Reduced Systemic Nitric Oxide Bioavailability Parallels Microvascular Endothelial Dysfunction during Cardiopulmonary Bypass.

Introdução

O bypass cardiopulmonar (BCP) é atualmente realizado em lactentes e recém-nascidos para correção cirúrgica de cardiopatias congênitas (CCs). O procedimento expõe o corpo a condições não fisiológicas extremas, que iniciam uma resposta inflamatória sistêmica acompanhada por disfunção vasomotora, e podem levar à disfunção múltipla de órgãos. Além disso, o BCP está relacionado à ativação e lesão de células endoteliais, que se está associada à resposta inflamatória global, desencadeamento do sistema de coagulação e subsequente disfunção de órgãos, não somente em pacientes adultos, mas particularmente em lactentes e recém-nascidos.

A disfunção microvascular sistêmica durante o BCP resulta em fluxo sanguíneo, perfusão de órgãos, e oxigenação tecidual inadequados. Nós mostramos, utilizando monitoramento de perfusão por laser Doppler (LDPM, do inglês laser Doppler perfusion monitoring), que consiste em um método não invasivo acoplado com aquecimento local da pele, que o leito microcirculatório da pele da testa é um modelo apropriado para o estudo da reatividade microvascular e perfusão tecidual na cirurgia cardiovascular com BCP em adultos. De fato, a hiperemia térmica local (HTL) é um método útil na avaliação da função endotelial microvascular sistêmica., Além disso, utilizando LDPM, demonstramos a ocorrência de disfunção microvascular e hipoperfusão durante o BCP na correção cirúrgica de doença cardíaca congênita em lactentes e crianças, apesar de parâmetros macrohemodinâmicos adequados. O descompasso entre a microcirculação e a macrocirculação em pacientes graves com choque séptico ou cardiogênico, o que pode prejudicar o manejo clínico adequado desses pacientes, tem estimulado a busca por novos métodos para monitorar a perfusão da microcirculação em unidades de terapia intensiva.

Vale ressaltar que a liberação de óxido nítrico (NO) a partir do óxido nítrico-sintase endotelial (eNOS) está reduzida durante o BCP em pacientes adultos. O NO é um potente vasodilatador derivado do endotélio, e sua depleção durante BCP sob fluxo não pulsátil pode levar à vasoconstrição, e consequentemente à diminuição na perfusão de órgãos. NOx (NO2– / NO3–) plasmáticos, metabólitos estáveis do NO, têm sido usados como marcadores da biodisponibilidade de NO sistêmico, uma vez que seus níveis refletem mudanças na atividade de eNOS em humanos. Assim, o objetivo do presente estudo foi investigar se uma redução na biodisponibilidade sistêmica de NO está associada com disfunção microvascular dependente do endotélio em lactentes e crianças, durante cirurgia cardíaca com circulação extracorpórea para correção de CC acianótica.

Métodos

Este estudo observacional longitudinal incluiu 47 pacientes pediátricos consecutivos com CCs acianóticas, com idade entre um mês e nove anos, submetidos à cirurgia cardíaca corretiva em um hospital público terciário no Brasil. O estudo foi conduzido de acordo com a declaração de Helsinki, e foi aprovado pelo comitê de ética da instituição. Os pais ou os responsáveis legais pelos participantes do estudo assinaram um termo de consentimento. Os procedimentos anestésicos ocorreram sob BCP, com hipotermia leve a moderada (32-34° C). A pressão arterial média foi mantida entre 45 e 60mmHg.

Avaliação do fluxo e reatividade microvascular

A reatividade microvascular da pele foi avaliada usando um sistema de LDPM (Periflux 5001, Perimed, Järfälla, Suécia), que mede, em um único ponto, o fluxo microvascular utilizando uma sonda laser para aquecimento (PF 457, Perimed). Mudanças na perfusão microvascular foram registradas em Unidades Arbitrárias (UA = 10mV). A sonda foi posicionada na testa no início dos procedimentos anestésicos e o fluxo microvascular basal medido durante 20 minutos de aquecimento local da sonda laser a 42oC (HTL). A vasodilatação máxima foi expressa em Condutância Vascular Cutânea, calculada como a razão entre fluxo microvascular, em UA, e a pressão arterial média (UA/mmHg). Os valores médios de fluxo microvascular (em UA) antes e durante o BCP foram usados nos cálculos. Após a avaliação basal, a resposta microvascular à HTL também foi registrada após indução da anestesia geral e 15 minutos após início do BCP.

Avaliação da biodisponibilidade sistêmica do NO

A biodisponibilidade sistêmica do NO foi avaliada utilizando concentrações plasmáticas de NOx (NO2- / NO3-), que foram usadas como um índice de formação de NO in vivo. As concentrações plasmáticas de NOx foram determinadas após indução anestésica e imediatamente após conclusão de BCP usando um teste colorimétrico (Cayman Chemical Company, Ann Arbor, Michigan, EUA) com sensibilidade de 2,5μM, e um coeficiente de variação intraensaio de 2,7%. Cada amostra de plasma foi medida em duplicata.

Análise estatística

Os resultados foram apresentados como medianas (intervalo interquartil). O teste de Shapiro-Wilk foi usado para testar a normalidade dos dados. Os resultados foram analisados com teste dos postos sinalizados de Wilcoxon bicaudal para amostras pareadas, usando o programa GraphPad Prism 7.0 (GraphPad Software INC., San Diego, California, EUA). Um valor de p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

As características basais dos pacientes incluídos no estudo e os parâmetros cirúrgicos estão apresentados na Tabela 1. Os valores médios de pressão arterial foram 58,4 ± 11,5 mmHg antes do BCP e 50,9 ± 8,4 mmHg durante o BCP (p=0,01). Antes do BCP, os níveis plasmáticos de NOx foram 51,4 (24,2-75,8) µM, os quais foram reduzidos significativamente para 45,1 (31,0-66,5) µM após BCP (p=0,03; Figura 1A).

Tabela 1

Características clínicas e dados cirúrgicos dos pacientes (n=47)

Parâmetros
Sexo masculino n (%)		19 (40,4)
Idade (meses)		16 (9 - 54)
Peso (Kg)		8 (6 - 16)
Tempo de BCP (min)		85 (75 - 105)
Temperatura durante o BCP (°C)		32 (32-33)
Taxa de fluxo da bomba (mL/Kg/min)		150 (120 - 150)
Tempo de clampeamento aórtico (min)		67 ± 28
Tipo de cardiopatia n (%)
	Defeito do septo atrial	3 (6,4)
Defeito do septo ventricular		16 (34)
	Canal atrioventricular (parcial ou total)	15 (32)
	Interrupção do arco aórtico	1 (2,1)
	Truncus arteriosus	1 (2,1)
Lesões mistas		11 (23,4)
Escore RACHS-1 n (%)
Categoria de risco 1		3 (6,4)
Categoria de risco 2		21 (44,7)
Categoria de risco 3		21 (44,7)
Categoria de risco 4		2 (4,2)

Dados apresentados em média ± desvio padrão ou medianas (percentis 25 - 75) para valores que não apresentaram distribuição gaussiana (teste de normalidade de Shapiro-Wilk); BCP: bypass cardiopulmonar; RACHS-1: escore de risco ajustado para cirurgia de cardiopatia congênita

Figura 1

(A) Concentrações plasmáticas totais de NOx (NO2– / NO3–) antes do bypass cardiopulmonar (BCP) (pré-BCP) e após o BCP (pós-BCP). (B) picos de resposta de vasodilatação microvascular da pele induzida por hiperemia térmica local, expressa por condutância vascular cutânea [unidades arbitrárias (UA)/pressão arterial média (mmHg)] antes do BCP (pré-BCP) e 15 minutos após o início do BCP. (C) Área sob a curva das respostas vasodilatadoras induzidas por hiperemia térmica local antes do BCP (pré-BCP) e 15 minutos após o início do BCP. Valores expressos em diagrama de caixa e limites inferior e superior, em que a linha central representa o valor mediano, a caixa contém os percentis 25 e 75 do conjunto de dados. Resultados analisados pelo teste dos postos sinalizados de Wilcoxon para amostras pareadas.

Não houve mudança significativa na condutância microvascular basal mediana antes do BCP [0,47 (0,35-0,64) APU/mmHg] e durante do BCP (p=0,85). Por outro lado, o aumento dependente do endotélio na condutância microvascular, induzido pela hiperemia térmica, foi reduzido durante o BCP em comparação aos valores obtidos antes do BCP (Figura 1B). Os valores absolutos máximos da condutância microvascular durante a HTL antes do BCP [1,97 (1,04-3,89) UA/mmHg] foram significativamente reduzidos para [0,74 (0,54-1,32) UA/mmHg] durante o CBP (p<0,0001; Figura 1B). Ainda, observou-se uma importante redução nos aumentos na porcentagem de condutância microvascular induzidos por HTL, de [313 (171-604) %] antes do BCP para [74 (8-156) %] durante o BCP (p<0,0001). A área sob a curva (AUC) da vasodilatação microvascular induzida por HTL mostrou um padrão similar de resposta. Valores máximos de aumento na AUC induzido por HTL antes do BCP [155 552 (75 323-313 040) UA/mmHg/s] foram significativamente reduzidos para [64 676 (38 753-101 423) UA/mmHg/s] durante o CBP (p<0,0001; Figura 1C).

Discussão

O NO tem um papel chave na regulação da função endotelial e inflamação microvascular.11 O BCP induz uma resposta inflamatória generalizada, induzida, ao menos em parte, pela lesão de isquemia/reperfusão, a qual contribui para disfunção miocárdica e débito cardíaco reduzido, e está relacionada ao metabolismo do NO, entre outros mecanismos. O presente estudo mostra uma redução nos níveis de NO durante o BCP em crianças, concomitante à evidente disfunção de disfunção microvascular. Tal fato destaca evidências prévias de redução de NO durante cirurgia cardíaca, o que tem motivado o desenvolvimento de estudos usando administração de NO para reduzir a inflamação induzida por bypass em crianças submetidas à cirurgia cardíaca. Portanto, dados deste estudo possivelmente corroboram o monitoramento da microcirculação durante o BCP, com intervenções terapêuticas direcionadas.

Conclusões

A disfunção endotelial microvascular durante o BCP na cirurgia cardíaca para a correção de CCs parece estar relacionada a uma biodisponibilidade sistêmica reduzida de NO, resultante de uma resposta inflamatória e pró-oxidativa típica desse procedimento cirúrgico.

Importante mencionar que nosso estudo teve um delineamento experimental transversal e, portanto, a reatividade da microcirculação na nossa população foi avaliada sem nenhuma intervenção. No entanto, considerando que nossos resultados apontaram para a existência de uma associação entre BCP e depleção sistêmica de NO em lactentes e crianças, pretendemos estender nosso estudo clínico com intervenções medicamentosas – tais como nitroprussiato de sódio, uma droga doadora de NO – usadas para otimizar a microcirculação durante o BCP, para investigar seus supostos efeitos benéficos sobre as mudanças na microcirculação. Por hora, o LDPM refletiu mudanças na perfusão e na reatividade microvascular que se correlacionaram bem com alterações nos perfis do fluxo, pressão de perfusão e disfunção endotelial, induzidos por uma síndrome de resposta inflamatória sistêmica.

Por fim, nós sugerimos que o uso de monitoramento da microcirculação durante a cirurgia cardíaca, com implementação de variáveis relacionadas à microcirculação/perfusão tecidual na prática de rotina durante o BCP, junto com intervenção terapêutica adequada na microcirculação, tem o potencial de melhorar desfechos na cirurgia cardíaca pediátrica.

Introduction

Cardiopulmonary bypass (CPB) is currently performed in infants and newborns for surgical correction of congenital heart diseases (CHDs). CPB exposes the body to extreme, nonphysiologic conditions that initiate a systemic inflammatory response accompanied by vasomotor dysfunction, and can lead to multiple organ dysfunction. Additionally, CPB has been linked to activation and injury of endothelial cells, which is associated with global inflammatory response, triggering of the coagulation system and subsequent organ dysfunction, not only in adult patients, but particularly in infants and newborns.

Systemic microvascular dysfunction during CPB results in inadequate blood flow, organ perfusion and oxygen delivery to the tissues.4 We have shown, using laser Doppler perfusion monitoring (LDPM) (a non-invasive method coupled with local heating of the skin), that the microcirculatory bed of the skin of the forehead is an appropriate model for the study of microvascular reactivity and tissue perfusion in cardiovascular surgery with CPB in adults. Actually, local thermal hyperemia (LTH) is a useful method in the evaluation of systemic microvascular endothelial function., In addition, using LDPM, we demonstrated that microvascular dysfunction and hypoperfusion occur during CPB in surgical correction of congenital heart disease in infants and children, despite adequate macrohemodynamic parameters. The mismatch between macro- and microcirculation in severely ill patients with septic or cardiogenic shock, which can be misleading to an adequate clinical management of these patients, has also stimulated the search for new methods to monitor microcirculatory perfusion in the intensive care units.

Of note, the release of nitric oxide (NO) from the constitutive endothelial isoform of nitric oxide synthase (eNOS) is reduced during CPB in adult patients. NO is a potent endothelium-derived endogenous vasodilator, and its depletion during CPB under non-pulsatile flow can lead to vasoconstriction, and consequently reduced organ perfusion. Plasma NOx (NO2– / NO3–), steady metabolites of NO, which have been used as markers of systemic NO bioavailability, as their levels reflect changes in eNOS activity in humans. Therefore, the aim of the present study was to investigate whether a reduction of NO systemic bioavailability is associated with endothelial-dependent microvascular dysfunction in infants and children, during on-pump cardiac surgery for the correction of acyanotic CHD.

Methods

This longitudinal observational study included 47 consecutive pediatric patients with acyanotic heart defects, aged between 1 month and 9 years, undergoing corrective cardiac surgery at a tertiary public Brazilian hospital. The study was undertaken according to the Declaration of Helsinki and was approved by the ethics committee of the institution. Parents or legal tutors of the study participants gave written informed consent. The anesthetic procedures occurred under CPB, with mild to moderate hypothermia (32-34° C). Mean arterial pressure was kept between 45-60 mmHg.

Assessment of microvascular flow and reactivity

Skin microvascular reactivity was evaluated using a single-point LDPM system (Periflux 5001, Perimed, Järfälla, Sweden), which measures microvascular flow using a heating laser probe (PF 457, Perimed). The microvascular perfusion changes were registered in arbitrary perfusion units (APU=10 mV). The probe was positioned on the forehead at the beginning of the anesthetic procedures, and baseline microvascular flow was measured during 20 minutes of local heating of the laser probe to 42 °C (LTH). The maximal vasodilation was expressed as cutaneous vascular conductance (CVC), calculated as the ratio of the microvascular flow, in APU, to the mean arterial pressure (APU/mmHg). Mean of values of microvascular flow (in APU) before and during CPB were used in the calculations. After the baseline evaluation, the microvascular response to LTH was also recorded after induction of general anesthesia and 15 minutes after the beginning of CPB.

Evaluation of systemic bioavailability of NO

Systemic nitric oxide bioavailability was evaluated using plasma NOx (NO2– / NO3–) concentrations, which have been used as an index of in vivo NO formation. Total plasma NOx concentrations were determined after induction of anesthesia and immediately after conclusion of CPB using a colorimetric assay (Cayman Chemical Company, Ann Arbor, Michigan, USA) with a 2.5 μM sensitivity and a 2.7% intra-assay coefficient of variation. Each plasma sample was measured in duplicate.

Statistical analysis

Results are presented as medians (interquartile range). Shapiro-Wilk was used to test the normality of the data. Results were analyzed with two-tailed Wilcoxon matched-pairs signed rank test using GraphPad Prism 7.0 software (GraphPad Software INC., San Diego, California, USA). A p-value < 0.05 defined statistical significance.

Results

Baseline clinical characteristics of the patients included in the study and the surgical parameters are depicted in Table 1. Mean arterial pressure values were 58.4 ± 11.5 mmHg before and 50.9 ± 8.4 mmHg during CPB (p=0.01).

Table 1

Clinical characteristics and surgical data of patients (n=47)

Parameters
Male gender n (%)		19 (40.4)
Age (months)		16 (9 - 54)
Weight (Kg)		8 (6 - 16)
CPB time (min)		85 (75 - 105)
Temperature during CPB (°C)		32 (32-33)
Pump flow rate (mL/Kg/min)		150 (120 - 150)
Aortic cross-clamping time (min)		67 ± 28
Type of cardiopathy n (%)
	Atrial septal defect	3 (6.4)
Ventricular septal defect		16 (34)
	Atrioventricular canal (partial or total)	15 (32)
	Aortic arch interruption	1 (2.1)
	Truncus arteriosus	1 (2.1)
Mixed lesions		11 (23.4)
RACHS-1 score n (%)
Risk category 1		3 (6.4)
Risk category 2		21 (44.7)
Risk category 3		21 (44.7)
Risk category 4		2 (4.2)

Dados apresentados em média ± desvio padrão ou medianas (percentis 25 - 75) para valores que não apresentaram distribuição gaussiana (teste de normalidade de Shapiro-Wilk); BCP: bypass cardiopulmonar; RACHS-1: escore de risco ajustado para cirurgia de cardiopatia congênita

Before CPB, patients' plasma NOx levels were 51.4 (24.2-75.8) µM, which were significantly reduced to 45.1 (31.0-66.5) µM after CPB (p=0.03; Figure 1A).

Figure 1

(A) Total plasma levels of NOx (NO2– / NO3–) before (PRE-CPB) and after the termination of cardiopulmonary bypass (POST-CPB). (B) Peak values of skin microvascular vasodilator responses induced by local thermal hyperemia, expressed as cutaneous vascular conductance [arbitrary perfusion units (APU)/mean arterial pressure (mmHg)] before (PRE-CPB) and 15 minutes after the beginning of CPB. (C) Area under the curve of vasodilator responses induced by local thermal hyperemia before (PRE-CPB) and 15 minutes after the beginning of CPB. Values are expressed as box and whisker plots where the center line denotes the median value, the box contains the 25th to 75th percentiles of dataset and whiskers mark the maximum and minimum values. Results were analyzed using the Wilcoxon matched-pairs signed rank test

Median baseline microvascular conductance before CPB [0.47 (0.35-0.64) APU/mmHg] did not change significantly [0.48 (0.28-0.66) APU/mmHg] during CPB (p=0.85). On the other hand, the endothelial-dependent increase in microvascular conductance, induced by thermal hyperemia, was significantly blunted during CPB, when compared to values obtained before CPB (Figure 1B). Maximum absolute values of microvascular conductance during LTH before CPB [1.97 (1.04-3.89) APU/mmHg], were markedly reduced to [0.74 (0.54-1.32) APU/mmHg] during CPB (p<0.0001; Figure 1B). Percentage increases of microvascular conductance induced by LTH were also markedly reduced, from [313 (171-604) %] before CPB to [74 (8-156) %] during CPB (p<0.0001). The area under the curve (AUC) of microvascular vasodilation induced by LTH showed a similar pattern of response. Maximum increases in AUC induced by LTH before CPB [155,552 (75,323-313,040) APU/mmHg/s] were significantly reduced to [64,676 (38,753-101,423) APU/mmHg/s] during CPB (p<0.0001; Figure 1C).

Discussion

NO has a key role in the regulation of endothelial function and microvascular inflammation. CPB induces a generalized inflammatory response, triggered at least in part by ischemia–reperfusion injury, which contributes to myocardial dysfunction and reduced cardiac output, and is related to NO metabolism, among other mechanisms. The current study shows a reduction of NO during CPB in children, which parallels the objective evidence of microvascular dysfunction. This underscores prior evidence of NO reduction during cardiac surgery, what has led to studies using NO administration to reduce bypass-induced inflammation in children undergoing cardiac surgery. Therefore, data from this study may support the use of microcirculatory monitoring during CPB, with guided therapeutic interventions.

Conclusions

The impairment of microvascular endothelial function during CPB in cardiac surgery for the correction of congenital heart defects appears to be related to a reduced systemic bioavailability of NO, resulting from the inflammatory and pro-oxidative response typical of this surgical procedure.

It is important to note that our study had a cross-sectional experimental design; thus, microcirculatory reactivity in our population was evaluated without any intervention. Nevertheless, considering that our results pointed out to the existence of an association between CPB and systemic NO depletion in infants and children, we intend to extend our clinical research with drug interventions - such as sodium nitroprusside, a NO donor drug - utilized for optimizing microcirculation during CPB, to investigate their putative beneficial effects on microcirculatory alterations. For the moment, LDPM reflected changes in microvascular perfusion and reactivity that correlated well with shifts in flow patterns, perfusion pressure and endothelial dysfunction, triggered by the systemic inflammatory response syndrome.

Finally, we suggest that the use of microcirculatory monitoring during cardiac surgery, with the implementation of microcirculatory/tissue perfusion variables in routine care during CPB, together with appropriate therapeutic microcirculatory intervention, has the potential to improve outcomes in pediatric cardiac surgery.