Cardiac Autonomic Nervous System Remodeling May Play a Role in Atrial Fibrillation: A Study of the Autonomic Nervous System and Myocardial Receptors.

BACKGROUND: The primary factors that originate and perpetuate atrial fibrillation (AF) are electrical and anatomical substrate alterations. However, the central mechanisms governing AF perpetuation have not been elucidated yet, which is reflected on the modest results of the treatment in patients with long persistent AF.
OBJECTIVE: To evaluate if human intrinsic cardiac autonomic nervous system (ICANS) remodeling, including nervous system fibers and muscarinic and β-adrenergic receptors, play a role in permanent AF.
METHODS: Heart necropsy samples from thirteen patients with heart disease and permanent AF and thirteen controls without AF were used. By using immunoperoxidase and histomorphometry quantification, we identified the following: the density of all fibers of the ICANS, sympathetic and parasympathetic fibers; and the percentage of myocardium positive for β-adrenergic receptors 1, 2 and 3; G protein-coupled receptor kinase-5 (GRK-5); and muscarinic receptors M1 to M5. The results were compared using ANOVA and nested ANOVA and were adjusted according to the left atrium volume for all variables, and β-blocker use to evaluate the expression of β-receptors and GRK-5.
RESULTS: There was an overall increase in the density of fibers of the ICANS (p=0.006), especially in atrial sympathetic nerve fibers (p=0.017). Only M1 muscarinic receptors were increased (5.87 vs 2.35, p=0.032). For adrenergic receptors, the results were positive for increased expression of β-3 (37.41 vs 34.18, p=0.039) and GRK-5 (51.16 vs 47.66; p<0.001). β-blocker use had no impact on β-receptor expression.
CONCLUSION: Increased ICANS innervation and remodeling receptor expression in regions prone to triggering AF may play a role in permanent AF.

Introdução

Alterações nos substratos elétrico e anatômico do coração constituem o fator primário que origina e perpetua a fibrilação atrial (FA). Em pacientes com FA sem doença estrutural do coração, focos ectópicos originados nas veias pulmonares têm papel bem definido como desencadeante de FA paroxística. [1] No entanto, a FA é, na maior parte dos casos, secundária a doenças cardíacas estruturais, como doença isquêmica do coração, doenças valvares e outras, que apresentam consequências hemodinâmicas e anatômicas, tais como aumento do átrio esquerdo, que estão associadas à progressão da arritmia. [1]

A fibrose é também amplamente vista como fator independente relacionado à FA persistente em corações com alterações estruturais. [2] Ela, porém, não explica totalmente a arritmia, sendo mais associada às doenças subjacentes do que à FA persistente em si. [3]

A avaliação eletrofisiológica demonstrou não só uma efetiva heterogeneidade do período refratário, mas também a anisotropia das propriedades de condução, tanto nas veias pulmonares quanto nos seus óstios atriais, o que pode causar a reentrada de estímulos elétricos. [4] Entretanto, os mecanismos cruciais que governam a perpetuação da FA não foram elucidados por completo - o que se reflete em resultados modestos no tratamento de pacientes com FA persistente prolongada. [5]

Estudos básicos e clínicos sugeriram haver participação significativa do sistema nervoso autônomo cardíaco intrínseco (SNACI) no desencadeamento e na manutenção da FA. [6 , 7] A ativação do SNACI pode causar mudanças importantes no período refratário atrial, inclusive aumento na dispersão da refratariedade, que é um dos importantes mecanismos de desenvolvimento da FA persistente. [1 , 8 - 10]

Estudos experimentais mostraram hiperinervação simpática em cães com FA, e aumento na inervação simpática e parassimpática em áreas relacionadas a essa arritmia em animais com insuficiência cardíaca. [11] Uma relação entre o SNACI e a FA foi também relatada em seres humanos, porém, em comparação com pacientes saudáveis. [2 , 12] A possibilidade de envolvimento de distúrbios em fibras e receptores do SNACI na fibrilação atrial humana foi pouco explorada.

Assim, o objetivo do presente estudo foi avaliar o sistema nervoso autônomo cardíaco intrínseco, incluindo fibras simpáticas e parassimpáticas, e a expressão atrial de cinco tipos de receptores muscarínicos e três adrenérgicos, assim como do receptor quinase 5 acoplado à proteína G (a qual controla a expressão dos receptores adrenérgicos). Estudamos corações de pacientes com doença estrutural e fibrilação atrial permanente e, como controles (o que foi um fator importante), os de pacientes portadores das mesmas doenças, mas sem fibrilação atrial.

Métodos

Este estudo foi guiado pelos princípios da Declaração de Helsinque e aprovado pela Comissão Científica do Instituto do Coração (InCor) do Hospital das Clínicas, da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, São Paulo, Brasil (#SDC 3043/07/118).

Pacientes

Foram utilizadas partes das amostras de estudo anterior. [3] Analisamos 13 corações de adultos (acima dos 18 anos) com FA permanente registrada em prontuário com duração mínima de 2 anos, [1] que foram submetidos a necrópsia (realizada em até menos de 24 horas após a morte) no Laboratório de Anatomia Patológica do InCor . Todos os pacientes tinham doenças subjacentes: doença isquêmica do coração (4), valvopatias (4), miocardiopatia hipertensiva (2), miocardiopatia dilatada idiopática (2) ou doença de Chagas, forma crônica cardíaca (1). Para evitar fatores de interferência ligados às doenças de base, corações de 13 pacientes submetidos a necrópsia no mesmo laboratório foram selecionados como controles, com pareamento de acordo com as doenças dos que tinham fibrilação atrial, mas sem qualquer referência a essa arritmia em seus prontuários. Em ambos os grupos, pacientes que tivessem sido submetidos a cirurgia ou a qualquer procedimento com potencial de modificar a estrutura cardíaca ou com cardiopatias congênitas foram excluídos.

Amostras dos corações

De cada coração foram obtidas quatro amostras, contendo epicárdio, miocárdio e endocárdio: na parede posterior do átrio direito ( Figura 1A ); na junção da veia pulmonar superior esquerda com o átrio esquerdo ( Figura 1B ); na porção medial do trajeto da veia de Marshall ( Figura 1C ); e em torno do coxim gorduroso superior esquerdo (os coxins gordurosos são concentrações de gordura epicárdica nas quais há tecido nervoso, sendo conhecidos como fat-pads ). Tais áreas foram escolhidas porque foram antes implicadas na fibrilação atrial, e são comumente analisadas em outros estudos, [3 , 12 , 13] com exceção da parede posterior do átrio direito, selecionada para verificar se eventuais alterações seriam difusas nos átrios. As localizações são apresentadas na figura 1 .

Figura 1

– Imagem fotorrealística de vista posterior do coração humano. Quatro amostras foram coletadas nas seguintes localizações: A) parede posterior do átrio direito. B) junção da veia pulmonar superior esquerda com o átrio esquerdo; C) Segmento medial da rota da veia de Marshall; D) coxim gorduroso superior esquerdo.

Após processamento histológico convencional e embebição em parafina, cortes dessas amostras com 4 micrômetros de espessura foram preparados para a quantificação da inervação autonômica, receptores adrenérgicos e muscarínicos e expressão de GRK-5.

Quantificação dos receptores e das fibras nervosas autonômicas

A positividade forte para receptores adrenérgicos e muscarínicos, GRK-5 e área total de miocárdio considerada foram medidas por detecção automática de cor em 3 campos microscópicos em cada lâmina. Para evitar viés de seleção na escolha dos campos, foram analisados os mais distantes da etiqueta das lâminas.

As fibras nervosas autonômicas também foram quantificadas nas amostras. A proteína S-100 tem positividade em todos os nervos, enquanto a tirosina hidroxilase (TH) marca apenas as fibras adrenérgicas (simpáticas) pós-ganglionares. Assim como outros autores, [14] avaliamos custo-efetividade e consideramos os nervos TH-positivos como pertencendo ao sistema nervoso simpático; já os parassimpáticos corresponderam aos positivos para S-100 e negativos para TH. Diferentemente do que o empregado com os receptores, os cortes histológicos foram analisados por inteiro, e suas áreas e números de nervos foram quantificados em cada lâmina. Foram, então, calculadas as seguintes variáveis: porcentagem de área positiva (área positiva/ área do corte), densidade média de nervos positivos (número de nevos positivos/ área do corte) e área média dos nervos (área positiva/ número de nervos). Calculamos também o número total de fibras nervosas (S-100 positivas), fibras nervosas simpáticas (TH-positivas) e fibras nervosas parassimpáticas (S100-positivas e TH-negativas, diferença entre o total de fibras e as simpáticas).

Para aumentar o contraste entre positividade fraca e forte, as diluições para os receptores e o GRK-5 foram supraótimas [15] quando comparadas ao padronizado em outros tecidos. Como controle das reações, o anticorpo primário foi omitido em 5 lâminas escolhidas ao acaso. Os cortes foram examinados em sistema de análise de imagens Axiovision 4.6, acoplado ao microscópio Axion imager A1 (ambos da Carl Zeiss , Alemanha) por observador que desconhecia a que grupo pertenciam as lâminas.

Especificação e diluição dos anticorpos: receptor muscarínico 1 (AB5164)- 1:100; receptor muscarínico 2 (AB9452)- 1:800; receptor muscarínico 3 (AB9451)- 1:200; receptor muscarínico 4 (AB9219)- 1:400; receptor muscarínico 5 (AB9453)- 1:400; receptor adrenérgico β1 (SC568) - 1:200; receptor adrenérgico β2 (SC570) - 1:50; receptor adrenérgico β3 (SC1473) - 1:20; quinase GRK-5 (SC 565) - 1:200; S-100 (Z0311) - 1:300; tirosina hidroxilase (MAB318) - 1:50.

O anticorpo para S-100 foi fornecido por Dako , Dinamarca; os anticorpos para tirosina hidroxilase e receptores muscarínicos, por Chemicon , Estados Unidos da América; e os anticorpos para receptores adrenérgicos e GRK-5, por Santa Cruz Biotechnology , Estados Unidos da América.

Análises estatísticas

Inicialmente, as frequências absolutas e relativas foram calculadas para as variáveis categóricas, e as medidas de tendência central e dispersão para as numéricas. Para comparar casos com controles foram utilizados os testes de qui-quadrado e t de Student. Os testes paramétricos foram usados após o teste de Kolmogorov-Smirnov para avaliação da normalidade em todas as variáveis, e estimativas de erros robustos foram usadas em modelos regressivos. A análise de variância (ANOVA) one-way foi aplicada considerando-se cada conjunto de amostras iguais para identificar as diferenças entre elas. A análise de covariância foi também realizada para ajuste das dimensões do átrio e uso de β-bloqueadores, quando apropriado, ao analisar os cortes individuais. Modelos lineares gerais (também conhecidos como análise de variância hierarquizada [ nested ANOVA]) de todas as amostras histológicas dos participantes individuais) foram também aplicados para identificar o impacto do determinante principal (a saber, tratamento, um fator intersujeitos) nas diferentes variáveis dependentes. Finalmente, múltiplos modelos hierarquizados lineares gerais foram aplicados a todos os cortes histológicos para cada caso. Consideramos significantes valores de p iguais a ou menores que 0,05. Em todos os modelos, foram realizados ajustes de Bonferroni nos valores de p. As análises foram efetuadas no programa SPSS, versão 23 ( IBM, Inc , Estados Unidos da América).

Assim como em nosso estudo prévio de aspectos histológicos, inclusive fibrose, já que o volume atrial difere entre pacientes com e sem fibrilação atrial, fizemos a análise de sensibilidade com métodos de ajuste considerando as diferenças no tamanho do átrio esquerdo. A seguir, estimamos os resultados de cada variável em corações de qualquer grupo com um tamanho específico de átrio esquerdo para verificar se potenciais diferenças entre grupos poderiam estar ligadas a essa covariável. Adicionalmente, o uso de β-bloqueadores foi incluído para ajuste da avaliação de receptores β-adrenérgicos e de GRK-5.

Resultados

As características clínicas, morfológicas e ecocardiográficas dos pacientes com fibrilação atrial permanente e seus controles são mostradas na tabela 1 .

Tabela 1

– Dados clínicos e ecocardiográficos de pacientes com FA permanente e controles

Variáveis	Casos com FAp (n=13)	Casos com FAp (n=13)	p
Pacientes do sexo masculino [n/(%)]	5 (38,5)	8 (61,5)	0,24
Idade (anos) [média/(dp)]	67,5 (15,4)	65,5 (11,4)	0,71
Doença cardíaca subjacente [n/(%)]
Doença isquêmica do coração	4 (30,8)	4 (30,8)
Doença da válvula, incluindo DR	4 (30,8)	4 (30,8)
Cardiopatia hipertensiva	2 (15,4)	2 (15,4)
Cardiomiopatia dilatada idiopática	2 (15,4)	2 (15,4)
Doença de Chagas	1 (7,7)	1 (7,7)
Peso (kg) [média/(dp)]	66,5 (14,1)	63,8 (15,0)	0,67
Altura (cm) [média/(dp)]	162,4 (14,7)	160,8 (8,8)	0,78
IMC (kg/m 2 ) [média/(dp)]	25,0 (2,9)	24,5 (4,2)	0,74
Diabetes mellitus [n/(%)]*	3 (23,1)	3 (25,0) (n=12)	0,99
Uso de beta-bloqueadores	5 (38,4)	5 (38,4)
Hipertensão arterial sistêmica - [n/(%)]*	9 (69,2)	4 (33,3) (n=12)	0,07
Volume de átrio esquerdo no eco [média/(dp]	83,2 (38,4)	47,9 (40,8)	0,03
Espessura do septo do VE [média/(dp)]	10,3 (2,4)	10,4 (1,6)	0,94
Fração de ejeção do VE [média/(dp)]	49,8 (20,1)	46,1 (19,8)	0,67
Razão colágeno/colágeno+miocárdio [média +(dp)]	0,26 (0,09)	0,23 (0,06)	0,35

FAp: fibrilação atrial permanente; n: número de casos; dp: desvio padrão; DR: doença reumática; IMC: índice de massa corporal; * sem informação sobre um paciente controle; eco - ecocardiograma; VE: ventrículo esquerdo. Adaptado de Oliveira IM et al.3

Dados relativos às fibras nervosas, considerando cada território amostrado, bem como todos em conjunto, são apresentados na tabela 2 . Levando-se em consideração separadamente cada localização, não são observadas diferenças quanto à densidade de fibras autonômicas intrínsecas. A análise englobando todas as amostras demonstra aumento de nervos simpáticos nos pacientes com FA (8,53±20,25/cm 2 vs 2,67±4,57/cm 2 , p=0,04). Após ajuste quanto ao tamanho do átrio esquerdo, aparece um aumento também nos nervos parassimpáticos e na quantidade total de nervos. A figura 2 (A e B) mostra a imunoexpressão das fibras nervosas em nossas amostras.

Tabela 2

– Fibras nervosas autônomas de corações de pacientes com FA permanente e de controles

Fibras	Todos (S100) (unidades/cm 2 )		Nervo simpático (TH+) (unidades/cm 2 )		Nervo parassimpático (TH-) (unidades/cm 2 )
Grupo	FAp	Controle	FAp	Controle	FAp	Controle
AD - parede posterior	8,85±9,40	9,10±5,15	0,37±0,99	0,50±1,14	8,48±9,57	8,59±5,07
	p 0,935,	0,710 ¥	p 0,753,	0,905 ¥	p 0,971,	0,700 ¥
AE - junção da veia pulmonar superior esquerda	41,61±35,79	25,78±20,90	19,74±34,26	4,95±6,78	21,86±14,78	20,83±20,47
	p 0,181,	0,256 ¥	p 0,140,	0,158 ¥	p 0,884,	0,918 ¥
AE - meio da rota da veia de Marshall	40,15±60,28	14,90±9,48	5,58±9,56	2,39±4,76	34,56±58,07	12,51±9,48
	p 0,149,	0,390 ¥	p 0,292,	0,230 ¥	p 0,189,	0,500 ¥
FP - superior à esquerda	38,05±55,72	19,25±11,95	8,42±16,07	2,85±2,82	29,62±40,56	17,47±10,53
	p 0,246,	0,637 ¥	p 0,248,	0,666 ¥	p 0,325,	0,681 ¥
Amostras em conjunto	32,16±45,76	17,26±14,20	8,53±20,25	2,67±4,57	23,63±36,77	14,80±13,27
	p 0,136 e ,	0,001 Ϯ	p 0,044 e,	0,017 Ϯ	p 0,237 e ,	0,001 Ϯ

Dados apresentados como média ± desvio padrão. FAp: fibrilação atrial permanente; AD: átrio direito; AE: átrio esquerdo; FP: coxim gorduroso (“fat pad”). p valor ANOVA não ajustado,

Figura 2

– A) Fibras nervosas fortemente positivas para tirosina-hidroxilase, portanto consideradas fibras simpáticas; B) Fotomicrografia da tela do sistema de análise de imagens mostrando nervos marcados para proteína S-100; C e D) Áreas positivas (C) e negativas (D) em cortes histológicos de miocárdio com reação imuno-histoquímica para o receptor muscarínico 1.

Os resultados da expressão de receptores muscarínicos e adrenérgicos e de GRK-5 são apresentados na tabela 3 . Estão divididos conforme a localização das amostras, havendo ainda dados da reunião de todas elas.

Tabela 3

– Expressão dos receptores muscarínicos e β-adrenérgicos em corações de pacientes com AF permanente e controles

Receptor	Grupo	AD - parede posterior			AE - ponto médio da veia Marshall			AE - junção da veia pulmonar superior esquerda			AE - perto da coxim de gordura superior esquerda			Amostras em conjunto
			p	p*		p	p*		p	p*		p	p*		p	p**
M1	FAp	6,47±3,39	0,001	0,002	5,56±4,64	0,021	0,131	6,32±5,33	0,286	0,270	5,15±4,89	0,038	0,220	5,87±4,52	<0,001	0,032
	Controle	2,77±1,38			2,22±1,48			4,30±4,03			2,12±0,93			2,85±2,40
M2	FAp	7,60±5,95	0,762	0,982	5,64±3,54	0,110	0,066	7,84±4,13	0,198	0,107	5,65±2,41	0,039	0,038	6,69±4,26	0,760	0,666
	Controle	6,93±5,15			3,73±2,12			14,24±16,88			3,62±2,41			7,14±9,73
M3	FAp	43,50±19,08	0,105	0,315	37,61±20,97	0,296	0,281	41,90±18,88	0,546	0,281	31,00±13,27	0,025	0,151	38,51±18,34	0,069	0,291
	Controle	31,04±18,61			29,10±18,80			46,50±19,61			20,10±9,58			31,71±19,21
M4	FAp	9,14±5,47	0,201	0,169	9,90±6,67	0,023	0,049	7,64±4,00	0,690	0,618	8,18±11,72	0,192	0,678	8,71±7,37	0,016	0,213
	Controle	5,76±4,74			4,44±4,56			8,42±5,66			3,76±1,95			5,59±5,45
M5	FAp	18,94±11,93	0,302	0,704	12,90±11,34	0,368	0,645	20,92±22,81	0,737	0,946	12,06±9,32	0,570	0,977	16,21±14,88	0,212	0,507
	Controle	14,51±9,37			8,67±12,14			18:30±15,91			9,83±10,39			12,83±12,47
β1	FAp	43,90±12,39	0,975	0,742	47,59±21,40	0,036	<0,001	37,48±21,90	0,438	0,288	40,23±22,37	0,552	0,214	42,05±19,75	0,295	0,520
	Controle	44,10±17,81			28,98±19,34			43,60±17,42			34,89±22,83			37,89±19,93
β2	FAp	23,81±11,96	0,785	0,445	32,42±19,20	0,180	0,589	20,57±13,48	0,323	0,257	23,47±16,69	0,037	<0,001	24,80±15,61	0,408	0,081
	Controle	25,48±17,51			23,04±13,88			27,63±21,32			12:38±7,00			22,14±16,46
β3	FAp	39,32±20,29	0,911	0,469	36,36±26,36	0,422	0,940	36,45±11,81	0,351	0,281	37,50±18,53	0,177	0,314	37,41±18,17	0,406	0,039
	Controle	38,40±20,45			29,04±20,40			42,38±19,10			26,89±20,31			34,18±20,53
GRK5	FAp	49,81±18,49	0,899	0,976	44,84±18,78	0,999	0,147	53,43±15,28	0,796	0,862	55,45±16,53	0,086	0,320	51,16±17,17	0,284	<0,001
	Controle	50,53±7,61			44,85±19,75			52,95±13,26			43,29±18,00			47,66±15,39

Dados apresentados como proporção média (%) ± desvio padrão. FAp: fibrilação atrial permanente; AD; átrio direito; AE:átrio esquerdo; GRK5: receptor acoplado à proteína G. p valor ANOVA não ajustado. *Anova ajustada pelo tamanho do átrio esquerdo para M1 a M5, e pelo volume de átrio esquerdo e uso de β-bloqueadores em β1 a β3 e GRK-5.*Anova hierarquizado ajustado pelo tamanho de átrio esquerdo para M1 a M5 e pelo tamanho de átrio esquerdo e uso de bloqueador de β em β1 a β3 e GRK-5.

A imunomarcação de receptores muscarínicos é mostrada na figura 2, C e D . Não existe diferença considerável entre as regiões subepicárdica e subendocárdica. Em corações de pacientes com FA permanente, a expressão de todos os tipos de receptores muscarínicos, com exceção do 5, estava aumentada em ao menos um território. Houve mais alterações no coxim gorduroso superior esquerdo e na veia oblíqua do átrio esquerdo (veia de Marshall). No entanto, após ajuste quanto ao tamanho do átrio esquerdo, apenas a expressão de M1 no átrio direito (e, consequentemente, a avaliação global) e M2 junto ao coxim gorduroso permaneceram significantes.

Em relação aos receptores β-adrenérgicos e GRK-5, não foi encontrada diferença na análise global dos subtipos 1 e 2 (apenas aumento em uma amostra de cada). Porém, β-3 e GRK-5 apresentaram aumento em todas as localizações na análise ajustada. Não foi detectada diferença entre pacientes que tomavam β-bloqueadores e os que não o faziam (dados não apresentados).

Discussão

O sistema nervoso autônomo cardíaco intrínseco na fibrilação atrial permanente

O SNACI corresponde a uma rede neural composta por fibras nervosas e plexos ganglionares (simpáticos e parassimpáticos) encontrados no coração e nas grandes veias adjacentes. [16] Tem papel importante na fisiopatologia da FA, como demonstrado por estimulação elétrica ou por injeções de parassimpatomiméticos. [17] Os dados atuais indicam não somente uma função importante na ativação dos eixos simpático e parassimpático, mas também que a modificação do balanço entre suas ações está envolvida na iniciação da FA. [8 , 18]

Neste estudo, realizamos análise abrangente do SNACI, enfocando tanto nos nervos quanto nos receptores muscarínicos e beta-adrenérgicos. Observamos aumento de fibras nervosas autonômicas atriais, em particular dos nervos simpáticos. Entretanto, ao se analisar cada localização isoladamente, tais diferenças não se mantêm. Por outro lado, quando se faz ajuste considerando o volume do átrio esquerdo, os resultados permanecem os mesmos. Esses últimos dados sugerem que há alteração significativa na densidade de nervos em pacientes com FA permanente, ainda que levando em conta o aumento do átrio esquerdo.

Diversos artigos [12 , 14 , 19 , 20] relataram inervação autonômica aumentada em áreas eletrofisiologicamente relacionadas à FA, tais como as veias pulmonares, os seios coronários e a veia de Marshall. Esses estudos compararam apenas a densidade de nervos (simpáticos ou parassimpáticos) nessas regiões, ou em outras, com o plexo ganglionar no miocárdio atrial. No entanto, esses territórios próximos aos plexos ganglionares têm grande densidade de nervos, mas que não obrigatoriamente estão vinculados à FA. Nossos dados revelam grande concentração do SNACI nessas áreas, especialmente inervação simpática. A densidade aumentada de nervos simpáticos pode ser um potencial desencadeante de arritmia causada pela inervação próxima ao plexo ganglionar e à resultante ativação do sistema nervoso autônomo, como já demonstrado em estudos experimentais. [12 - 20]

Receptores muscarínicos na fibrilação atrial permanente

A estimulação dos neurônios parassimpáticos pós-ganglionares libera acetilcolina (mediador colinérgico), a qual atua nos receptores muscarínicos na membrana celular em órgãos-alvo (no caso do coração, na membrana dos miócitos). [21] Foram descritos cinco tipos de receptores muscarínicos (M1 a M5), cuja presença em seres humanos foi demonstrada por Wang et al., [22] em estudo descritivo de amostras de átrios direitos obtidas de 4 pacientes submetidos à cirurgia de revascularização do miocárdio. [22] No presente trabalho, a expressão de todos esses receptores (exceto M5) estava aumentada em corações de portadores de FA em comparação à dos controles. A mais significativamente alterada foi a do receptor M1, inclusive nas análises ajustadas, como apresentado na tabela 3 . Todas as localizações exibiam aumento significativo desse receptor, com exceção da junção da veia pulmonar superior esquerda. O aumento de M1 no miocárdio de pessoas com FA permanente pode estar diretamente relacionado com a fibrilação em si, e ajuda a explicar o aumento anteriormente descrito do tônus simpático por liberação de catecolaminas nos terminais nervosos simpáticos, com efeito estimulador induzido por estas. [23]

Os receptores 2, 3 e 4 estavam aumentados nos pacientes com FA em apenas um local: 2 e 3 próximos ao coxim gorduroso superior esquerdo, e 4 na região da veia de Marshall. Além dos receptores M1 e M2, o M4 foi encontrado nos gânglios simpáticos e pode ser induzido por catecolaminas, de forma similar ao receptor M1. De acordo com estudo de Makino et al., a região da veia de Marshall tem grande número de fibras nervosas simpáticas e de gânglios parassimpáticos, e pode de fato ter um papel ligado à expressão aumentada desses receptores. [14] Assim, as áreas afetadas são de fato as mais relacionadas à FA; apenas o M1 parece ter alteração mais difusa, atingindo o átrio direito e o esquerdo.

Foram descritas alterações na expressão de receptores muscarínicos em modelos experimentais, o que pode sugerir que eles tenham uma função na fisiopatologia, e talvez no tratamento, da FA. Em modelo experimental de insuficiência cardíaca em cães, as densidades dos receptores M2 e M4 estavam reduzidas, e as dos receptores, aumentadas nos átrios com FA, em comparação com os sem FA. [24] Deve-se salientar que M2 e M4 inibem os canais de cálcio, e o M2 tem ações inotrópicas e cronotrópicas. [21 , 22] Assim, seria possível esperar que esses receptores estivessem diminuídos, e não aumentados, na FA permanente. O mesmo não se aplica aos receptores M1 e M3, de quem foram documentadas funções estimuladoras em outros órgãos. [22] O receptor M5 e suas ações são pouco conhecidos nos corações humanos, mas de todo modo quanto a ele não houve diferença entre os grupos.

Nossos resultados sugerem que o tecido miocárdico adjacente aos plexos ganglionares pode estar associado à expressão aumentada de receptores muscarínicos, exceto no caso do M5. A expressão aumentada do receptor muscarínico ocorreu mais frequentemente na porção do átrio esquerdo, onde se situa a veia de Marshall.

Embora não tenhamos avaliado função, algumas considerações sobre a fisiopatologia da FA permanente podem ser feitas com base em nossas observações morfológicas. Primeiramente, é necessário considerar a possibilidade de que as alterações que encontramos sejam não a causa, mas o efeito da FA, por mecanismo não esclarecido. Por outro lado, o desequilíbrio do SNACI, como demonstrado em estudos experimentais e eletrofisiológicos, pode ser causado por baixa atividade da inervação cardíaca autonômica (na qual a redução da área média dos nervos com manutenção geral da densidade de fibras poderia ter uma função, ainda que seja importante mencionar que não houve alteração na área de nervos), com aumento desproporcional da inervação simpática. É importante salientar que o aumento da expressão cardíaca de receptores muscarínicos, especialmente dos relacionados à atividade induzida por catecolaminas (M1, M2 e M4) e em regiões específicas relacionadas à FA (M1 e M3), aponta para a existência de possível desequilíbrio na atividade autonômica que poderia perpetuar essa arritmia de modo permanente em corações humanos, ao aumentar a sensibilidade a estímulos atriais causados pela acetilcolina.

Receptores β-adrenérgicos na fibrilação atrial permanente e o uso de β-bloqueadores

Em que pese a grande importância do controle β-adrenérgico do ritmo cardíaco, nossos dados indicam que não há diferença na expressão de seus receptores ou da quinase GRK-5 com o uso de β-bloqueadores.

Não foi encontrada diferença significativa nos receptores β-adrenérgicos tipos 1 ou 2. Por outro lado, os receptores β3 e GRK-5 estavam bastante aumentados nas amostras de pacientes com FA permanente.

Considerações metodológicas e limitações do estudo

Há relativamente poucos trabalhos que usam métodos anatomopatológicos para estudar arritmias cardíacas, principalmente porque grande parte das alterações subjacentes a elas são essencialmente eletrofisiológicas, com poucas repercussões morfológicas, e porque frequentemente requerem trabalhosos mapeamentos cardíacos. Porém, uma vez que tais desafios sejam encarados, esses métodos têm potencial de contribuir de forma significativa para o entendimento dessas doenças. Nossa abordagem no presente estudo foi a de verificar tipos e áreas das fibras nervosas autonômicas, a expressão de receptores muscarínicos e adrenérgicos e a quinase desses últimos (GRK-5) na fibrilação atrial humana.

Nossos achados demonstram que esse método é útil para identificar alterações eventualmente presentes (como nos receptores). Claramente, uma das limitações desse tipo de estudo é que a expressão morfológica das fibras nervosas e dos receptores não implica diretamente que sejam funcionais, mas pode-se inferir que mudanças em suas concentrações miocárdicas podem refletir alterações em sua atividade.

Vale reforçar a importância da escolha de controles adequados para os estudos patológicos: ainda que a FA em geral ocorra em pacientes como acompanhante de alguma doença estrutural, a maioria dos artigos anteriores utilizou corações normais como controles. [11] Desse modo, é impossível determinar com precisão suficiente quais achados são, de fato, ligados à arritmia. Para evitar esse viés, nossos pacientes-controle tinham as mesmas doenças que aqueles com FA, como se tivéssemos “excluído” as doenças acima e abaixo de uma linha de fração, deixando apenas a arritmia para explicar as diferenças. Além disso, usamos amostras de pacientes com pelo menos 2 anos desde o diagnóstico, para ter certeza de que qualquer alteração potencial fosse fixa.

Conclusões

O aumento da inervação do sistema nervoso autônomo cardíaco intrínseco, assim como o remodelamento da expressão de receptores em regiões propensas a desencadear fibrilação atrial, podem ter uma função na condição de pacientes com fibrilação atrial permanente secundária à doença cardíaca estrutural.

Introduction

The primary factors that originate and perpetuate atrial fibrillation (AF) are electrical and anatomical substrate alterations, which involve many factors. In patients with AF without structural heart disease, ectopic foci in pulmonary veins have a well-defined role as triggers of paroxysmal AF.[1] In most cases, however, AF is a consequence of a structural disease, such as ischemic heart disease, valvular disease and others, presenting hemodynamic and anatomical consequences, such as left atrial enlargement, which are related to arrhythmia progression.[1]

Fibrosis is also widely regarded as an independent factor related to persistent AF in structurally altered hearts.[2] Nevertheless, this data does not fully explain arrhythmia, and myocardial fibrosis might be more closely related to the underlying heart disease, rather than persistent AF itself.[3]

Invasive electrophysiological assessment of the pulmonary veins (PVs) has demonstrated not only an effective heterogeneity if the refractory period, but also anisotropic conduction properties, both at the pulmonary veins and at the PV-left atrium ostia, which can provide a substrate for reentry.[4] However, the central mechanisms governing AF perpetuation have not been elucidated yet, which is reflected on the modest results of treatment in patients with long persistent AF.[5]

Basic and clinical studies have suggested a significant participation of the cardiac autonomic nervous system in triggering and maintaining AF.[6 , 7] The activation of the cardiac autonomic nervous system can cause important changes in the refractory period of the atria, including increased dispersion of refractoriness, which is a major mechanism for the development of persistent AF.[1 , 8 - 10]

Experimental studies show sympathetic hyperinnervation in dogs with AF, and increased sympathetic and parasympathetic innervation in areas related to this arrhythmia in animals with heart failure.[11] A relationship between the intrinsic cardiac autonomic nervous system (ICANS) and AF has also been reported in humans, but the comparison was made with healthy patients.[2 , 12] The possibility of alterations in fibers of the ICANS and receptors in human AF has therefore been poorly explored up to this point.

Thus, the aim of this study was to evaluate ICANS, including the sympathetic and parasympathetic fibers, and the atrial myocardial expression of the five types of muscarinic receptors, and of the three types of adrenergic receptors, as well as of G-protein-coupled receptor kinase-5 (GRK-5), which controls the expression of adrenergic receptors. We studied the hearts of patients with structural diseases and permanent AF and control cases that, importantly, were matched by the same diseases, but without AF.

Methods

This study was guided by the principles of the Declaration of Helsinki and approved by the Scientific and Ethics Committee of the Heart Institute (InCor), #SDC 3043/07/118, University of São Paulo, School of Medicine, São Paulo, Brazil.

Patients

We used the same samples from a previous study.[3] We analyzed thirteen hearts from adult patients (older than 18 years of age) with recorded permanent AF (for at least 2 years)[1] that underwent necropsy (performed less than 24 hours after death) in the Pathology Laboratory at this hospital. All the patients had underlying heart diseases: ischemic heart disease (4), valve disease (4), hypertensive cardiopathy (2), idiopathic dilated cardiomyopathy (2), or Chagas disease (1). To avoid confounding factors linked to the underlying diseases, hearts from thirteen other patients analyzed in the same laboratory were included as controls. The subjects were chosen by matching the heart diseases to those of the patients with permanent AF, but without any mention of atrial arrhythmia in their files. Patients who underwent any type of surgery or other procedures with the potential to modify cardiac structure were excluded, as were hearts from patients with congenital heart diseases.

Heart samples

Four heart samples containing epicardium, myocardium, and endocardium were taken from each heart: at the posterior wall of the right atrium ( Figure 1A ); at the junction of the left superior pulmonary vein with the left atrium ( Figure 1B ); at the middle of the route of the vein of Marshall ( Figure 1C ); around the superior left fat pad ( Figure 1D ). These areas were chosen because these structures (fat pads, the vein of Marshall) have been implicated in AF. These sampling areas are commonly analyzed in other studies.[3 , 12 , 13] The posterior wall of the right atrium was sampled to verify whether the alterations were diffuse in the atria. These locations are shown in Figure 1 .

Figure 1

– Photorealistic image of the posterior view of the human heart. Four heart samples were collected from the following locations: A) posterior wall of the right atrium; B) junction of the left superior pulmonary vein and left atrium; C) middle route of the Marshall vein; D) superior left fat-pad.

After conventional histological processing and embedding, four micrometer-thick sections of these samples were prepared to quantify autonomic innervation, adrenergic and muscarinic receptors and GRK-5 expression.

Quantification of autonomic receptors

Strong positivity for adrenergic, muscarinic receptors, GRK-5 and total myocardial area was measured by automatic color detection in 3 microscopic fields in each slide. To avoid selection bias in choosing the fields, we analyzed those more distant from the slide tag. Additional analyses to verify the effects of β-blocker use and β-receptor expression were also performed.

Quantification of autonomic nerve fibers, receptors and immunohistochemistry

Additionally, all samples of each heart were verified for the quantification of autonomic nerve fibers. The S-100 protein stains all nerves, whereas tyrosine hydroxylase (TH) only stains postganglionic adrenergic (sympathetic) fibers. Thus, like other authors,[14] we evaluated cost-effectiveness and considered the TH positive nerves as sympathetic nerves; and parasympathetic nerves were considered to be S-100 positive and TH negative. The area of the section, as well as the area and number of nerves positive for the antibody were quantified in each slide. The following variables were then calculated: mean percent positive area (positive area/section area); mean density of positive nerves (number of positive nerves/section area); and mean area of the nerves (positive area/number of nerves). We also calculated the total number of nerve fibers (S-100 positive); sympathetic nerve fibers (TH positive); and parasympathetic nerve fibers (S-100 positive and TH negative, difference between total and sympathetic nerve fibers).

To increase the contrast between weak and strong positivity, the dilutions for the receptors and GRK-5 were supraoptimal[15] when compared to those established in control tissues. As a control for the reactions, the primary antibody was omitted in 5 slides chosen at random. The sections were examined on an Axiovision 4.6 image analysis system, coupled to an Axion imager A1 microscope (both from Carl Zeiss , Germany), by an observer blinded to the group to which the slides belonged.

Antibody specification and dilution: muscarinic receptor 1 (AB5164) - 1:100; muscarinic receptor 2 (AB9452) - 1:800; muscarinic receptor 3 (AB9451) - 1:200; muscarinic receptor 4 (AB9219) - 1:400; muscarinic receptor 5 (AB9453) - 1:400; adrenergic receptor β1 (SC568) – 1:200; adrenergic receptor β2 (SC570) - 1:50; adrenergic receptor β3 (SC1473) - 1:20; receptor kinase GRK5 (SC 565) – 1:200; S-100 (Z0311) - 1:300; tyrosine hydroxylase (MAB318) - 1:50.

The antibody for S-100 was from Dako , Denmark. The antibodies for tyrosine hydroxylase and muscarinic receptors were from Chemicon , USA. The antibodies for the adrenergic receptors and GRK-5 were from Santa Cruz Biotechnology, USA.

Statistical analysis

Initially, absolute and relative frequencies were calculated for categorical variables, and measures of central tendency and dispersion for numeric ones. Chi square and Student’s t test were used to compare cases and controls. Parametric tests were used after the Kolmogorov-Smirnov normality test was performed for all variables, and therefore robust error estimators were used in regressive models. An ANOVA One-Way was performed considering each set of equal samples to identify differences between them. Analysis of covariance was also performed for atrial dimensions and β-blocker use adjustment, when appropriate, while analyzing the individual sections. General linear models, also known as nested ANOVA, of all histological samples for each one of the individual participants, were applied to identify the impact of the principal determinant (namely, treatment, a between-subjects factor) on the various dependent variables. Finally, multiple general linear nested models were applied to all histological sections for each case. We considered significant p values to be lower than or equal to 0.05. In all models, Bonferroni adjustment in p values was performed. Analyses were done using SPSS v.23, IBM, Inc.

As in our previous study of fibrosis and histological features, since left atrial volume differs between patients with and without permanent AF, we performed a sensibility analysis with adjusted means considering the differences in left atrium size. Then, we predicted the results of each variable in hearts of any group with a given left atrium size to verify if potential differences between groups could be linked to this covariable. Additionally, β-blocker use was included for β-receptor and GRK-5 expression adjusted analysis.

Results

The clinical, morphological, and echocardiographic characteristics of patients with permanent AF and their controls are shown in Table 1 .

Table 1

– Clinical and echocardiographic data from patients with permanent AF and control cases

Variables	Cases with pAF (n=13)	Controls (n=13)	p
Male patients [n/(%)]	5 (38.5)	8 (61.5)	0.24Ϯ
Age (years) [mean/(sd)]	67.5 (15.4)	65.5 (11.4)	0.71¥
Underlying heart disease [n/(%)]
Ischemic heart disease	4 (30.8)	4 (30.8)
Valve disease, including RHD	4 (30.8)	4 (30.8)
Hypertensive cardiopathy	2 (15.4)	2 (15.4)
Idiopathic dilated cardiomyopathy	2 (15.4)	2 (15.4)
Chagas’ disease	1 (7.7)	1 (7.7)
Weight (kg) [mean/(sd)]	66.5 (14.1)	63.8 (15.0)	0.67¥
Height (cm) [mean/(sd)]	162.4 (14.7)	160.8 (8.8)	0.78¥
BMI (kg/m2) [mean/(sd)]	25.0 (2.9)	24.5 (4.2)	0.74¥
Diabetes mellitus [n/(%)]*	3 (23.1)	3 (25.0) (n=12)	0.99Ϯ
Beta-blocker use	5 (38.4)	5 (38.4)
Systemic arterial hypertension – [n/(%)]*	9 (69.2)	4 (33.3) (n=12)	0.07Ϯ
Left atrium volume at echo (mL) [mean/(sd)]	83.2 (38.4)	47.9 (40.8)	0.03¥
LV septum thickness (mm) [mean/(sd)]	10.3 (2.4)	10.4 (1.6)	0.94¥
LV ejection fraction [mean/(sd)]	49.8 (20.1)	46.1 (19.8)	0.67¥
Collagen/collagen+myocardium ratio [mean +(sd)]	0.26 (0.09)	0.23 (0.06)	0.35¥

pAF: permanent atrial fibrillation; n: number of cases; sd: standard deviation; RHD: rheumatic heart disease; BMI: body mass index; * no information regarding one control patient; echo: echocardiogram; LV: left ventricle. ¥ t test; Ϯ chi-square. Adapted from Oliveira IM et al.

Data concerning nerve fibers and considering each sample and all samples are presented in Table 2 . When considering each location separately, we observed no difference regarding the density of intrinsic autonomic nerve fibers. The analysis considering all samples showed an increase in sympathetic nerves in patients with AF (8.53±20.25/cm2vs 2.67±4.57/cm2and p=0.04). After adjusting for the size of the left atrium, both parasympathetic nerves and the total amount of nerve fibers were also increased. Figure 2 (A and B) shows the immunoexpression of nerve fibers in our samples.

Table 2

– Autonomic nerve fibers from hearts of patients with permanent AF and control cases

Fibers	All (S100) (units/cm2)		Sympathetic nerve (TH+) (units/cm2)		Parasympathetic nerve (TH-) (units/cm2)
Group	pAF	Control	pAF	Control	pAF	Control
RA - posterior wall	8.85±9.40	9.10±5.15	0.37±0.99	0.50±1.14	8.48±9.57	8.59±5.07
	p 0.935,	0.710¥	p 0.753,	0.905¥	p 0.971,	0.700¥
LA - junction of the left superior pulmonary vein	41.61±35.79	25.78±20.90	19.74±34.26	4.95±6.78	21.86±14.78	20.83±20.47
	p 0.181,	0.256¥	p 0.140,	0.158¥	p 0.884,	0.918¥
LA - middle of the route of the vein of Marshall	40.15±60.28	14.90±9.48	5.58±9.56	2.39±4.76	34.56±58.07	12.51±9.48
	p 0.149,	0.390¥	p 0.292,	0.230¥	p 0.189,	0.500¥
FP - superior left	38.05±55.72	19.25±11.95	8.42±16.07	2.85±2.82	29.62±40.56	17.47±10.53
	p 0.246,	0.637¥	p 0.248,	0.666¥	p 0.325,	0.681¥
Overall samples	32.16±45.76	17.26±14.20	8.53±20.25	2.67±4.57	23.63±36.77	14.80±13.27
	p 0.136&,	0.001Ϯ	p 0.044&,	0.017Ϯ	p 0.237&,	0.001Ϯ

Data presented as mean±standard deviation. Overall locations include all samples from each heart. pAF: permanent atrial fibrillation; LA: left atrium; RA: right atrium; FP: fat pad. p value ANOVA not adjusted, ¥ ANOVA adjusted by left atrium volume; & Nested ANOVA not adjusted; Ϯ Nested ANOVA adjusted by left atrium volume.

Figure 2

– A) Nerve fibers strongly positive for tyrosine hydroxylase, thus considered to be sympathetic fibers; B) Photomicrograph of the image analysis system display showing nerves stained by S-100 protein; C and D) Negative (C) and positive (D) areas of myocardial sections with immunohistochemical reaction for muscarinic receptor 1.

Results regarding the expression of muscarinic and adrenergic receptors and GRK-5 are presented in Table 3 . The results are divided by myocardial area for each location and atrial sample.

Table 3

– Muscarinic and β-adrenergic receptor expression in hearts of patients with permanent AF and control cases

Receptor	Group	RA - posterior wall			LA - midpoint of Marshall vein			LA - junction of the left superior pulmonary vein			LA - near the left superior fat pad			Overall samples
			p	p*		p	p*		p	p*		p	p*		p	p**
M1	pAF	6.47±3.39	0.001	0.002	5.56±4.64	0.021	0.131	6.32±5.33	0.286	0.270	5.15±4.89	0.038	0.220	5.87±4.52	<0.001	0.032
	Control	2.77±1.38			2.22±1.48			4.30±4.03			2.12±0.93			2.85±2.40
M2	pAF	7.60±5.95	0.762	0.982	5.64±3.54	0.110	0.066	7.84±4.13	0.198	0.107	5.65±2.41	0.039	0.038	6.69±4.26	0.760	0.666
	Control	6.93±5.15			3.73±2.12			14.24±16.88			3.62±2.41			7.14±9.73
M3	pAF	43.50±19.08	0.105	0.315	37.61±20.97	0.296	0.281	41.90±18.88	0.546	0.281	31.00±13.27	0.025	0.151	38.51±18.34	0.069	0.291
	Control	31.04±18.61			29.10±18.80			46.50±19.61			20.10±9.58			31.71±19.21
M4	pAF	9.14±5.47	0.201	0.169	9.90±6.67	0.023	0.049	7.64±4.00	0.690	0.618	8.18±11.72	0.192	0.678	8.71±7.37	0.016	0.213
	Control	5.76±4.74			4.44±4.56			8.42±5.66			3.76±1.95			5.59±5.45
M5	pAF	18.94±11.93	0.302	0.704	12.90±11.34	0.368	0.645	20.92±22.81	0.737	0.946	12.06±9.32	0.570	0.977	16.21±14.88	0.212	0.507
	Control	14.51±9.37			8.67±12.14			18.30±15.91			9.83±10.39			12.83±12.47
β1	pAF	43.90±12.39	0.975	0.742	47.59±21.40	0.036	<0.001	37.48±21.90	0.438	0.288	40.23±22.37	0.552	0.214	42.05±19.75	0.295	0.520
	Control	44.10±17.81			28.98±19.34			43.60±17.42			34.89±22.83			37.89±19.93
β2	pAF	23.81±11.96	0.785	0.445	32.42±19.20	0.180	0.589	20.57±13.48	0.323	0.257	23.47±16.69	0.037	<0.001	24.80±15.61	0.408	0.081
	Control	25.48±17.51			23.04±13.88			27.63±21.32			12.38±7.00			22.14±16.46
β3	pAF	39.32±20.29	0.911	0.469	36.36±26.36	0.422	0.940	36.45±11.81	0.351	0.281	37.50±18.53	0.177	0.314	37.41±18.17	0.406	0.039
	Control	38.40±20.45			29.04±20.40			42.38±19.10			26.89±20.31			34.18±20.53
GRK5	pAF	49.81±18.49	0.899	0.976	44.84±18.78	0.999	0.147	53.43±15.28	0.796	0.862	55.45±16.53	0.086	0.320	51.16±17.17	0.284	<0.001
	Control	50.53±7.61			44.85±19.75			52.95±13.26			43.29±18.00			47.66±15.39

Data presented as the mean proportion (%) ± standard deviation. pAF: permanent atrial fibrillation; LA; left atrium; RA: right atrium. p value ANOVA not adjusted. *Anova adjusted by left atrium volume for M1 to M5, and by left atrium volume and β-blocker use in β1 to β3 and GRK5.**Nested Anova adjusted by left atrium volume for M1 to M5 and by left atrium volume and β-blocker use in β1 to β3 and GRK-5.

Immunostaining for muscarinic receptors is shown in Figure 2- C and D . There was no remarkable difference between the subepicardial and subendocardial regions. In hearts from patients with permanent AF, the expression of all types of muscarinic receptors (except type 5) was increased in at least one location. We observed more changes in the left superior fat pad and the oblique vein of the left atrium (vein of Marshall). Nevertheless, after adjusting for left atrial size, only the difference in M1 expression in the right atrium (and, consequently, the overall evaluation) and M2 near the fat pad remained significant.

Concerning β-adrenergic receptors and GRK-5, no difference was found in the overall analysis of the β-adrenergic subtypes 1 and 2 (only an increase in one sample each). However, β-3 and GRK-5 presented increased expression in all samples in the adjusted analysis. No difference was detected between patients who were taking β-blockers and those who were not (data not shown).

Discussion

The fibers of the ICANS in permanent AF

The ICANS is a neural network composed of nerve fibers and ganglia plexuses (GP) (sympathetic and parasympathetic) found in the heart and large adjacent veins.[16] ICANS plays an important role in the physiopathology of AF, as demonstrated by electrical stimulation or parasympathomimetic injections.[17] The current data reflects not only the activation of either a sympathetic or parasympathetic pathway, but also a change in the balance between their actions that is involved in the initiation of AF.[8 , 18]

In this study, we performed a comprehensive analysis of ICANS, focusing both on the nerves and on the muscarinic and beta-adrenergic receptors. We observed an increase in the amount of autonomic nerve fibers, especially atrial sympathetic nerves. However, when analyzing each location in isolation, these differences were not maintained. Moreover, when we adjusted for left atrium (LA) volume, the results remained the same. These last results also indicate that there is a significant change in nerve density in patients with permanent AF, even taking LA enlargement into consideration.

Several articles[12 , 14 , 19 , 20] have reported increased autonomic innervation in areas related to AF in terms of electrophysiology, such as the pulmonary veins, the coronary sinus, and the vein of Marshall. These studies only compared the nerve density (parasympathetic or sympathetic) in these regions, or in other areas, with the GP in the atrial myocardium. However, these regions, close to GP, are described as having higher nerve density, but they are not necessarily related to AF. Our results reveal a higher concentration of ICANS at these regions, especially sympathetic innervation. The greater sympathetic density of nerves may be a potential trigger of arrhythmia caused by innervation close to the GP, and the resulting activation of the autonomic nervous system that has already been demonstrated in experimental studies.[12 - 20]

Muscarinic receptors in permanent atrial fibrillation

The stimulation of the postganglionic parasympathetic neurons releases acetylcholine (cholinergic mediator), which acts on muscarinic receptors in the cell membrane in target organs (in the heart´s case, these would be the myocytes). Five types have been described.[21] The presence of all of these receptor types (M1 to M5) in the human heart was demonstrated by Wang et al.[22] in a descriptive study of right atrial samples from 4 patients undergoing coronary artery bypass surgery.[22] In the present study, the expression of all receptors (except M5) was increased in the hearts of patients with AF compared to the expression in the hearts of the controls. The expression of the M1 receptor was the most significantly altered, even in adjusted analyses, as shown in Table 3 . All locations exhibited significant increase of this receptor, except at the junction of the left superior pulmonary vein. The increase in M1 in the myocardium of patients with permanent AF can be directly related to the permanent AF itself, which helps to explain the previously described increase in sympathetic tonus by the release of catecholamine in the sympathetic nerve endings, with a catecholamine-induced stimulatory effect.[23]

Receptor types 2, 3, and 4 were increased in patients with AF in only one location: 2 and 3 were increased near the superior left fat pad, and 4 was increased in the region of the vein of Marshall. In addition to the M1 and M2 receptors, M4 receptors have been found in the sympathetic ganglia and may be catecholamine-induced, similar to the M1 receptor. According to the study by Makino et al., the vein of Marshall has increased sympathetic nerve fibers and parasympathetic ganglia, and it may have an actual role linked to the enhanced expression of these receptors.[14] Thus, these affected areas are the ones that are actually more related to AF; only M1 seems to have a more diffuse alteration, reaching both the right and the left atria.

Changes in the expression of muscarinic receptors have been described in experimental models, which may suggest its role in the physiopathology, and perhaps int he treatment of AF. In an experimental study of canine heart failure models, the densities of the M2 and M4 receptors were reduced in atria with AF, and M3 receptors were increased compared to those in samples without AF.[24] It is noteworthy that M2 and M4 inhibit calcium channels, and M2 has inotropic and chronotropic actions.[21 , 22] Thus, one would expect for these receptors to be decreased, and not increased, in permanent AF. The same does not apply to M1 and M3 receptors, which have been documented in other organs as having stimulatory functions.[22] The M5 receptor and its action in the human heart are poorly understood, but the M5 receptor did not differ between the groups.

Our results suggest that the atrial myocardial tissue underlying a GP may be associated with increased muscarinic receptor expression, except in the case of M5. Increased muscarinic receptor expression occurred more often in the portion of the left atrium related to the vein of Marshall.

Despite the fact that we did not evaluate function, some considerations about the physiopathology of permanent AF in humans can be made based on our morphological observations. First, it is necessary to consider the possibility that the changes we found may not be the cause, but rather the effect of AF, by an unclear mechanism. In contrast, the imbalance of the ICANS, as demonstrated in experimental and electrophysiological studies, can be caused by lower activity of cardiac autonomic innervation (in which the reduction of the mean nerve area and the maintenance of the overall density of fibers could have an influence, although it must be mentioned that there was no alteration in the nerve area) with a disproportionate increase in sympathetic innervation. More importantly, increased myocardial expression of muscarinic receptors, especially those related to catecholamine-induced activity (M1, M2, and M4), and in specific regions related to AF (M1 and M3), indicates a possible imbalance in autonomic activity, which could perpetuate this arrhythmia in a permanent manner in human hearts by increasing the sensitivity to atrial stimulus caused by acetylcholine.

β-adrenergic receptors in permanent atrial fibrillation and the use of β-blockers

Despite the great importance of β-adrenergic control of heart rhythm, our data indicate there was no difference in the expression of these receptors or their kinase GRK-5 with the use of β-blockers.

No important differences were found in β-adrenergic types 1 or 2. However, the β3 receptors and GRK-5 kinase were strongly increased in the samples with permanent AF.

Methodological considerations and study limitations

Relatively few studies use pathological methods to study cardiac arrhythmias, mainly because most of the changes that underlie them are essentially electrophysiological, with few morphological repercussions, and because they frequently require laborious cardiac mapping. Once these challenges are faced, however, such methods have the potential to bring significant contributions to the understanding of these diseases. Our approach in this study was to verify types and areas of the autonomic nerve fibers, the expression of muscarinic and adrenergic receptors, and the kinase for adrenergic receptors (GRK-5) in human AF.

Our findings demonstrate that this method is useful to identify alterations when they are present (such as those observed with receptors). Clearly, one of the limitations of this kind of study is that the morphological expression of nerve fibers and receptors does not directly imply they are functional, but we can infer that changes in their myocardial concentration may reflect changes in their activity.

It is worth reinforcing the importance of choosing adequate controls for pathological studies: although AF usually occurs in patients with an underlying disease, most previous reports have used normal hearts as controls.[11] Thus, it is not possible to determine with enough precision which findings are actually related to the arrhythmia. To avoid such bias, our control patients had the same diseases as the patients with AF, as if we had “excluded” the disease both above and below the line in a fraction, leaving only the arrhythmia as an explanation for the differences. Additionally, we utilized samples from patients with permanent AF, with at least 2 years since the time of diagnosis, aiming to be certain that any potential alterations were established.

Conclusions

Increased ICANS innervation and receptors expression remodeling in regions prone to trigger AF may play a role in the condition of patients with permanent AF, secondary to structural heart disease.