiência cardíaca (IC) se caracteriza pela incapacidade do coração de realizar a perfusão de tecidos com o oxigênio e os nutrientes requeridos pela demanda metabólica do corpo;[1] importantes desfechos intolerância ao esforço e retenção hídrica.[2]O processo da IC é produto do remodelamento mal adaptado, que pode ocorrer devido a vários tipos de dano no coração, incluindo isquemia miocárdica e sobrecarga de volume e pressão.[3] Entre outros, o prejuízo do trânsito de cálcio é um mecanismo crucial da deterioração progressiva da função contrátil na IC.[4]

Pesquisadores reportaram mudanças na expressão e na função de proteínas reguladoras do trânsito de cálcio em várias doenças cardiovasculares.[5] No remodelamento patológico induzido pela estenose aórtica, estudos identificaram, por meio de diferentes métodos de indução cirúrgica e períodos da doença, várias mudanças nos elementos reguladores do Ca2.[11,12,14]Estudos iniciais sugeriram que mudanças na saída e na entrada do retículo sarcoplasmático de Ca2estão relacionadas à disfunção cardíaca causada pela estenose aórtica.[11,12] Nossos estudos anteriores avaliaram ratos com disfunção diastólica após seis e doze semanas da estenose aórtica.[16,17] Após seis semanas, observou-se uma deficiência na atividade do cálcio ATPase (SERCA2a) do retículo endo/sarcoplasmático sem alteração na expressão da proteína;[16]após doze semanas, observou-se um aumento na fosforilação do resíduo Ser(16) da PLB e menor expressão da proteína SERCA2a.[17] Além disso, em animais com IC após obstrução da aorta,[19,21,24] os autores detectaram corrente de Ca2(ICa) reduzida, ineficiência do acoplamento dos canais de cálcio do tipo L (CCTL) com os receptores Rianodina,[20] e mudanças nas proteínas de trânsito de cálcio.[19]

Como as investigações demonstram dados diferentes relacionados ao nível estrutural e funcional do remodelamento cardíaco e as adaptações correspondentes à dinâmica do Ca2do miocárdio, este estudo teve como objetivo caracterizar o processo disfuncional dos principais responsáveis pelo equilíbrio do Ca2e sua influência na função cardíaca da IC induzida por estenose aórtica. Para este fim, diferentemente de estudos anteriores, realizamos uma avaliação cardíaca global de animais 28 semanas após a estenose aórtica. Este estudo analisou a função cardíaca nos níveis celular, tecidual e de câmara, e também examinou o trânsito de cálcio e proteínas responsáveis pelo equilíbrio do Ca2citosólico, apresentando resultados divergentes e surpreendentes em comparação ao que hoje está disponível na literatura.

Métodos

Desenho do estudo

Um grupo de ratos machos Wistar, de 21 dias de idade, foi submetido à cirurgia de indução simulada (placebo, n=22) ou de estenose aórtica (EaO, n=12). Vinte e oito semanas após o protocolo experimental, a função cardíaca foi avaliada por ecocardiograma e músculo papilar isolado. A atividade da SERCA2a e do CCTL foi analisada durante a potenciação pós-pausa e elevação do cálcio, respectivamente, e pela administração cumulativa do CA2 extracelular na presença de bloqueadores específicos de SERCA2a ou CCTL no ensaio do músculo papilar isolado. A expressão das proteínas reguladoras de trânsito de cálcio foi medida pelo western blot (placebo, n=7; EaO, n=7). Cinco animais com EaO foram excluídos do experimento do músculo papilar isolado por terem uma área transversal do músculo papilar maior do que 1,5 mm2.

Outro grupo de ratos machos Wistar foi submetido à cirurgia de indução simulada (placebo, n=6) ou de estenose aórtica (EaO, n=6). Nesses animais, o eletrocardiograma foi realizado e os cardiomiócitos foram isolados. Uma análise dos cardiomiócitos isolados foi realizada para avaliar a função mecânica dos cardiomiócitos e o manejo do cálcio.

Como observado, a avaliação do ecocardiograma foi realizada em todos os animais (placebo, n=28; EaO, n=18).

Animais

Ratos Wistar obtidos do Centro Animal da Faculdade de Medicina de Botucatu (Botucatu, São Paulo, Brasil) foram inseridos em gaiolas coletivas a 23˚C, temperatura ambiente, em um ciclo claro-escuro de 12 horas, umidade relativa de 60% e água ad libitum. Esta pesquisa foi aprovada pelo Comitê de Ética em Pesquisa Experimental da Faculdade de Medicina de Botucatu – UNESP”, e pelo “Guia para o cuidado e uso de animais de laboratório” (protocolo 1138/2015).

Cirurgia de estenose aórtica

A EaO foi induzida cirurgicamente, como já descrito.[14] Os ratos foram anestesiados com uma mistura de cetamina (50 mg/kg, IM) e xilazina (1 mg/kg, IM), e o coração foi exposto por meio de uma toracotomia mediana. Um clip de prata (0,62 mm de diâmetro interno) foi colocado na aorta ascendente, a aproximadamente 3 mm de sua raiz, constituindo o grupo EaO (n=17). Os ratos controle foram submetidos à mesma cirurgia, porém, sem a bandagem da aorta (placebo, n=19).

Função cardíaca

Ecocardiograma

Dados da estrutura cardíaca e análise de função estão expressos com variáveis do ecocardiograma 28 semanas após a estenose aórtica. Uma ecocardiografia disponível no mercado (General Electric Medical Systems, Vivid S6, Tirat Carmel, Israel), equipada com uma sonda multifrequência de 5-11,5 MHz, foi utilizada, como descrito anteriormente.[17,25,26] Os ratos foram anestesiados por meio de uma injeção intraperitoneal, com uma mistura de cetamina (50 mg/kg) e xilazina (0,5 mg/kg). As seguintes variáveis foram utilizadas para avaliar a estrutura cardíaca: átrio esquerdo (AE) normalizado para o diâmetro da aorta (AE/Ao), diâmetro diastólico do ventrículo esquerdo (DDVE), diâmetro sistólico do ventrículo esquerdo (DSVE), espessura diastólica da parede posterior (EDPP), espessura diastólica do septo interventricular (EDSI) e espessura relativa da parede (ERP). Os seguintes parâmetros foram usados para avaliar a função ventricular: frequência cardíaca (FC), fração de encurtamento da parede média (FS); fração de ejeção (FE); velocidade sistólica da parede posterior (VSPP), velocidade de influxo mitral diastólico precoce (onda E); e pico de velocidade da onda A (contração atrial), velocidade anular mitral durante o enchimento ventricular precoce (E’), velocidade anular mitral durante a contração atrial (A’), e razão entre o fluxo de pico do enchimento e a velocidade anular mitral durante o enchimento ventricular precoce (E/E’).

Sinais da insuficiência cardíaca

O mesmo investigador analisou os sinais clínicos e patológicos da IC (taquipneia, ascite, efusão pleural, trombo em átrio esquerdo e hipertrofia ventricular direita), sem acesso aos grupos experimentais.

Ensaio isolado do músculo papilar

O desempenho contrátil do coração foi avaliado ao examinar os músculos papilares isolados do ventrículo esquerdo (VE), como descrito anteriormente.[14,17,25] Os músculos papilares foram estimulados 12 vezes por minuto (0,2 Hz), utilizando eletrodos do tipo agulha de platina posicionados paralelamente ao eixo longitudinal dos músculos. Os eletrodos foram acoplados a um estimulador elétrico (LE12406 - Stimulator, PanLab - Harvard Apparatus, Cornella, Barcelona, Espanha) que emite estímulos de onda quadrada de 5 ms. A voltagem do estímulo utilizado foi de 12 a 15 volts, aproximadamente 10% acima do valor mínimo necessário para provocar a resposta mecânica máxima do músculo. No experimento, a solução de Krebs-Henseleit foi utilizada de acordo com a seguinte composição em mM: 118,5 NaCl; 4,69 KCl; 2,5 CaCl2; 1,16 MgSO4; 1,18 KH2PO4; 5,50 de glicose e 24,88 NaHCO3. A solução foi aerada por 10 minutos com oxigênio a 95% (O2) e dióxido de carbono a 5% (CO2), e mantida a 28˚C. Os seguintes parâmetros mecânicos foram medidos durante a contração isométrica: pico de tensão desenvolvida (TD; g/mm2), tensão em repouso (TR; g/mm2), taxa máxima da tensão desenvolvida (+tD/td; g/ mm2/s) e declínio (-tD/td; g/mm2/s), e tempo de pico de tensão (TPT; ms). Mecanismos reguladores da entrada de Ca2 e a atividade do CCTL foram analisados pela manobra de elevação da concentração extracelular de Ca2, e elevação das concentrações extracelulares de Ca2 (0,5, 1,5, 2,5 e 3,5 mM) na presença e na ausência de diltiazem (10-5M), um bloqueador específico dos CCTL. Uma manobra de potenciação pós-pausa (o estímulo foi pausado por 10, 30 e 60 s antes de reiniciar a estimulação) e uma elevação das concentrações extracelulares de Ca2(0,5, 1,5, 2,5, e 3,5 mM) na presença e na ausência do ácido ciclopiazônico (CPA, 30 mM), um bloqueador altamente específico de SERCA2a, foram realizadas para avaliar o potencial da função de SERCA2a. Os ensaios do bloqueio dos CCTL e SERCA2a foram avaliados com base na porcentagem de inibição, calculada como Δ(%)= (M2-M1)/M1x100, de forma que M1 é o valor da variável na concentração extracelular de cálcio, na ausência do bloqueador, e M2 é o valor da mesma variável em resposta aos bloqueadores. Testes de elevação extracelular do cálcio e potenciação pós-pausa foram analisados pelo percentual de resposta comparado à linha de base, calculada como Δ(%)= (M0-Mx)/M0×100, de forma que M0 é o valor na condição de base, e Mx é o valor absoluto em resposta à manobra (concentração aumentada de cálcio ou paralisia do estímulo elétrico). Todas as variáveis foram normalizadas por área transversal do músculo papilar. Os músculos papilares com área transversal >1,5 mm2 foram excluídos da análise porque podem demonstrar hipóxia central e desempenho funcional prejudicado.[16,17]

Ensaio de cardiomiócitos isolados

Preparação dos cardiomiócitos

Sob anestesia, ratos de cada grupo foram eutanasiados. Os corações foram rapidamente removidos por toracotomia e isolados enzimaticamente, como descrito anteriormente.[27] Brevemente, os corações foram canulados. A perfusão retrógrada da aorta foi realizada em um sistema Lagendorff (37˚C), com solução tampão de digestão (TD) e isolamento modificada, uma solução livre de cálcio contendo 0,1 mM de etilenoglicol bis (ß-álcool aminoetílico)-N, N, N’, ácido N’-tetracético (EGTA), e N-[2-hidroxietil piperazina- N’ –[ácido 2- etanosulfónico)] (HEPES), que foram equilibradas. A composição da solução do TD foi a seguinte (mM): 130 NaCl, 1,4 MgCl2, 5,4 KCl, 25 HEPES, 22 de glicose, 0,33 NAH2PO4 e pH 7.39. Depois, os corações foram perfundidos por 15-20 minutos, com solução TD contendo 1 mg/ml de colagenase tipo II (Worthington Biochemical Corporation, Reino Unido) e Ca2(1 mM). Após a digestão, os corações foram removidos da cânula, cortados em pequenos pedaços e colocados em frascos cônicos com solução TD contendo colagenase suplementada com 0,1% de albumina de soro bovino e Ca2(1 mM). Em seguida, este processo foi realizado mais duas vezes sem a colagenase e com a adição de 1,6 e 3,12 µL de 1,0 mM da solução padrão CaCl2. Cada etapa contendo células e soluções foi incubada por aproximadamente 10 minutos. Então, o sobrenadante foi removido e os miócitos foram suspendidos novamente em solução de Tyrode contendo o seguinte (em mM): 140 NaCl, 10 HEPES, 0,33 NaH2PO4, 1 MgCl2, 5 KCl, 1,8 CaCl2, 10 de glicose. Somente cardiomiócitos tolerantes ao cálcio, quiescentes, em formato de haste, mostrando estriações transversais claras, foram examinados. Os cardiomiócitos isolados foram utilizados após 2 a 3 horas de isolamento.

Contratilidade em cardiomiócitos

De forma breve, células isoladas foram colocadas em uma câmara experimental com uma base de lamelas montada na mesa de um microscópio invertido (Ion Optix, Milton, MA, EUA), com sistema de detecção de bordas e lentes objetivas 40x (Nikon Eclipse – TS100, EUA). As células foram imersas em solução de Tyrode e o campo foi estimulado a 1 Hz (20 V, 5 ms de duração dos pulsos quadrados). O encurtamento das células em resposta ao estímulo elétrico foi mensurado por meio de um sistema de detecção de bordas em vídeo, com taxa de frames de 240-Hz (Ionwizard, Ion Optix, Milton, MA, EUA), e os parâmetros de contração foram avaliados. O comprimento do sarcômero, o encurtamento fracional (expresso como uma porcentagem do comprimento da célula em repouso), velocidade máxima de encurtamento (VME), velocidade máxima de relaxamento (VMR), assim como tempo até o encurtamento de 50% (tempo para pico de 50%), e tempo até o relaxamento de 50% (tempo para relaxamento de 50%) foram medidos em seis células por animal em cada grupo experimental.

Medidas de Ca2+ intracelular

Em seguida, os cardiomiócitos foram estimulados a 1Hz (Myopacer 100, Ion Optix Inc.), e as imagens fluorescentes foram obtidas com comprimento de onda de excitação alternando de 340 a 380 nm, utilizando um sistema Hyper Switch (IonOptix, Milton, MA). A emissão de fluorescência com subtração de background foi obtida, e a razão de Fura 2 AM foi utilizada como índice de transiente intracelular de [Ca2i, detectado em aproximadamente 510 nm. A amplitude do transiente de Ca2foi reportada como F/F0. F é a media de intensidade de fluorescência máxima medida no pico dos transientes de [Ca2i, e F0 é a intensidade base de fluorescência medida na fase diastólica dos transientes de [Ca2i. O tempo para o pico de [Ca2] e o tempo para a queda de 50% do Ca2também foram analisados.

Expressão das proteínas do trânsito de cálcio

A análise western blot foi usada para avaliar a expressão da proteína dos componentes reguladores do manejo do Ca2. Fragmentos do VE foram congelados em nitrogênio líquido e armazenados a -80˚C. Amostras congeladas foram, então, homogeneizadas em tampão RIPA contendo inibidores de protease (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) e fosfatase (Roche Diagnostics, Indianápolis, IN, EUA), utilizando um homogeneizador bead beater (Bullet Blender®, Next Advance, Inc., NY, EUA). O produto homogeneizado foi centrifugado (5804R Eppendorf, Hamburgo, Alemanha) a 12.000 rpm por 20 minutos, a 4˚C, e o sobrenadante foi transferido para tubos Eppendorf e armazenado a -80˚C. A concentração de proteína foi determinada utilizando um kit de ensaio da proteína BCA (Pierce). A SDS-PAGE foi usada para dissolver novamente um total de 25 μg de lisado de proteína de cada amostra. A eletroforese foi realizada com gel de empilhamento bifásico (240 mm Tris-HCl pH 6,8, 30% poliacrilamida, APS e TEMED) e redissolvida (240 mm Tris-HCl pH 8,8, 30% poliacrilamida, APS e TEMED) a uma concentração de 6 a 10%, dependendo do peso molecular da proteína analisada. O Kaleidoscope Prestained Standard (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA) foi usado para identificar o tamanho das bandas. A eletroforese foi realizada a 120 V (Power Pac HC 3.0 A, Bio-Rad, Hercules, CA, EUA) por 3 horas, com tampão (0.25 M Tris, 192 mM glicna, e 1% SDS). As proteínas foram transferidas para uma membrana de nitrocelulose (Armsham Biosciences, Piscataway, NJ, EUA), usando um sistema de mini trans-blot (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA) com tampão de transferência (25 mM Tris, 192 mM glicina, 20% metanol e 0,1% SDS). As membranas foram bloqueadas com 5% de leite em pó desnatado em tampão TBS-T (20 mM Tris-HCl pH 7,4, 137 mM NaCl e 0,1% Tween 20) por 120 minutos, em temperatura ambiente, sob constante agitação. A membrana foi lavada três vezes com TBS-T e incubada por 12 horas a 4 – 8˚C sob constante agitação, com os seguintes anticorpos primários: Serca2 ATPase (1:2500; ABR, Affinity BioReagents, Golden, CO, EUA), Fosfolambam (1:5000; ABR), Fosfo-Fosfolambam (Ser16) (1:5000; Badrilla, Leeds, West Yorkshire, Reino Unido), Fosfo–Fosfolambam (Thr17) (1:5000; Badrilla), Exchanger Na/Ca2 (1:2000; Upstate, Lake Placid, NY, EUA), Canal de Cálcio, Voltagem Alfa 1C (1:100; Chemicon International, Temecula, CA, EUA), Receptor de Rianodina (1:5000; ABR, Affinity Bioreagents, Golden, CO, EUA) e GAPDH (1:1000; Santa Cruz Biotechonology Inc., CA, EUA). Após a incubação com o anticorpo primário, as membranas foram lavadas três vezes em TBS-T e incubadas com anticorpos secundários conjugados com peroxidase (IgG anti-coelho ou anti-rato; 1: 5.000- 1: 10.000; Abcam) por 2 horas sob constante agitação. As membranas, então, foram lavadas três vezes com TBS-T para remover o excesso dos anticorpos secundários. Os blots foram incubados com ECL (Enhanced Chemi-Luminescence, Amersham Biosciences, Piscataway, Nova Jersey) para detecção da quimioluminescência pela ImageQuant™ LAS 4000 (GE Healthcare). A análise quantitativa dos blots foi realizada com o software Scion Image (Scion Corporation, Frederick, MD, EUA). Os imunoblots foram quantificados por densitometria utilizando o software ImageJ Analysis (NIH), e os resultados da banda alvo foram normalizados para a expressão do GAPDH do coração.[14] Não foi possível analisar o GAPDH (37 kDa) como normalizador no mesmo gel que o receptor de rianodina (565 kDa) devido à diferença no peso molecular entre as duas proteínas. Por isso, o receptor de rianodina é expresso sem normalização.

Análise estatística

A análise estatística foi realizada com o software Sigma Stat 3.5 (SYSTAT Software Inc., San Jose, CA, EUA). A distribuição das variáveis foi avaliada utilizando o teste de Kolmogorov-Smirnov para normalidade. De acordo com os dados de normalidade, os resultados são reportados como média ± desvio padrão (DP) ou mediana (percentil 25; percentil 75). As comparações entre os grupos foram realizadas com o teste t de Student bicaudal para amostras independentes, ou o teste te Mann-Whitney ou a análise variância com dois fatores de medidas repetidas (ANOVA), quando apropriado. O nível de significância foi considerado quando 5%.

O tamanho da amostra (n) foi estimado utilizando a equação para comparação entre grupos: n = 2SD2(Zα/2 + Zβ)2/d, no qual n é o tamanho da amostra, DP = 0,02 de estudos anteriores, Zα/2 = 1,96 (da tabela Z) com erro tipo 1 de 5%, Zβ = 0,842 (da tabela Z) com poder de 80% e = 0,02 (efeito do tamanho – diferença mínima entre os valores médios).[28] O tamanho da amostra necessário para detectar uma diferença significativa entre os grupos foi de 16 ratos por grupo; porém, decidimos usar 22 animais com simulação (placebo) e 18 induções de estenose aórtica (EaO) por grupo para o desenho do estudo.

Resultados

Avaliação do ecocardiograma e sinais de insuficência cardíaca

Os dados do ecocardiograma revelaram que a estenose aórtica resultou predominantemente em hipertrofia cardíaca concêntrica (↑ERP, ↑EDPP, ↑EDSI, e ↑DDVE), dilatação do átrio esquerdo (↑AE/Ao) e disfunção diastólica (↑onda E, ↑E/A, ↑E/E’, ↓E’, e ↓A’) e sistólica (↑DSVE, ↓VEPP, ↓FS e ↓FE) 28 semanas após a cirurgia (Tabela 1). Os seguintes sinais clínicos e patológicos da IC foram detectados: ascite (30%), trombo em átrio esquerdo (48%), efusão pleural (68%), taquipneia (79%) e hipertrofia ventricular direita (100%) (Tabela 1).

Tabela 1

– Dados do ecocardiograma e sinais de insuficiência cardíaca

	Placebo	EaO	Valor de p
FC (bpm)	302 ± 40	298 ± 40	0,857
DDVE (mm)*	7,55 (7,15; 7,66)	8,43 (7,27; 9,20)	<0,001
DSVE (mm)*	3,20 (2,81; 3,32)	3,83 (3,32; 5,62)	<0,001
EDPP (mm)*	1,53 (1,53; 1,65)	2,81 (2,55; 3,07)	<0,001
EDSI (mm)*	1,65 (1,53; 1,70)	3,07 (2,84; 3,26)	<0,001
ERP	0,43 ± 0,03	0,69 ± 0,16	<0,001
AE/Ao	1,22 ± 0,09	1,91 ± 0,18	<0,001
Onda E (cm/s)	85 ± 7	132 ± 18	<0,001
E/A	1,49 ± 0,18	5,13 ± 1,40	<0,001
E’ (cm/s)	6,20 ± 0,78	5,32 ± 0,89	<0,001
A’ (cm/s)	4,28 ± 0,67	3,12 ± 1,18	<0,001
E/E’	13,9 ± 2,22	25,2 ± 4,66	<0,001
VSPP (cm/s)	68 ± 9	37 ± 9	<0,001
FS (%)	26,1 ± 3,42	23,3 ± 4,69	0,028
FE (%)*	93 (92; 94)	89 (79; 92)	<0,001
Ascite (%)	0	30	-
TAE (%)	0	48	-
EP (%)	0	68	-
Taquipneia (%)	0	79	-
HVD (%)	0	100	-

Dados são expressos em média ± DP ou mediana (percentil 25; percentil 75)

Avaliação isolada do músculo papilar

Dados de base

A estenose aórtica prejudicou as funções de contração e relaxamento do miocárdio ao reduzir a tensão desenvolvida e a taxa máxima de tensão desenvolvida, e ao aumentar a tensão de repouso e o tempo do pico de tensão (Tabela 2).

Tabela 2

– Dados de base

	Placebo	EaO	Valor de p
ATV (mm2)	1,15 ± 0,16	1,18 ± 0,20	0,589
TD (g/mm2)	6,26 ± 1,58	5,18 ± 0,93	0,039
TR (g/mm2)	0,60 ± 0,20	0,80 ± 0,24	0,010
+tD/td (g/mm2/s)	66,6 ± 17,7	46,9 ± 10,3	0,001
-tD/td (g/mm2/s)	22,1 ± 5,24	23,9 ± 5,40	0,346
TPT (ms)#	180 (180; 185)	200 (180; 217)	0,007

Os dados são expressos como média ± DP ou mediana (percentil 25; percentil 75)

Manobras do músculo papilar isolado

A Figura 1A-C apresenta a porcentagem de resposta do músculo papilar à potenciação pós-pausa (10, 30 e 60 s). Animais com estenose aórtica apresentaram pouca resposta à manobra de potenciação pós-pausa em comparação aos animais no placebo para todos os períodos e variáveis avaliados. Não houve diferença significativa entre os grupos em nenhum período. A Figura 1D-F apresenta a porcentagem de resposta do músculo papilar para aumentar a concentração de cálcio extracelular (1,5; 2;5 e 3,5 mM). A Figura 2A-C mostra as respostas do músculo papilar à inibição de SERCA2a e um aumento na concentração de cálcio. Após a inibição de SERCA2a pelo ácido ciclopiazônico, houve diferença significativa entre os grupos na concentração de cálcio a 0,5 mM para o pico de tensão desenvolvida (Figura 2A). A taxa máxima de tensão desenvolvida e de declínio não demonstraram diferença entre os grupos EaO e placebo. A Figura 2D-F apresenta a resposta do músculo papilar à inibição do canal de cálcio tipo L, mostrando um aumento na concentração de cálcio. Animais com estenose aórtica tiveram pior desempenho na resposta à elevação do cálcio após o bloqueio do CCTL em comparação aos animais do placebo para todos os períodos e variáveis avaliados.

Figura 1

– Porcentagem de resposta à contração pós-repouso (1A, B e C) e elevação da concentração de cálcio extracelular (1D, E e F) desde a base (concentração de Ca2+: 0,5 mM). TD: pico de tensão desenvolvida; +tD/td: taxa máxima de tensão desenvolvida; -tD/td: taxa máxima do declínio da tensão. Os dados são expressos como media ± DP da porcentagem da manobra de resposta. Placebo: animais submetidos à cirurgia simulada (n=22). EaO: animais submetidos à cirurgia de estenose aórtica (n=12). Análise de variância para medidas repetidas e teste post-hoc de Bonferroni. *p< 0,05 vs. Placebo; †p< 0,05 vs. 10 segundos; ‡p< 0.05 vs. 10 segundos e 30 segundos (1A-C); †p< 0,05 vs. 1,5 Ca2+; ‡p< 0,05 vs. 1,5 e 2,5 Ca2+ (1D-F).

Figura 2

– Inibição da porcentagem de TD (pico de tensão desenvolvida), +dT/dt (taxa máxima de tensão desenvolvida) e -tD/td: taxa máxima do declínio da tensão para ácido ciclopiazônico (bloqueador de SERCA2a; figura 2A, B e C) e diltiazem (bloqueador dos canais de cálcio do tipo L); figura 2D, E e F) mais a concentração incremental de cálcio. Dados são expressos como média ± DP da porcentagem de resposta da manobra. Placebo: animais submetidos à cirurgia simulada (n=22). EaO: animais submetidos à cirurgia de estenose aórtica (n=12). Análise de variância para medidas repetidas e teste post-hoc de Bonferroni. *p< 0,05 vs. Sham; †p< 0,05 vs. 0,5 Ca2+; ‡p< 0,05 vs. 0,5, e 1,5 Ca2+; §p< 0,05 vs. 0,5, 1,5 e 2.5 Ca2+.

Cardiomiócitos isolados

Função mecânica e análise do manejo do cálcio

A Figura 3A-F mostra a função mecânica dos cardiomiócitos. A estenose aórtica afetou a VME (Figura 3B) e os tempos para alcançar 50% de contração dos cardiomiócitos (Figura 3E) e o pico de relaxamento (Figura 3F). A Figura 3G-J resume trânsito de cálcio 28 semanas após a estenose aórtica. Os animais com EaO apresentaram alterações nos tempos para alcançar o pico do Ca2e a queda de 50% de Ca2.

Figura 3

– A função mecânica dos cardiomiócitos e o manejo do cálcio do cardiomiócito. VME: velocidade máxima de encurtamento; VMR: velocidade máxima de relaxamento; TE50%: tempo para 50% de encurtamento; TR50%: tempo para 50% de relaxamento; TQC50%: Tempo para 50% de queda do Ca2+. Dados são expressos como média ± DP, ou mediana (percentil 25; percentil 75). Placebo: animais submetidos à cirurgia simulada (n=6; número de células: 36); EaO: animais submetidos à cirurgia de estenose aórtica (n=6; número de células = 36). Teste t de Student. *p< 0,05.

Expressão das proteínas do trânsito de cálcio

Os dados relacionados à expressão proteica dos elementos reguladores do trânsito de cálcio são demonstrados na Figura 4A-E. A estenose aórtica aumentou o CCTL, SERCA2a e a proteína de expressão do antiportador Na+/Ca2, e reduziu a fosforilação no resíduo Thr(17) da fosfolambam fosforilada (PLB).

Figura 4

– Expressão da proteína de manejo de cálcio. Dados são expressos como média ± DP. Placebo: animais submetidos à cirurgia simulada (n=7); EaO: animais submetidos à cirurgia de estenose aórtica (n=7). CCLT: canais de cálcio do tipo L; SERCA2a: retículo sarco/endoplasmático de Ca2+; PLB: Fosfolamban; PLBser16: fosfolambam fosforilada em serina 16; PLBthr17: fosfolambam fosforilada em treonina 17; NCX: antiportador Na+/Ca2+. Rianodina é expressa sem normalização. Teste t de Student. *p< 0.05.

Discussão

No modelo experimental da estenose aórtica supravalvular, estudos investigando o remodelamento patológico e a insuficiência cardíaca, com foco em alterações específicas do trânsito de cálcio e seus elementos reguladores, apresentaram dados escassos e uma reflexão superficial sobre os mecanismos. Assim, este trabalho realizou uma avaliação geral da função cardíaca, da dinâmica celular do Ca2, dos elementos reguladores do Ca2para elucidar o processo disfuncional dos principais componentes responsáveis pelo equilíbrio do Ca2e sua influência na função cardíaca na IC induzida por estenose aórtica.

Neste estudo, a estenose aórtica promoveu mudanças estruturais e disfunção ventricular, tanto diastólica quanto sistólica, como avaliado no ecocardiograma; resultados similares a estudos anteriores.[14,15,17,29] Animais com EaO desenvolveram hipertrofia concêntrica do ventrículo esquerdo e dilatação do átrio esquerdo, características marcantes neste modelo experimental de sobrecarga de pressão cardíaca.[1,14,15,17,29] Com base na Lei de Laplace (Estresse = Pressão x Raio/2 x Espessura), o aumento na espessura relativa da parede ventricular esquerda teve como intenção normalizar o estresse parietal sistólico devido à obstrução mecânica da aorta.[1,34,35] Porém, a diminuição da função sistólica sugere que mesmo após o processo de hipertrofia e o estresse parietal sistólico normalizado, a redução da capacidade contrátil foi responsável pela queda no desempenho sistólico. A função mecânica dos músculos papilares e dos cardiomiócitos reproduziu respostas similares ao exame ecocardiográfico. Animais com EaO apresentaram redução e menos habilidade de desenvolver força (↓TD e +tD/td), encurtar (↓VME e ↑TE50%) e relaxar (↑TR e TR50%). Este dano funcional ao músculo papilar isolado no estágio tardio da estenose aórtica está de acordo com nosso estudo anterior, que avaliou a doença cardíaca seis semanas após cirurgia.[16] Além disso, de acordo com os resultados dos cardiomiócitos isolados, os dados da literatura mostram que há uma redução na velocidade de encurtamento dos cardiomiócitos.[18] Em nossos animais, a queda cardíaca funcional resultou em IC, expressa pelos seguintes sinais clínicos e patológicos: padrão de respiração alterado, ascite, efusão pleural e trombo em átrio.

Neste modelo experimental, o processo patológico do remodelamento patológico pode induzir um déficit de oxigênio como ponto de partida. A rarefação capilar do miocárdio,[22] produto da hipertrofia da parede ventricular, pode representar a origem da patologia. Vários mecanismos podem ser estabelecidos e hiperativados para reajustar o padrão estrutural e funcional do coração, incluindo tônus simpático, o sistema renina-angiotensina-aldosterona, mediadores inflamatórios, estresse oxidativo e a regulação da expressão do gene do miocárdio via microRNAs.[36] Porém, a ativação não harmônica desses microssistemas devido às demandas cardíacas e corporais gera diversas respostas fisiopatológicas, incluindo danos ao manejo do cálcio dos cardiomiócitos.[1,34]

A incompatibilidade do Ca2citosólico em cardiomiócitos é um dos mecanismos chave para o mal funcionamento do coração em resposta a vários tipos de lesão.[1,4,39] Em modelos de IC, incluindo a estenose aórtica experimental, pesquisadores caracterizaram mudanças na expressão e função transmembrana, assim como proteínas intracelulares que regulam o trânsito de cálcio.[18,20,21,43] Neste estudo, o aumento de SERCA2a e na expressão da proteína NCX podem trazer uma resposta adaptativa para reduzir ou evitar a sobrecarga do Ca2 citosólico no fim da diástole. Esta resposta foi parcialmente eficiente, já que houve prejuízo de tempo para a queda do cálcio citosólico nos cardiomiócitos isolados; além disso, mesmo com o padrão compensatório molecular, o prejuízo funcional diastólico foi verificado em um tempo de relaxamento 50% menor (TR50%). Como neste estudo, a literatura mostra um aumento na expressão da proteína NCX na IC.[18,44] Porém, nossos resultados diferem com relação ao SERCA2a,[16,17] que, em geral, não mudam ou caem neste cenário da patologia.[18,44,45] É importante observar que a recaptação do Ca2pode reduzir a concentração deste íon no retículo sarcoplasmático (RS) com o passar do tempo.

Consequentemente, há uma redução na quantidade disponível para liberação,[4,44] via Rianodina, durante a sístole no mecanismo de liberação de Ca2induzida pelo Ca2dos CCTL. Neste estudo, observamos a expressão de proteína CCTL aumentada em animais com doença cardíaca. Porém, este processo adaptativo parece ser ineficiente, já que os cardiomiócitos dos animais tornaram mais lento o tempo para atingir o pico de Ca2, com consequente redução da velocidade máxima de encurtamento e aumento no tempo para atingir 50% do encurtamento. De acordo com a discussão anterior, Szymanska et al.[12] propuseram que na IC causada pela EaO há mudanças tanto na captação quanto na liberação do Ca2pelo RS, e que esses fatores podem contribuir para a deterioração da contração e relaxamento cardíaco.

As manobras no ensaio do músculo papilar isolado foram realizadas para verificar o dano fisiológico de dois dos principais elementos da dinâmica do Ca2neste processo patológico, SERCA2a e CCTL. O bloqueio do ácido ciclopiazônico e a potenciação pós-pausa foram utilizados para avaliar o potencial para recaptação do Ca2e a capacidade funcional de SERCA2a. Havia uma diferença na resposta entre as manobras para analisar a função de SERCA2a. A contração pós-repouso mostrou que o potencial para a recaptação do Ca2foi prejudicado pela estenose aórtica. Porém, após o bloqueio de SERCA2a devido ao ácido ciclopiazônico, os grupos placebo e EaO mostraram respostas similares às variáveis analisadas. Considerando que os animais com a cardiopatia demonstraram maior expressão da referida proteína, a porcentagem do bloqueio deve ter sido mais alta no grupo placebo, por ter menor quantidade de SERCA2a do que o grupo EaO. Porém, como o número de proteínas não bloqueadas no grupo EaO foi maior do que no grupo placebo, é possível considerar que este grupo remanescente de SERCA2a pós-bloqueio em animais com EaO demonstrou dano funcional.

Nossos dados estão de acordo com estudos anteriores, que sugerem a estenose aórtica como sendo indutor da deterioração funcional de SERCA2a.[11,12,16] Além disso, nossos achados mostram que a expressão aumentada de SERCA2a, o principal mantenedor da homeostase citosólica de Ca2, não foi suficiente para compensar pela redução na atividade intrínseca desta proteína; esta hipótese é reforçada pelo resultados deste estudo, que demonstraram tempo reduzido para atingir 50% da queda do cálcio em cardiomiócitos. Como SERCA2a é uma ATPase, sob condições de baixa adenosina trifosfato (ATP), a atividade intrínseca desta proteína poderia ser prejudicada, causando disfunção na recaptação do Ca2pelo RS.[45] Em favor desta hipótese, um estudo prévio feito pelo nosso grupo (esses resultados não estão publicados) mostrou que animais com EaO, duas semanas após cirurgia, apresentaram aumento no fator induzido por hipoxia-1 (HIF-1 α), indicador mais importante do déficit de oxigênio tecidual, que pode indicar uma redução na produção de ATP.

Além das alterações mencionadas anteriormente, este estudo identificou uma redução na forforilação de fosfolambam em treonina 17, sugerindo que o prejuízo da recaptação de Ca2 pode não só ser atribuído ao prejuízo funcional intrínseco de SERCA2a, mas também ao maior bloqueio desta proteína pela fosfolambam.

O bloqueio de diltiazem e a elevação de Ca2extracelular no músculo papilar mostrou que animais com doença cardíaca tinham a função CCTL prejudicada. Embora tenha havido um aumento na expressão de proteína desses canais, houve um aumento no tempo para alcançar o pico de Ca2em cardiomiócitos isolados, uma redução na VME e aumento no TE50%. Esses achados estão de acordo com os resultados da literatura, que mostram que o prejuízo cardíaco por EaO geram uma variante de splicing fetal (Cav1.2e21+22) que reduz a expressão e a atividade desses canais, e que aumenta a ubiquitinação de CCTL via degradação proteossomal.[21] Além disso, no remodelamento patológico pela EaO juntamente à redução de ICa, há ineficiência no acoplamento de CCTLs com receptores Rianodina, tanto devido à degradação de túbulos T quanto pela redução de junctofilina-2, a proteína responsável por ancorar o retículo sarcoplasmático à membrana celular.[20]

Limitações do estudo

Neste estudo, os cardiomiócitos não foram isolados somente no ventrículo esquerdo. Então, os resultados dos cardiomiócitos tanto dos ventrículos esquerdo como direito foram avaliados e discutidos. É importante enfatizar que um entendimento adequado da fisiologia cardíaca em estudos celulares requer conhecimento sobre a contratilidade ventricular, já que os ventrículos direito e esquerdo têm propriedades funcionais distintas. Assim, também seria relevante realizar uma análise molecular em ambos os ventrículos; porém, a expressão das proteínas do trânsito de cálcio apenas foi realizada no VE.

Conclusões

Nosso estudo buscou esclarecer e facilitar o entendimento sobre os eventos fisiopatológicos do trânsito de cálcio e sobre as mudanças em seus agentes reguladores principais no processo patológico cardíaco causado pela estenose aórtica. De acordo com nossos resultados, neste modelo experimental de IC, há mudanças relevantes na dinâmica do cálcio devido a alterações na expressão de NCX e SERCA2a, na expressão da proteína do CCTL, e redução da fosforilação do resíduo Thr(17) de PLB. Além disso, o dano funcional da SERCA2a e do CCTL foram essenciais para a deterioração contrátil e do relaxamento. Assim, é importante desenvolver tratamentos que foquem não só em SERCA2a e CCTL, mas também no entendimento de todos os processos patológicos para reequilibrar o fluxo do cálcio intracelular e a função cardíaca.

Introduction

Heart failure (HF) is characterized by the heart’s inability to perfuse tissues with oxygen and nutrients required by the body’s metabolic demand;[1] major outcomes include exercise intolerance and water retention.[2]The process of HF is the product of maladaptive remodelling, which may occur due to several types of damage to the heart, including myocardial ischaemia and volume and pressure overload.[3] Among others, impaired calcium (Ca2) handling is a crucial mechanism of the progressive deterioration of contractile function in HF.[4]

Researchers have reported changes in the expression and function of regulatory proteins of Ca2 handling in a variety of cardiovascular diseases.[5] In pathological remodelling induced by aortic stenosis, studies have identified, using different methods of surgical induction and periods of the disease, several distinct changes in the regulatory elements of Ca[2].[11,12,14] Initial studies have proposed that changes in sarcoplasmic reticulum Ca2 outflow and intake are related to cardiac dysfunction due to aortic stenosis.[11,12] Our previous studies evaluated rats with diastolic dysfunction after six and twelve weeks of aortic stenosis.[16,17] After six weeks, impairment in sarco/endoplasmic reticulum calcium ATPase (SERCA2a) activity without protein expression alteration was observed;[16]after twelve weeks, increased phosphorylation of the Ser(16) residue of PLB and reduced SERCA2a protein expression were observed.[17] Furthermore, in animals with HF after aortic obstruction,[19,21,24] the authors detected reduced Ca2 current (ICa),[21]inefficiency of the coupling of the LTCCs with the RyR receptors,[20] and alterations in calcium handling proteins.[19]

Because these investigations report scattered data regarding the structural and functional degree of cardiac remodelling and the corresponding adaptations of myocardial Ca2 dynamics, this study aimed to characterize the dysfunctional process of the major components responsible for Ca2 balance and its influence on cardiac function in HF induced by aortic stenosis. For this purpose, unlike previous studies, we performed a global cardiac evaluation of the animals after 28 weeks of aortic stenosis. This study performed cardiac function analysis at the cellular, tissue, and chamber levels, as well as examining Ca2 handling and the proteins responsible for cytosolic Ca2 balance, presenting divergent and surprising results compared to the currently available literature.

Methods

Study design

1) A group of twenty one-day-old male Wistar rats was submitted to simulated (Sham, n= 22) or aortic stenosis induction (AoS, n= 12) surgery. After 28 weeks of the experimental protocol, cardiac function was evaluated by echocardiogram and isolated papillary muscle. SERCA2a and L-type calcium channel activity was analysed during postrest contraction and calcium elevation, respectively, and by the cumulative administration of extracellular Ca2 in the presence of SERCA2a- or L-type calcium channel-specific blockers in the isolated papillary muscle assay. Expression of Ca2-handling regulatory proteins was measured by western blotting (sham, n= 7; AoS, n= 7). Five AoS animals were excluded from the isolated papillary muscle experiment due to the having a cross-sectional area of papillary muscle greater than 1.5 mm2.

2) Another group of twenty one-day-old male Wistar rats underwent simulated (Sham, n= 6) or aortic stenosis induction (AoS, n= 6) surgery. In these animals, electrocardiogram and was performed and cardiomyocytes were isolated. Analysis of the isolated cardiomyocytes was performed to assess the mechanical function of the cardiomyocytes and calcium handling.

As noted, echocardiogram evaluation was performed on all study animals (Sham, n= 28; AoS, n= 18).

Animals

Wistar rats obtained from the Animal Center of Botucatu Medical School (Botucatu, São Paulo, Brazil) were allocated to collective cages in a 23°C room temperature with a 12-h light/dark cycle, a relative humidity of 60%, and water ad libitum. This research was approved by the “Committee for Experimental Research Ethics of the Faculty of Medicine in Botucatu – UNESP” and by the “Guide for the Care and Use of Laboratory Animals” (protocol 1138/2015).

Aortic stenosis surgery

AoS was surgically induced as previously described.[14] Rats were anaesthetized using a mixture of ketamine (50 mg/kg, IM) and xylazine (1 mg/kg, IM), and the heart was exposed via a median thoracotomy. A silver clip (0.62 mm internal diameter) was then placed on the ascending aorta approximately 3 mm from its root, constituting the AoS group (n= 17). Control rats were submitted to the same surgery but without aortic banding (Sham, n= 19).

Cardiac function

Echocardiogram

Data from the cardiac structure and function analysis are expressed utilizing echocardiogram variables after 28 weeks of aortic stenosis. Commercially available echocardiography (General Electric Medical Systems, Vivid S6, Tirat Carmel, Israel) equipped with a 5-11.5 MHz multifrequency probe was used as previously described.[17,25,26] Rats were anaesthetized via intraperitoneal injection with a mixture of ketamine (50 mg/kg) and xylazine (0.5 mg/kg). The following variables were used to evaluate cardiac structure: LA normalized to the aortic diameter (LA/Ao), left ventricle diastolic diameter (LVDD), left ventricular systolic diameter (LVSD), posterior wall diastolic thickness (PWDT), interventricular septum diastolic thickness (ISDT), and relative wall thickness (RWT). The following parameters were used to assess ventricular function: heart rate (HR), mid-wall fraction shortening (FS); ejection fraction (EF); posterior wall systolic velocity (PWSV), early diastolic mitral inflow velocity (E wave), the ratio between E wave and atrial contraction flow peak (A wave), the velocity of the mitral annulus during early ventricular filling (E’), mitral velocity annulus during atrial contraction (A’), and the ratio between filling flow peak and mitral annulus velocity during early ventricular filling (E/E’).

Heart failure signs

The same investigator analysed clinical and pathological signs of HF (tachypnoea, ascites, pleural effusion, left atrium thrombi, and right ventricular hypertrophy) and was blinded to the experimental groups.

Isolated papillary muscle assay

Cardiac contractile performance was evaluated by examining isolated papillary muscles from the LV, as previously described.[14,17,25] The papillary muscles were stimulated 12 times per minute (0.2 Hz) using platinum needle-type electrodes positioned parallel to the muscles’ longitudinal axis. The electrodes were coupled to an electrical stimulator (LE12406 - Stimulator, PanLab - Harvard Apparatus, Cornella, Barcelona, Spain) that emits 5 ms square wave stimuli. The stimulus voltage used was 12 to 15 volts, approximately 10% above the minimum value necessary to provoke the muscle’s maximum mechanical response. In the experiment, Krebs-Henseleit solution was used according to the following composition in mM: 118.5 NaCl; 4.69 KCl; 2.5 CaCl2; 1.16 MgSO4; 1.18 KH2PO4; 5.50 glucose and 24.88 NaHCO3. The solution was aerated for 10 minutes with 95% oxygen (O2) and 5% carbon dioxide (CO2) and kept at 28°C. The following mechanical parameters were measured during isometric contraction: maximum developed tension (DT; g/mm2), resting tension (RT; g/mm2), maximum rate of tension development (+dT/dt; g/mm2/s) and decline (-dT/dt; g/mm2/s), and time-to-peak tension (TPT; ms). Regulatory mechanisms of Ca2 influx and L-type calcium channel activity were analysed by the Ca2 concentration extracellular elevation manoeuvre and elevation of extracellular Ca2 concentrations (0.5, 1.5, 2.5, and 3.5 mM) in the presence and absence of diltiazem (10-5M), a specific blocker of L-type calcium channels. A postrest contraction manoeuvre (the stimulus was paused for 10, 30, and 60 s before restarting the stimulation) and elevation of extracellular Ca2 concentrations (0.5, 1.5, 2.5, and 3.5 mM) in the presence and absence of cyclopiazonic acid (CPA, 30 mM), a highly specific blocker of SERCA2a, were performed to assess the potential of SERCA2a function. L-channel and SERCA2a calcium channel blocking assays were analysed from the percentage of inhibition, calculated as Δ(%)= (M2-M1)/M1x100, so that M1 is the value of the variable in the extracellular calcium concentration in the absence of the blocker, and M2 is the value of the same variable in response to the blockers. Tests of extracellular calcium elevation and postrest contraction were analysed by the percent response compared to baseline, calculated as Δ(%)= (M0-Mx)/M0×100, so that M0 is the value in the baseline condition, and Mx is the absolute value in response to the manoeuvre (increased calcium concentration or paralysis of the electrical stimulus). All variables were normalized per cross-sectional area (CSA) of the papillary muscle. Papillary muscles with CSA >1.5 mm2 were excluded from analysis because they can exhibit central core hypoxia and impaired functional performance.[16,17]

Isolated cardiomyocyte assay

Cardiomyocyte preparation

Under anaesthesia, rats from each group were euthanized. Hearts were quickly removed by median thoracotomy and enzymatically isolated, as previously described.[27] Briefly, the hearts were cannulated. Retrograde perfusion of the aorta was performed on a Langendorff system (37°C) with a modified isolation digestion buffer solution (DB), a calcium-free solution containing 0.1 mM ethylene glycol-bis (ß-aminoethyl ether)-N, N, N’, N’-tetraacetic acid (EGTA), and N-[2-hydro-ethyl]-piperazine-N’-[2-ethanesulfonic acid] (HEPES), which were equilibrated. The composition of DB solution was as follows (mM): 130 NaCl, 1.4 MgCl2, 5.4 KCl, 25 HEPES, 22 glucose, 0.33 NAH2PO4, and pH 7.39. Afterward, the hearts were perfused for 15-20 minutes with a DB solution containing 1 mg/ml collagenase type II (Worthington Biochemical Corporation, UK) and Ca2(1 mM). Digested hearts were then removed from the cannula, minced into small pieces, and placed into small conical flasks with DB solution containing collagenase supplemented with 0.1% bovine serum albumin and Ca2(1 mM). Next, this process was performed two more times without collagenase and with the addition of 1.6 and 3.12 µL of 1.0 mM CaCl2 stock solution. Each stage containing cells and solutions was incubated for approximately 10 minutes. Then, the supernatant was removed, and the myocytes were resuspended in Tyrode’s buffer containing the following (in mM): 140 NaCl, 10 HEPES, 0.33 NaH2PO4, 1 MgCl2, 5 KCl, 1.8 CaCl2, 10 glucose. Only calcium-tolerant, quiescent, rod-shaped cardiomyocytes showing clear cross-striations were examined. The isolated cardiomyocytes were used within 2-3 h of isolation.

Cardiomyocyte contractility

Briefly, isolated cells were placed in an experimental chamber with a glass coverslip base mounted on the stage of an inverted microscope (Ion Optix, Milton, MA, USA) edge detection system with a 40x objective lens (Nikon Eclipse – TS100, USA). Cells were immersed in Tyrode’s solution and field stimulated at 1 Hz (20 V, 5 ms duration square pulses). Cell shortening in response to electrical stimulation was measured using a video-edge detection system at a 240-Hz frame rate (Ionwizard, Ion Optix, Milton, MA, USA), and the contractile parameters were evaluated. Sarcomere length, fractional shortening (expressed as a percentage of resting cell length), maximum shortening velocity, maximum relaxation velocity, and time to 50% shortening (time to 50% peak) and 50% relaxation (time for 50% relaxation) were measured in 6 cells per animal in each experimental group.

Intracellular Ca2+ measurements

Subsequently, cardiomyocytes were stimulated at 1 Hz (Myopacer 100, Ion Optix Inc.), and fluorescence images were obtained with alternating excitation at 340 to 380 nm wavelengths using a Hyper Switch system (IonOptix, Milton, MA). Background-subtracted fluorescence emission was obtained, and the Fura 2 AM ratios were used as an index of intracellular [Ca2i transient, which was detected at approximately 510 nm. The Ca2transient amplitude was reported as F/F0. F is the maximal fluorescence intensity average measured at the peak of [Ca2i transients, and F0 is the baseline fluorescence intensity measured at the diastolic phase of [Ca2i transients. The time to Ca2peak and time to 50% Ca2 decay were also analysed.

Expression of calcium handling proteins

Western blot analysis was used to evaluate protein expression of the regulatory components of Ca2 handling. Fragments of the LV were frozen in liquid nitrogen and stored at -80°C. Frozen samples were subsequently homogenized in RIPA buffer containing protease (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) and phosphatase (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA) inhibitors using a bead beater homogenizer (Bullet Blender®, Next Advance, Inc., NY, USA). The homogenized product was centrifuged (5804R Eppendorf, Hamburg, Germany) at 12,000 rpm for 20 minutes at 4°C, and the supernatant was transferred to Eppendorf tubes and stored at -80°C. Protein concentration was determined using the Pierce BCA Protein Assay Kit. SDS-PAGE was used to resolve a total of 25 μg protein lysate from each sample. Electrophoresis was performed with biphasic gel stacking (240 mm Tris-HCl pH 6.8, 30% polyacrylamide, APS and TEMED) and resolving (240 mm Tris-HCl pH 8.8, 30% polyacrylamide, APS and TEMED) at a concentration of 6 to 10%, depending on the molecular weight of the analysed protein. The Kaleidoscope Prestained Standard (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) was used to identify band sizes. Electrophoresis was performed at 120 V (Power Pac HC 3.0 A, Bio-Rad, Hercules, CA, USA) for 3 h with running buffer (0.25 M Tris, 192 mM glycine, and 1% SDS). Proteins were transferred to a nitrocellulose membrane (Armsham Biosciences, Piscataway, NJ, USA) using a Mini Trans-Blot (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) system with transfer buffer (25 mM Tris, 192 mM glycine, 20% methanol, and 0,1% SDS). Membranes were blocked with 5% non-fat dry milk in TBS-T buffer (20 mM Tris-HCl pH 7.4, 137 mM NaCl, and 0.1% Tween 20) for 120 minutes at room temperature under constant agitation. The membrane was washed three times with TBS-T and incubated for 12 h at 4 - 8°C under constant agitation with the following primary antibodies: Serca2 ATPase (1:2500; ABR, Affinity BioReagents, Golden, CO, USA), Phospholamban (1:5000; ABR), Phospho-Phospholamban (Ser16) (1:5000; Badrilla, Leeds, West Yorkshire, UK), Phospho–Phospholamban (Thr17) (1:5000; Badrilla), Exchanger Na/Ca2 (1:2000; Upstate, Lake Placid, NY, USA), Calcium Channel, Voltage-Gated Alpha 1C (1:100; Chemicon International, Temecula, CA, USA), Ryanodine Receptor (1:5000; ABR, Affinity Bioreagents, Golden, CO, USA), and GAPDH (1:1000; Santa Cruz Biotechonology Inc., CA, USA). After incubation with the primary antibody, membranes were washed three times in TBS-T and incubated with peroxidase-conjugated secondary antibodies (anti-rabbit or anti-mouse IgG; 1: 5,000- 1: 10,000; Abcam) for 2 h under constant agitation. Membranes were then washed three times with TBS-T to remove excess secondary antibody. Blots were incubated with ECL (Enhanced Chemi-Luminescence, Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) for chemiluminescence detection by ImageQuant™ LAS 4000 (GE Healthcare). Quantification analysis of blots was performed using Scion Image software (Scion Corporation, Frederick, MD, USA). The immunoblots were quantified by densitometry using ImageJ Analysis software (NIH), and target band results were normalized to the expression of cardiac GAPDH.[14] It was not possible to analyse GAPDH (37 kDa) as a normalizer on the same gel as the ryanodine receptor (565 kDa) due to the difference in molecular weight between the two proteins. Due to this, the ryanodine receptor is expressed without normalization.

Statistical analysis

Statistical analysis was performed using Sigma Stat 3.5 software (SYSTAT Software Inc., San Jose, CA, USA). The distribution of variables was assessed using the Kolmogorov-Smirnov test for normality. According to the normality of the data, the results are reported as the means ± standard deviation (SD) or median (25th percentile; 75th percentile). Comparisons between groups were performed using two-tailed Student’s t-test for independent samples or Mann-Whitney test or repeated-measures two-way analysis of variance (ANOVA) when appropriate. The level of significance considered was 5%.

Sample size (n) was estimated using the equation for comparison between groups: n = 2SD2(Zα/2 + Zβ)2/d, where n is the sample size, SD = 0.02 from previous studies, Zα/2 = 1.96 (from Z table) at type 1 error of 5%, Zβ = 0.842 (From Z table) at 80% power and d = 0.02 (effect size - minimal difference between mean values).[28] The sample size needed to detect a significant difference between groups was 16 rats per group; however, we decided to use 22 simulated (sham) and 18 aortic stenosis induction (AoS) animals per group for the study design.

Results

Echocardiographic evaluation and heart failure signs

Echocardiogram data revealed that aortic stenosis resulted in predominantly concentric cardiac hypertrophy (↑RWT, ↑PWDT, ↑ISDT, and ↑LVDD), left atrium dilation (↑LA/Ao), and diastolic (↑E wave, ↑E/A, ↑E/E’, ↓E’, and ↓A’) and systolic dysfunction (↑LVSD, ↓PWSV, ↓FS, and ↓EF) 28 weeks after surgery (Table 1). The following clinical and pathological signs of HF were detected: ascites (30%), left atrium thrombi (48%), pleural effusion (68%), tachypnoea (79%), and right ventricular hypertrophy (100%) (Table 1).

Table 1

– Echocardiogram data and heart failure signs

	Sham	AoS	p-value
HR (bpm)	302 ± 40	298 ± 40	0.857
LVDD (mm)*	7.55 (7.15; 7.66)	8.43 (7.27; 9.20)	<0.001
LVSD (mm)*	3.20 (2.81; 3.32)	3.83 (3.32; 5.62)	<0.001
PWDT (mm)*	1.53 (1.53; 1.65)	2.81 (2.55; 3.07)	<0.001
ISDT (mm)*	1.65 (1.53; 1.70)	3.07 (2.84; 3.26)	<0.001
RWT	0.43 ± 0.03	0.69 ± 0.16	<0.001
LA/Ao	1.22 ± 0.09	1.91 ± 0.18	<0.001
E wave (cm/s)	85 ± 7	132 ± 18	<0.001
E/A	1.49 ± 0.18	5.13 ± 1.40	<0.001
E’ (cm/s)	6.20 ± 0.78	5.32 ± 0.89	<0.001
A’ (cm/s)	4.28 ± 0.67	3.12 ± 1.18	<0.001
E/E’	13.9 ± 2.22	25.2 ± 4.66	<0.001
PWSV (cm/s)	68 ± 9	37 ± 9	<0.001
FS (%)	26.1 ± 3.42	23.3 ± 4.69	0.028
EF (%)*	93 (92; 94)	89 (79; 92)	<0.001
Ascites (%)	0	30	-
LAT (%)	0	48	-
PE (%)	0	68	-
Tachypnea (%)	0	79	-
RVH (%)	0	100	-

Data are expressed as means ± SD or median (25 percentile; 75 percentile)

Isolated papillary muscle evaluation

Baseline data

Aortic stenosis impaired myocardial contractile and relaxation function by reducing developed tension and the maximum rate of tension development and increasing rest tension and time-to-peak tension (Table 2).

Table 2

– Baseline data

	Sham	AoS	p-value
CSA (mm2)	1.15 ± 0.16	1.18 ± 0,20	0.589
DT (g/mm2)	6.26 ± 1,58	5.18 ± 0.93	0.039
RT (g/mm2)	0.60 ± 0.20	0.80 ± 0.24	0.010
+dT/dt (g/mm2/s)	66.6 ± 17.7	46.9 ± 10.3	0.001
-dT/dt (g/mm2/s)	22.1 ± 5.24	23.9 ± 5.40	0.346
TPT (ms)#	180 (180; 185)	200 (180; 217)	0.007

Data are expressed as means ± SD or median (25 percentile; 75 percentile)

Isolated papillary muscle manoeuvres

Figure 1A-C presents the papillary muscle response percentage to postrest contraction (10, 30, and 60 s). Animals with aortic stenosis exhibited a poor response to the postrest contraction manoeuvre compared to sham animals for all evaluated time points and variables. There was no significant difference between groups at any time point. Figure 1D-F presents the percent papillary muscle response to increase extracellular calcium concentration (1.5, 2.5, and 3.5 mM). Figure 2A-C shows papillary muscle responses to SERCA2a inhibition and an increase in calcium concentration. After SERCA2a inhibition by cyclopiazonic acid, there was a significant difference between groups in calcium concentration at 0.5 mM for maximum developed tension (Figure 2A). The maximum rate of tension development and decline did not exhibit a difference between the AoS and sham groups. Figure 2D-F presents the papillary muscle response to L-type calcium channel inhibition, demonstrating an increase in calcium concentration. Animals with aortic stenosis had worse performance in response to calcium elevation after L-type calcium channel blockage than sham animals for all evaluated time points and variables.

Figure 1

– Response percentage to post-rest contraction (1A, B, and C) and elevation of extracellular calcium concentration (1D, E, and F) from baseline (Ca2+ concentration: 0.5 mM). DT: maximum developed tension; +dT/dt: maximum rate of tension development; -dT/dt: maximum rate of tension decline. Data are expressed as means ± SD of maneuver response percentage. Sham: animals submitted to simulated surgery (n= 22); AoS: animals submitted to aortic stenosis surgery (n= 12). Analysis of variance for repeated measures and Bonferroni post-hoc test. *p< 0.05 vs Sham; †p< 0.05 vs. 10 seconds; ‡p< 0.05 vs. 10 seconds and 30 seconds (1A-C); †p< 0.05 vs. 1.5 Ca2+; ‡p< 0.05 vs. 1.5 and 2.5 Ca2+ (1D-F).

Figure 2

– Inhibition percentage of DT (maximum developed tension), +dT/dt (maximum rate of tension development), and –dT/dt (maximum rate of tension decline) to cyclopiazonic acid (SERCA2a blocker; figure 2A, B, and C) and diltiazem (L-type calcium channels blocker; figure 2D, E, and F) plus incremental calcium concentration. Data are expressed as means ± SD of maneuver response percentage. Sham: animals submitted to simulated surgery (n= 22); AoS: animals submitted to aortic stenosis surgery (n= 12). Analysis of variance for repeated measures and Bonferroni post-hoc test. *p< 0.05 vs Sham; †p< 0.05 vs. 0.5 Ca2+; ‡p< 0.05 vs. 0.5, and 1.5 Ca2+; §p< 0.05 vs. 0.5, 1.5, and 2.5 Ca2+.

Isolated cardiomyocytes

Mechanical function and calcium handling analysis

Figure 3A-F shows cardiomyocyte mechanical function. Aortic stenosis impaired shortening maximum velocity (Figure 3B) and times to achieve 50% cardiomyocyte contraction (Figure 3E) and relaxation peak (Figure 3F). Figure 3G-J summarizes calcium handling 28 weeks after aortic stenosis. AoS animals presented alterations in both the time to achieve Ca2 peak and time to 50% Ca2 decay.

Figure 3

– Cardiomyocytes mechanical function and cardiomyocyte calcium handling. SMV: shortening maximum velocity; RMV: relaxation maximum velocity; TS50%: time to 50% shortening; TR50%: time to 50% relaxation; TCD50%: time to 50% of Ca2+ decay. Data are expressed as means ± SD or median (25 percentile; 75 percentile). Sham: animals submitted to simulated surgery (n= 6; number of cells= 36); AoS: animals submitted to aortic stenosis surgery (n= 6; number of cells= 36). Student’s t-test. *p< 0.05.

Expression of calcium handling proteins

Data regarding protein expression of calcium handling regulator elements are shown in Figure 4A-E. Aortic stenosis increased L-type calcium channel, SERCA2a, and Na+/Ca2exchanger (NCX) protein expression and decreased phosphorylation of the Thr(17) residue of PLB.

Figure 4

– Expression of calcium handling protein. Data are expressed as means ± SD. Sham: animals submitted to simulated surgery (n= 7); AoS: animals submitted to aortic stenosis surgery (n= 7). LTCC’s: L-type calcium channels; SERCA2a: Sarco/endoplasmic reticulum Ca2+; PLB: Phospholamban; PLBser16: phosphorylated phospholamban at serine 16; PLBthr17: phosphorylated phospholamban at threonine 17; RyR: Ryanodine; NCX: Na+/Ca2+ exchanger. Ryanodine is expressed without normalization. Student’s t-test. *p< 0.05.

Discussion

In the experimental model of supravalvular aortic stenosis, studies investigating pathologic remodelling and HF, focusing on specific Ca2 handling alterations and their regulatory elements, have presented scattered data and a poor mechanistic reflection. As such, this work performed an overall evaluation of cardiac function, Ca2 cellular dynamics, and Ca2 regulatory elements to elucidate the dysfunctional process of the major components responsible for Ca2 balance and its influence on cardiac function in HF induced by aortic stenosis.

In this study, aortic stenosis promoted structural changes and ventricular dysfunction, both diastolic and systolic, as assessed by echocardiogram, similar to previous studies.[14,15,17,29] AoS animals developed concentric left ventricular hypertrophy and left atrial dilation, striking characteristics in this experimental cardiac pressure overload model.[1,14,15,17,29] Based on Laplace’s law (Stress = Pressure x Radius/2 x Thickness), the increase in the left ventricular relative wall thickness was intended to normalize systolic parietal stress due to mechanical aortic obstruction.[1,34,35] However, the decrease in systolic function suggests that even after the hypertrophic process, the systolic parietal stress had likely normalized, and the decrease in contractile capacity was responsible for the depression of systolic performance. The mechanical function of the papillary muscles and cardiomyocytes reproduced similar responses to the echocardiographic examination. AoS animals presented a decreased and slower ability to develop force (↓DT and +dT/dt), to shorten (↓SMV and ↑TS50%) and to relax (↑RT and TR50%). This functional damage to the isolated papillary muscle in the late stage of aortic stenosis is in line with our previous study, which analysed heart disease six weeks after surgery.[16] In addition, in agreement with the isolated cardiomyocyte results, data from the literature show that there is a decrease in the shortening velocity of cardiomyocytes.[18] In our animals, functional cardiac depression resulted in severe HF, expressed by the following clinical and pathological signs: altered breathing pattern, ascites, pleural effusion, and atrial thrombus.

In this experimental model, the pathological process of maladaptive remodelling may induce an oxygen deficit as a starting point. Myocardial capillary rarefaction,[22] a marked ventricular wall hypertrophy product, may represent the origin of pathology. Several mechanisms may be enacted and hyperactivated to readjust the cardiac structural and functional pattern, including sympathetic tonus, the renin-angiotensin-aldosterone system, inflammatory mediators, oxidative stress, and the regulation of myocardial gene expression via microRNAs.[36] However, the disharmonic activation of these microsystems due to cardiac and body demands generates numerous pathophysiological responses, including impairments in the calcium handling of cardiomyocytes.[1,34]

Mismatch of cytosolic Ca[2] in cardiomyocytes is one of the key mechanisms for cardiac malfunction in response to various injury types.[1,4,39] In HF models, including experimental aortic stenosis, researchers have characterized changes in transmembrane expression and function, as well as the intracellular proteins that regulate Ca2 handling.[18,20,21,43] In the present study, the increase in SERCA2a and NCX protein expression may have been an adaptive response to decrease or avoid cytosolic Ca2 overload at the end of diastole. This response was partially efficient since there was impairment of time for cytosolic calcium decay in the isolated cardiomyocytes; in addition, even with the molecular compensatory pattern, diastolic functional impairment was verified a reduced 50% relaxation time (TR50%). As in this study, the literature shows an increase in NCX protein expression in HF.[18,44] However, our results differ with respect to SERCA2a,[16,17] which, generally, is unchanged or decreased in this pathological scenario.[18,44,45] It is important to note that slow Ca2 reuptake may decrease the concentration of this ion in the sarcoplasmic reticulum (SR) over time.

Consequently, there is a decrease in the amount available for release,[4,44] via RyR, during systole in the Ca2 release mechanism induced by Ca2 from LTCC. In the present study, we observed increased LTCC protein expression in animals with heart disease. However, this adaptive process seems to have been inefficient since the animals’ cardiomyocytes slowed the time to achieve peak Ca2 with consequent reduction of the shortening maximum velocity and increase in the time to reach 50% of the shortening. Converging with the discussion above, Szymanska et al.[12] proposed that in HF due to aortic stenosis, there are changes in both the uptake and release of Ca2 by the SR and that these factors may contribute to deterioration of the processes of cardiac contraction and relaxation.

The manoeuvres in the isolated papillary muscle assay were performed to ascertain the physiological damage of two of the main elements of Ca2 dynamics in this pathological process, SERCA2a and LTCC. Cyclopiazonic acid (CPA) blockade and postrest contraction was used to evaluate the potential for Ca2 reuptake and the functional capacity of SERCA2a. There was a difference in response between the two manoeuvres to analyse the function of SERCA2a. Post-rest contraction showed that the potential for Ca2 reuptake was impaired by aortic stenosis. However, after SERCA2a blockade by CPA, the sham and AoS groups showed similar responses to the variables studied in the analysis. Considering that the cardiopathy animals exhibited higher expression of the referenced protein, the blocking percentage must have been higher in the sham group due to having a lower number of SERCA2a than the AoS group. However, as the number of unblocked proteins in the AoS group was higher than in the sham group, it is possible to infer that this remaining group of SERCA2a postblock AoS animals demonstrated functional impairment.

Our data agree with previous studies that suggest aortic stenosis as an inducer of SERCA2a functional deterioration.[11,12,16] Furthermore, our findings show that increased expression of SERCA2a, the primary maintainer of cytosolic Ca2 homeostasis, was not sufficient to compensate for the decrease in intrinsic activity of this protein; this hypothesis is reinforced by the results of this study, which demonstrated a diminished time to achieve 50% calcium decay in cardiomyocytes. Because SERCA2a is an ATPase, under conditions of low ATP, the intrinsic activity of this protein could be impaired, causing disrupted Ca2 reuptake by the SR.[45] In favour of this hypothesis, a previous study by our group (these results are not published) showed that AoS animals, after two weeks of surgery, present an increase in hypoxia-inducible factor- alpha (HIF-1α), the most important indicator of tissue oxygen deficit, which may indicate a reduction in the production of adenosine triphosphate (ATP).

In addition to the alterations mentioned above, this study identified a decrease in phosphorylation of phospholambam at threonine 17, suggesting that the impairment of Ca2 reuptake may not be attributed only to the intrinsic functional impairment of SERCA2a but also to the increased blockage of this protein by phospholambam.

Diltiazem blockade and elevation of extracellular Ca2 in the papillary muscle showed that animals with heart disease had impaired LTCC function. Although there was an increase in the protein expression of these channels, there was an increase in the time to achieve the Ca2peak in the isolated cardiomyocytes, a reduction in SMV and an increase in TS50%. These findings agree with the body of evidence in the literature, which shows that cardiac injury by AoS generates a foetal splicing variant (Cav1.2e21+22) that reduces the expression and activity of these channels and increases the ubiquitination of LTCCs via proteasomal degradation.[21] Furthermore, in pathological remodelling by AoS coupled with decreased ICa, there is inefficiency in the coupling of LTCCs with RyR receptors, both due to the degradation of T tubules and the decrease in junctophillin-2, the protein responsible for anchoring the sarcoplasmic reticulum to the cell membrane.[20]

Limitations of the study

In this study, cardiomyocytes were not isolated only from the left ventricle. Thus, the results of cardiomyocytes from both the left and right ventricles were analysed and discussed. It is important to highlight that a proper understanding of cardiac physiology in cellular studies requires ventricular contractility knowledge since the right and left ventricles have distinct functional properties. In this regard, it would also be relevant to perform molecular analysis in both ventricles; however, the expression of calcium handling proteins was only performed in the LV.

Conclusions

Our study sought to clarify and facilitate understanding of the pathophysiological events in Ca2 handling and changes in its primary regulatory agents in the cardiac pathological process due to aortic stenosis. According to our results, in this HF experimental model, there are essential changes in calcium dynamics due to alterations in NCX and SERCA2a expression, L-type calcium channel protein expression, and reduced phosphorylation of the Thr(17) residue of PLB. Furthermore, SERCA2a and L-type calcium channel functional impairment were fundamental for contractile and relaxation deterioration. Therefore, it is important to develop therapies that focus not only on SERCA2a and L-type calcium channels but also on understanding all pathological processes to rebalance intracellular calcium flow and cardiac function.