Exercise Training Improves Functions of Endothelial Progenitor Cells in Patients with Metabolic Syndrome.

BACKGROUND: Endothelial progenitor cells (EPCs) play an important role in maintaining endothelial function. Metabolic syndrome (MetS) is associated with EPC dysfunction. Although physical exercise has a beneficial impact on EPC activity, its mechanism is not completely clear yet.
OBJECTIVE: The purpose of this study is to investigate the effects of physical exercise on the functions of EPCs and the underlying mechanisms in patients with MetS.
METHODS: Volunteers with MetS were divided into exercise group (n=15) and control group (n=15). Before and after 8 weeks exercise training, EPCs were isolated from peripheral blood. Colony forming unit (CFU) assay, tube-formation assay, the protein expression of endothelial nitric oxide synthase (eNOS), phosphatidylinositol-3-kinase (PI3-K) and protein kinase B (AKT) were determined. A probability value <0.05 was considered to indicate statistical significance.
RESULTS: After 8 weeks, the number of CFUs was significantly increased in the exercise group compared to the control group (p<0.05). In addition, we observed a significant decrease of homeostasis model assessment for insulin resistance (HOMA-IR), endothelin-1, high-sensitive C-reactive protein, and homocysteine levels in the exercise group. Exercise intervention could also enhance tube-formation capacity of EPCs and increase phosphorylation level of eNOS, PI3-K and AKT.
CONCLUSION: Physical exercise enhanced the functions of EPCs. The mechanism may be related to exercise, activating the PI3-K/AKT/eNOS pathway.

Introdução

A síndrome metabólica (SM) compreende um agrupamento de anormalidades como obesidade central, resistência à insulina, dislipidemia e hipertensão.[1] A SM tem prevalência no mundo. A Federação Internacional de Diabetes (FID) estima que um quarto da população adulta mundial tem SM.[2] Pacientes com SM têm demonstrado risco aumentado de doença cardiovascular.[3] Embora a etiologia das complicações vasculares relacionadas à SM não seja totalmente compreendida, a disfunção endotelial pode ser um dos mecanismos possíveis.[4]

As células progenitoras endoteliais (CPEs), originadas da medula óssea, têm a capacidade de circular, se proliferar e se diferenciar em células endoteliais maduras. As CPEs contribuem tanto para a reendotelização quanto para a neoangiogênese, desempenhando um papel vital na manutenção da função endotelial.[5] Estudos anteriores demonstraram que a síndrome metabólica não apenas diminuiu o nível de CPEs circulantes, mas também prejudicou as funções das CPEs.[6,7] Alguns estudos[8,9] relataram que o treinamento físico aeróbio pode melhorar o número de CPEs circulantes em repouso em pessoas saudáveis ou adultos obesos, e as reduções na atividade física reduzem o número de CPEs circulantes.[10] Embora esses achados sugiram que o exercício aeróbio pode modular as funções das CPEs, o mecanismo é pouco compreendido.

O óxido nítrico (NO) é um importante fator de relaxamento dependente do endotélio.[11] Sua produção está comumente associada à expressão e atividade da óxido nítrico sintase endotelial (eNOS). Relatou-se que a SM diminuiu a expressão de eNOS e a produção de NO.[12] O aspecto principal da SM é a resistência à insulina e hiperinsulinemia. Nosso estudo anterior demonstrou que a hiperinsulinemia prejudicou a capacidade de formação de tubos de CPEs por deprimir a fosforilação da eNOS.[13] Nossa hipótese é que o exercício físico pode ativar a via da eNOS das CPEs e restaurar a função comprometida das CPEs.

O objetivo deste estudo é investigar os efeitos do exercício físico nas funções das CPEs e os mecanismos subjacentes em pacientes com SM.

Materiais e Métodos

População do estudo

Os voluntários foram recrutados no centro de exames médicos, o primeiro hospital de Qinhuangdao. Critérios de inclusão: 1. Idade 30–65 anos. 2. Indivíduos com SM. A SM foi definida usando os critérios[14] do Programa Nacional de Informações sobre o Colesterol — Painel de Tratamento de Adultos III (no mínimo, três critérios baseados em cinco componentes: circunferência abdominal, pressão arterial, glicose sanguínea, triglicerídeos (TG) e colesterol lipoproteína de alta densidade (colesterol HDL).[3] Os participantes não fizeram exercícios regulares por seis meses. 4. Os participantes não consumiram álcool por dois meses antes deste estudo. Critérios de exclusão: 1. Indivíduos com doença cardiovascular ou doença cerebrovascular. 2. Tabagista. 3. Pacientes com câncer. 4. Usando medicamentos que afetam a função das CPEs, como estatinas, probucol, metformina, bloqueador do receptor de angiotensina. Os voluntários recrutados (n=30) foram divididos aleatoriamente em grupo exercício (n=15) ou grupo controle (n=15). A randomização foi feita com o uso de envelopes lacrados contendo uma sequência de randomização gerada por computador. Baseamos o tamanho da amostra que usamos neste estudo em dados preliminares. Nosso cálculo de potência considerou um aumento de no mínimo 70% nas UFCs de CPEs com um desvio padrão de 40%. Para uma potência de 0,9 (90%), usando um teste t de duas amostras para comparações, foi necessário um tamanho de amostra de pelo menos 8 em cada grupo. O presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Qinhuangdao First Hospital.

Programa de exercícios

Os voluntários do grupo exercício realizaram um programa de treinos seis dias por semana durante 8 semanas. Fizeram 30 minutos de corrida em esteira mantendo 60% da frequência cardíaca máxima como exercício aeróbio. Também foram submetidos a 30 minutos de exercícios com transpiração, incluindo agachamento, levantamento terra e supino como exercício anaeróbico.[8] Eles podiam começar a se exercitar a qualquer hora do dia.

Exames laboratoriais

Variáveis físicas e antropométricas foram medidas no início e após 8 semanas em ambos os grupos. O índice de massa corporal (IMC) foi calculado dividindo-se o peso em quilogramas pela altura ao quadrado em metros. A circunferência abdominal foi medida na altura do umbigo por meio de fita plástica flexível, com os participantes em pé. A pressão arterial foi medida após os participantes terem descansado por 10 minutos (método da ausculta). Foram coletadas amostras de sangue venoso de todos os participantes no início e após 8 semanas (ao término do programa de exercícios, as amostras de sangue foram coletadas 48 horas depois). Mediu-se colesterol total (TC), TG, colesterol HDL, colesterol lipoproteína de baixa densidade (LDL), homocisteína (Hci), glicose e insulina. A RI foi avaliada usando o Modelo de Avaliação da Homeostase da Resistência à Insulina (HOMA-IR) e foi calculada como HOMA-IR (mmol/L×μU/mL) = glicose em jejum (mmol/L) × insulina em jejum (μU/mL)/22,5. As concentrações séricas de NO, ET-1, proteína C reativa de alta sensibilidade (PCR) foram analisadas usando kits ELISA (Zhuocai Biotech, Xangai, China), seguindo as instruções do fabricante para cada kit.

Cultura de células progenitoras endoteliais

As CPEs foram isoladas e cultivadas, seguindo protocolos previamente descritos.[13] Resumidamente, coletou-se sangue periférico (15 mL) no início e após o programa de treinamento físico. Células mononucleares (CMNs) foram isoladas e cultivadas em placa de seis poços revestida com fibronectina em meio MCBD/F12 com suplementos (10% FBS, VEGF10 ng/ml, bFGF 10 ng/ml, IGF 10 ng/ml, EGF 10 ng/ml, heparina 10 U/ml e antibióticos) (Gibco) a 37 °C em uma incubadora com 5% de CO2. Após mudança de meio no dia 2, o meio foi substituído a cada 3 dias.

Ensaio de unidade formadora de colônias

Células em forma de paralelepípedo surgiram 5 a 7 dias após o início da cultura de CMN.

Após 12 dias de cultivo, a unidade formadora de colônias (UFC) foi identificada por inspeção visual com microscópio invertido (Leica). Um cluster central rodeado por células emergentes foi reconhecido como uma UFC. Realizou-se ensaio UFC em todos os participantes (grupo exercício, n=15 e grupo controle, n=15).

Ensaio de formação de tubos

Realizou-se ensaio de formação de tubos para avaliar o potencial angiogênico das CPEs in vitro.[15] As CPEs foram coletadas e ressuspensas em meio MCBD/DF12 com 2% de soro fetal bovino (FBS). Essas células foram semeadas (50.000 células/poço) em uma placa de cultura de tecidos de 24 poços que havia sido uniformemente revestida com matrigel (BD Labware). As placas semeadas foram incubadas em uma incubadora com 5% de CO2 a 37 ºC durante 4 dias. Os géis foram examinados usando microscopia de contraste de fases (Leica) e utilizou-se o plugin Angiogenesis Analyzer for ImageJ para determinar o comprimento total do segmento tubular, a área total da estrutura tubular e o número de junções de rede em 5 campos selecionados aleatoriamente.

Análise de western blots

Extraiu-se a proteína total das CPEs com tampão de lise para ensaio de radioimunoprecipitação (Beyotime Biotech, Xangai, China). As concentrações de proteína foram determinadas pelo kit de ensaio BCA (Beyotime Biotech). Amostras iguais de proteínas (40 µg) foram carregadas em cada poço de gel proteico Pierce Precise Protein (Thermo-Fisher, Waltham, MA), tendo sido corridas em tampão de corrida 1 × Tris/HEPES/SDS a 100 V por 1 h. Em seguida, as proteínas foram transferidas para membranas de difluoreto de polivinilideno e bloqueadas com BSA a 5% durante 2 h a 25 °C. As membranas foram então incubadas com anticorpos primários a 4 °C durante a noite (1:1000 em BSA/TBS-T a 1%) e com anticorpos secundários (1:2000 em BSA/TBS-T a 1%) em temperatura ambiente por 2 h. As membranas foram lavadas duas vezes com TBS-T por 10 min antes das incubações e uma vez após as incubações. O complexo ligado foi detectado pelo sistema Odyssey Infrared Imaging System (Li-Cor; Lincoln, NE). As imagens foram analisadas no Image Studio Lite versão 5.2 (LI-COR), para obtenção das intensidades integradas. Os anticorpos primários anti-phospho-Akt-Ser473 (1:1.000), anti-Akt (1:1.000), anti-phospho-eNOS-Ser1177 (1:1.000), anti-eNOS (1:1.000), anti-β-actin (1:5.000), anti-PI3-K (1:1.000), anti-phospho-PI3-K (1:1.000) e anticorpo anticoelho produzido em cabras conjugado com peroxidase horseradish (1:5.000) foram adquiridos da Cell Signaling Technology (Beverly, MA, EUA).

Análise Estatística

Todas as análises estatísticas foram realizadas com o software SPSS 17 (SPSS Inc., Chicago, IL, EUA). As variáveis contínuas foram expressas como média±desvio padrão. As variáveis categóricas foram expressas em números. As variáveis categóricas foram comparadas pelo teste exato de Fisher. O teste de Shapiro-Wilk foi usado para testar a normalidade da distribuição. As comparações entre variáveis contínuas foram feitas pelo teste t não pareado entre grupos diferentes. E o teste t pareado foi usado para analisar a significância das comparações intergrupo. Considerou-se um valor de probabilidade <0,05 para indicar significância estatística.

Resultados

Características físicas dos grupos

As características físicas basais e de 8 semanas são apresentadas na Tabela 1. No início do estudo, as características físicas não eram significativamente diferentes entre os dois grupos. Após 8 semanas de exercício físico, a circunferência abdominal e o IMC diminuíram no grupo exercício, embora não apresentassem diferença estatística em relação ao grupo controle.

Tabela 1

– Características dos participantes

	Grupo exercício (n=15)	Grupo controle (n=15)	Valor de p
Idade (anos)	50,71±9,68	50,28±11,34	0,819
Sexo (feminino/masculino)	12/3	11/4	0,664
Altura (cm)	170,91±7,18	170,66±7,46	0,918
Peso (Kg) basal	87,42±11,56	88,22±12,91	0,849
8 semanas	85.41± 10,97	87,51±11,18	0,592
IMC (kg/m2) basal	29,86±2,97	30,04±1,99	0,837
8 semanas	29,32±2,59	29.97±1,91	0,415
Circunferência abdominal (cm) basal	96,13±9,72	97,27±10,24	0,746
8 semanas	94,46±9,06	96,94±9,69	0,456
PAS (mmHg) basal	140,53±5,66	135,66±6,36	0,380
8 semanas	138,56±5,91	134,72±5,54	0,111
PAD (mmHg) basal	81,73±8,95	79,22±9,38	0,441
8 semanas	84,86±6,17	82.11± 7,58	0,614

IMC: índice de massa corporal; PAS: pressão arterial sistólica; PAD: pressão arterial diastólica; PCR: proteína C reativa. O valor de p se refere à comparação entre o grupo exercício e o grupo controle (utilizou-se o teste t pareado ou o teste exato de Fisher).

O exercício físico diminuiu a resistência à insulina e o marcador de inflamação

Após 8 semanas, os pacientes do grupo exercício apresentaram menor nível de insulina e HOMA-IR do que os do grupo controle. Esse resultado indicou que o exercício físico pode diminuir a resistência à insulina em pacientes com SM. Os resultados também mostram que marcadores de inflamação como PCR e ET-1 apresentavam-se menores no grupo exercício. O nível de Hci mostrou-se reduzido no grupo exercício. No entanto, não houve diferença significativa de glicose, NO, TG, TC, colesterol LDL e colesterol HDL entre os dois grupos. Para conferir mais detalhes, consulte a Tabela 2.

Tabela 2

– Comparação dos parâmetros laboratoriais entre os grupos

	Grupo exercício (n=15)	Grupo controle (n=15)	Valor de p
CT (mmol/L) basal	4.61±1,45	4,39±1,23	0,618
8 semanas	4,24±1,24	4,25±1,34	0,980
TG (mmol/L) basal	2,19±0,71	1,92±0,89	0,352
8 semanas	2,24±0,83	2,05±0,87	0,515
Colesterol LDL (mmol/L) basal	2,58±1,02	2,51±0,89	0,623
8 semanas	2,47±0,91	2,61±0,95	0,753
Colesterol HDL (mmol/L) basal	1,03±0,21	1,06±0,18	0,623
8 semanas	1,06±0,12	1,05±1,05	0,763
Hci (μmol/L) basal	14,84±6,99	15,13±4,68	0,774
8 semanas	11,31±3.07#	14,91±2,96	0,020
PCR-us (mg/L) basal	3,44 ±2,72	4.98± 3,22	0,338
8 semanas	1,75±0.94#	3,88±2,13	0,047
Glicose (mmol/L) basal	7,05±1,39	7,14±2,95	0,536
8 semanas	6,51±3,95	6,59±2,02	0,374
Insulina (UI/mL) basal	7,49±4,45	6,67±3,12	0,746
8 semanas	5,48±2.96#	7,59±3,89	0,039
HOMA-IR basal	2.91± 1,91	2,76±0,61	0,645
8 semanas	2,08±1.25#	2,81±0,76	0,037
ON (μmol/L) basal	137.41± 94,17	154,82±87,12	0,585
8 semanas	141,92±40,62	167,15±119,89	0,139
ET-1 (μmol/L) basal	2,71±1,18	2,61 ±1,28	0,998
8 semanas	1,62±0.66#	2,51±1,17	0,041

HOMA-IR: modelo de avaliação da homeostase da resistência à insulina; CT: colesterol total; TG: triglicerídeos; LDL: lipoproteína de baixa densidade; HDL: lipoproteína de alta densidade; PCR-us: proteína C reativa ultrassensível. Hci: homocisteína; ON: óxido nítrico; ET-1: endotelina-1. O valor de p se refere à comparação entre grupos diferentes (teste t pareado). #p<0,05 em comparação com os valores basais (teste t pareado).

O exercício físico aumentou a formação de colônias de CPEs

Surgiram colônias de CPEs 5 a 7 dias após o início da cultura de CMN. A colônia exibiu morfologia de “paralelepípedo” e padrão de crescimento em monocamada (Figura 1).

Figura 1

– Colônia de CPEs cultivadas. A) Seis dias após a cultura, apareceram CPEs em formato de paralelepípedo (aumento de 100 ×). B) Doze dias após a cultura, colônia de CPEs (aumento de 50 ×).

Conforme mostrado na Figura 2, após 8 semanas de exercício físico, o número de UFCs de CPEs apresentou-se maior no grupo exercício do que no grupo controle (p<0,05).

Figura 2

– O exercício físico aumentou as UFCs de CPEs. Aumento de UFCs de CPEs no grupo exercício após 8 semanas. *p<0,05 comparação entre o grupo exercício e o grupo controle; #p<0,05 comparação com os valores basais.

O exercício físico melhorou a capacidade de formação de tubos de CPEs

Como mostra a Figura 3, as CPEs formaram redes tubulares no matrigel. O comprimento total da rede tubular, a área total da rede tubular e o número de junções foram medidos pelo sistema de análise de imagem. Após 8 semanas de exercício físico, as CPEs do grupo exercício demonstraram formação de rede aumentada, em comparação com o grupo controle (p<0,05) (ver tabela 3).

Figura 3

– O exercício físico melhorou a capacidade de formação de tubos das CPEs. A: grupo controle no início do estudo; B: grupo controle após 8 semanas; C: grupo exercício no início do estudo; D: grupo exercício após 8 semanas. A figura mostra redes tubulares formadas por CPEs em matrigel. Após 8 semanas, as CPEs do grupo exercício tinham redes tubulares mais longas e melhores.

Tabela 3

– Comparação da capacidade de formação de tubos entre o grupo exercício e o grupo controle

	Grupo exercício (n=15)	Grupo controle (n=15)	Valor de p
Comprimento (μm/campo) basal	2913.20± 662,05	2512,01±829,46	0,154
8 semanas	3982,67 ±832.94#	2713,33±705,57	0,000
Área (μm2/campo) basal	278,60±93,34	274,86±95,57	0,915
8 semanas	440,66±100,74#	276.01± 72,88	0,000
Junção (/campo) basal	8,93±3,59	9,06±2,84	0,911
8 semanas	12,60±2.74#	8,93±2,08	0,001

O valor de p se refere à comparação entre o grupo exercício e o grupo controle (utilizou-se o teste t pareado). #p<0,05 em comparação com os valores basais (utilizou-se teste t pareado).

O exercício físico aumentou a fosforilação de PI3-K/Akt/eNOS

Não houve diferença na expressão da proteína fosforilada de PI3-K, AKT e eNOS no início do estudo. Após o programa de 8 semanas, conforme mostram as figuras 4–6, o exercício físico aumentou o nível de fosforilação de PI3-K, AKT e eNOS em CPEs em comparação com o grupo controle (p<0,05).

Figura 4

– Western blot da eNOS. O exercício físico pode aumentar o nível de fosforilação da eNOS de CPEs. N=4, *p<0,05 comparação entre o grupo exercício e o grupo de controle; #p<0,05 comparação com os valores basais.

Discussão

O presente estudo demonstrou que oito semanas de exercício físico podem melhorar as funções das CPEs em pacientes com SM. O mecanismo pode estar relacionado ao exercício de ativação da via PI3-K/AKT/eNOS.

As CPEs estão envolvidas na neovasculogênese e na manutenção da integridade vascular. Um estado alterado de CPEs circulantes representa um marcador de disfunção endotelial.[3] De fato, alguns estudos indicaram que o número de CPEs circulantes é um indicador independente da saúde cardiovascular.[16,17] Nosso estudo anterior demonstrou que os pacientes com SM tiveram um nível significativamente reduzido de CPEs circulantes em comparação com os do grupo controle saudáveis.[6] O estudo de Jialal et al. mostra que CPEs de indivíduos com SM apresentam capacidade clonogênica significativamente comprometida, unidades formadoras de colônias reduzidas e capacidade comprometida de incorporação em estruturas tubulares.[7] O exercício físico é um importante estímulo fisiológico para mobilizar as CPEs em indivíduos saudáveis.[18] Como sabemos, as CPEs são um grupo heterogêneo de células.[19] Existem dois tipos de CPEs circulantes: as CPEs early e as células endoteliais maduras (OEC, do inglês outgrowth endothelial cell). As CPEs early são células fusiformes e não têm capacidade de formar colônias. Os OECs têm potencial de formação de colônias e aparência de paralelepípedos. Os OECs têm maior capacidade aderente e de formação tubular. São mais importantes na angiogênese do que as CPEs early.[8] No presente estudo, observamos colônias de células em forma de paralelepípedo, mas não de células fusiformes. Nossos resultados indicaram que o exercício físico aumentou a UFC de CPEs em pacientes com SM.

Os resultados deste estudo indicaram que o exercício físico melhorou a capacidade de formação de tubos das CPEs. Esses achados estão de acordo com estudos anteriores. Silva et al. apontaram que o exercício físico pode preservar a função endotelial em camundongos obesos.[11] Choi et al.[8] demonstraram que o exercício regular aumentou a UFC de CPEs em indivíduos saudáveis.[8] O estudo de Landers-Ramos et al. mostrou que 10 dias de exercício físico aeróbio foram suficientes para aumentar o número de células CD34+/KDR+ e KDR+ e melhorar a dilatação fluxo-mediada em idosos previamente sedentários.[20] Embora esses estudos tenham demonstrado os benefícios do exercício físico, seu mecanismo ainda não está elucidado. O presente estudo mostra que o exercício físico elevou a fosforilação da eNOS das CPEs. Como sabemos, a biodisponibilidade de óxido nítrico é um importante regulador da reatividade vascular e da função endotelial. Além de promover o vasorrelaxamento, regula a angiogênese em resposta à isquemia tecidual.[12] A diabetes pode prejudicar a função das CPEs modificando os mecanismos relacionados ao óxido nítrico. Chen et al. apontaram que a fosforilação da eNOS e a produção de NO em meio de cultura de CPEs se reduziu quando as células foram incubadas em 25 mmol/L de glicose em comparação com 5 mmol/L de glicose.[21] A via PI3-K/Akt/eNOS é uma via clássica para promover a produção de NO e desempenha um papel vital na regulação da angiogênese de CPEs. Nosso estudo anterior constatou que a hiperinsulinemia deprimiu a fosforilação da eNOS por meio da depressão da via PI3-K/Akt, associada ao comprometimento da capacidade de formação de tubos das CPEs.[13] O presente estudo indicou que o exercício físico pode ativar a via PI3-K/Akt/eNOS em pacientes com SM. Como resultado, o exercício físico restaurou o comprometimento da capacidade de formação de tubos de CPEs em pacientes com SM.

A função endotelial depende do delicado equilíbrio entre vasodilatadores e vasoconstritores.[22] Como um forte vasoconstritor, a ET-1 elevada desempenha um papel fundamental no desenvolvimento da disfunção endotelial. Nossos resultados demonstraram que o exercício reduziu as concentrações circulantes de ET-1 na SM. Esse achado está de acordo com o estudo de Dow et al.[23] A redução da ET-1 pode ser um mecanismo importante subjacente à melhora induzida pelo exercício na vasodilatação dependente do endotélio.

Limitações

Em primeiro lugar, nós não exploramos a secreção parácrina de CPEs. Embora tenhamos detectado citocinas como NO, PCR, Hci e ET-1 em circulação, não detectamos citocinas em meio de cultura de CPEs. Em segundo lugar, não medimos a dilatação fluxo-mediada (FMD) em pacientes com SM. A FMD é um tipo de método ubíquo para avaliar a função endotelial. Mas não medimos a FMD porque a FMD não tem sensibilidade suficiente na SM. Em terceiro lugar, a síndrome metabólica pode induzir apoptose de CPEs. Porém, neste estudo, não detectamos apoptose de CPEs. Em quarto lugar, os mecanismos relacionados ao exercício físico são muito complexos. O exercício pode influenciar a inflamação e o estresse oxidativo. Os resultados deste estudo mostram que o exercício físico diminuiu o nível circulante de PCR e Hci, indicando que o exercício físico pode diminuir a inflamação e o estresse oxidativo em pacientes com SM. Mas ainda não sabíamos a correlação entre inflamação e disfunção de CPEs.

Conclusões

Em conclusão, este estudo demonstrou que oito semanas de exercício físico melhoraram as funções das CPEs em pacientes com SM. O mecanismo pode estar relacionado ao exercício de ativação da via PI3-K/AKT/eNOS. Este estudo também revelou que o exercício deprimiu a inflamação e o estresse oxidativo em pacientes com SM. Mas não sabíamos a correlação de inflamação e disfunção de CPEs.

Introduction

Metabolic syndrome (MetS) comprises a cluster of abnormalities, including central obesity, insulin resistance, dyslipidemia and hypertension.[1] MetS is prevalent in the world. The International Diabetes Federation (IDF) estimates that one-quarter of the world’s adult population has MetS.[2] Patients with MetS have been shown to have an increased risk for cardiovascular disease.[3] Although the etiology of MetS related to vascular complications is not fully understood, endothelial dysfunction maybe one of the possible mechanisms.[4]

Endothelial progenitor cells (EPCs), originating in the bone marrow, have the capacity to circulate, proliferate, and differentiate into mature endothelial cells. EPCs contribute to both reendothelialization and neoangiogenesis, thereby EPCs play a vital role in maintaining endothelial function.[5] Previous studies demonstrated that metabolic syndrome did not only decrease the levels of circulating EPCs, but also impaired the functions of EPCs.[6,7] Some studies[8,9] reported that aerobic exercise training could improve the number of resting circulating EPCs in healthy people or obese adults, and reductions in physical activity reduce the number of circulating EPCs.[10] Although these findings suggest that aerobic exercise may modulate EPC functions, the mechanism is poorly understood.

Nitric oxide (NO) is an important endothelium-dependent relaxant factor[11] Its production is commonly associated with expression and activity of endothelial nitric oxide synthase (eNOS). It was reported that MetS decreased expression of eNOS and production of NO.[12] The core of MetS is insulin resistance and hyperinsulinemia. Our previous study demonstrated that hyperinsulinemia impaired tube-formation ability of EPCs by depressing eNOS phosphorylation.[13] We hypothesized that exercise training may activate the eNOS pathway of EPCs and restore impaired function of EPCs.

The purpose of this study is to investigate the effects of physical exercise on the EPC functions and the underlying mechanisms in patients with MetS.

Materials and Methods

Study population

Volunteers were recruited from a medical examination center, the first hospital of Qinhuangdao. Inclusion criteria: 1. Aged 30–65. 2. Subjects with MetS. MetS was defined using the criteria[14] of the National Cholesterol Education Program — Adult Treatment Panel-III (at least three criteria based on five components: waist circumference, blood pressure, blood glucose, triglycerides (TG), and high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C).[3] Subjects had no regular exercise for six months. 4. Subjects had not consumed alcohol for two months prior to this study. Exclusion criteria: 1. Subjects with cardiovascular disease or cerebrovascular disease. 2. Smokers. 3. Patients with cancer. 4. On medications known to affect EPC function, such as statins, probucol, metformin, angiotensin receptor blockers. Recruited volunteers (n=30) were randomly divided into exercise group (n=15) or control group (n=15). Randomization was done with sealed envelopes containing a computer-generated randomization sequence. Sample size was based on preliminary data. Our power calculation assumed at least a 70% increase in EPC-CFUs with a standard deviation of 40%. For a required power of 0.9 (90%), using a two-sample t-test for comparisons, a sample size of at least 8 in each group was required. This study was approved by the ethics committee of the Qinhuangdao First Hospital.

Exercise training program

Volunteers from the exercise group performed a training program six days per week for 8 weeks. As an aerobic exercise, they ran on a treadmill for 30 minutes while maintaining 60% of the maximum heart rate. As an anaerobic exercise, they completed 30-minute training wet with perspiration including, squats, deadlifts and bench press.[8] They could start exercise at any time of the day.

Laboratory measurements

Physical and anthropometric variables were measured at baseline and after 8 weeks in both groups. Body mass index (BMI) was calculated as weight in kilograms divided by the square of the height in meters. Waist circumference was measured at the umbilicus level using a flexible plastic tape with the participants in the standing position. Blood pressure was measured after participants had rested for 10 minutes (auscultatory method). Venous blood samples were collected from all participants at baseline and at 8 weeks (when the exercise program finished, blood samples were collected 48 hours later). Total cholesterol (TC), TG, HDL-C, low-density lipoprotein cholesterol (LDL-c), homocysteine (HCY), glucose, and insulin were measured. IR was evaluated using the Homeostasis Model of Assessment of Insulin Resistance (HOMA-IR) and was calculated as HOMA-IR (mmol/L×μU/mL) = glicose em jejum (mmol/L) × insulina em jejum (μU/mL)/22,5. Serum concentrations of NO, ET-1, high-sensitivity C-reactive protein (hsCRP) were analyzed using ELISA kits (Zhuocai Biotech, Shanghai, China), following the manufacturer’s instructions for each kit.

Endothelial progenitor cells culture

EPCs were isolated and cultured, following previously described protocols.[13] Peripheral blood (15 mL) was withdrawn at baseline and after the exercise training program. Mononuclear cells (MNCs) were isolated and cultured on a fibronectin-coated six-well chamber in MCBD/F12 medium with supplements (10% FBS, VEGF10 ng/ml, bFGF 10 ng/ml, IGF 10 ng/ml, EGF 10 ng/ml, heparin 10 U/ml, and antibiotics) (Gibco) at 37 °C in a 5% CO2 incubator. After changing the medium on day 2, the medium was replaced every 3 days.

Colony-forming unit assay

Cobblestone-shaped cells emerged 5 to 7 days after start of the MNC culture.

After 12 days of culture, the colony-forming unit (CFU) was identified by visual inspection with an inverted microscope (Leica). A central cluster surrounded by emerging cells was recognized as a CFU. The CFU assay was performed in all subjects (exercise group, n=15 and control group, n=15).

Tube-formation assay

Tube-formation assay was performed to assess the angiogenic potential of EPCs in vitro.[15] EPCs were collected and resuspended in MCBD/DF12 medium with 2% FBS. These cells were seeded (50.000 cells/well) in a 24-well tissue culture plate, which had been evenly coated with matrigel (BD Labware). Seeded cells were incubated at 37 °C in a 5% CO2 incubator for 4 hours. Gels were examined using phase-contrast microscopy (leica), and the Angiogenesis Analyzer ImageJ plugin was used to determine the total tube-like segment length, the total area of the tubular structure and the number of network junctions in 5 randomly selected fields.

Western blot analysis

The total protein of EPCs was extracted with radioimmunoprecipitation assay lysis buffer (Beyotime Biotech, Shanghai, China). Protein concentrations were determined by BCA assay kit (Beyotime Biotech). Equal protein samples (40 µg) were loaded into each well of Pierce Precise Protein gel (Thermo-Fisher, Waltham, MA) and were run in 1 × Tris/HEPES/SDS running buffer at 100 V for 1 h. Proteins were then transferred to polyvinylidene difluoride membranes and blocked with 5% BSA for 2 h at 25 °C. Membranes were then incubated with primary antibodies at 4 °C overnight (1:1000 in 1% BSA/TBS-T) and with secondary antibodies (1:2000 in 1% BSA/TBS-T) at room temperature for 2 h. Membranes were washed two times with TBS-T for 10 min before incubations and once after incubations. The bound complex was detected using the Odyssey Infrared Imaging System (Li-Cor; Lincoln, NE). The images were analyzed using Image Studio Lite version 5.2 (LI-COR) to obtain the integrated intensities. Primary antibodies including anti-phospho-Akt-Ser473(1:1,000), anti-Akt (1:1,000), anti-phospho-eNOS-Ser1177(1:1,000), anti-eNOS (1:1,000), anti-β-actin (1:5,000), anti- PI3-K (1:1,000), anti-phospho-PI3-K (1:1,000) and horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG (1:5,000) were purchased from Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA).

Statistical Analysis

All statistical analyses were performed by SPSS 17 (SPSS, Chicago, IL, USA). Continuous variables were expressed as mean±standard deviation. Categorical variables were expressed as numbers. Categorical variables were compared with the Fisher’s exact test. The Shapiro-Wilk test was used to test for normality of distribution. Comparisons between continuous variables were made by unpaired t test between different groups. And paired t test was used to analyze the significance of within-group comparisons. A probability value <0.05 was considered to indicate statistical significance.

Results

Physical characteristics of both groups

Baseline and 8-week physical characteristics are presented in Table 1. At baseline, the physical characteristics were not significantly different between the two groups. After 8 weeks of exercise training, waist circumference and BMI were decreased in the exercise group, although they had no statistical difference compared to the control group.

Table 1

– Participant characteristics

	Grupo exercício (n=15)	Grupo controle (n=15)	Valor de p
Age (years)	50.71±9.68	50.28±11.34	0.819
Gender (male/female)	12/3	11/4	0.664
Height (cm)	170.91±7.18	170.66±7.46	0.918
Baseline weight (Kg)	87.42±11.56	88.22±12.91	0.849
8 weeks	85.41± 10.97	87.51±11.18	0.592
Baseline BMI (kg/m2)	29.86±2.97	30.04±1.99	0.837
8 weeks	29.32±2.59	29.97±1.91	0.415
Baseline waist circumference (cm)	96.13±9.72	97.27±10.24	0.746
8 weeks	94.46±9.06	96.94±9.69	0.456
Baseline SBP (mmHg)	140.53±5.66	135.66±6.36	0.380
8 weeks	138.56±5.91	134.72±5.54	0.111
Baseline DBP (mmHg)	81.73±8.95	79.22±9.38	0.441
8 weeks	84.86±6.17	82.11± 7.58	0.614

BMI: body mass index; SBP: systolic blood pressure; DBP: diastolic blood pressure. p value refers to comparison between exercise group and control group (unpaired t test or Fisher’s exact test were used).

Exercise training decreased insulin resistance and inflammation marker

After 8 weeks, patients from the exercise group had lower levels of insulin and HOMA-IR than those in the control group. This result indicated that exercise training could decrease insulin resistance in patients with MetS. The results also show that inflammation markers, including CRP and ET-1, were decreased in the exercise group. HCY were decreased in the exercise group. However, there were no significant differences in glucose, NO, TG, TC, LDL-c and HDL-c between the two groups. For more details, see Table 2.

Table 2

– Comparison of laboratory parameters between groups

	Exercise group (n=15)	Control group (n=15)	p value
Baseline TC (mmol/L)	4.61±1.45	4.39±1.23	0.618
8 weeks	4.24±1.24	4.25±1.34	0.980
Baseline TG (mmol/L)	2.19±0.71	1.92±0.89	0.352
8 weeks	2.24±0.83	2.05±0.87	0.515
Baseline LDL-C (mmol/L)	2.58±1.02	2.51±0.89	0.623
8 weeks	2.47±0.91	2.61±0.95	0.753
Baseline HDL-C (mmol/L)	1.03±0.21	1.06±0.18	0.623
8 weeks	1.06±0.12	1.05±1.05	0.763
Baseline HCY (μmol/L)	14.84±6.99	15.13±4.68	0.774
8 weeks	11.31±3.07#	14.91±2.96	0.020
Baseline Hs-CRP (mg/L)	3.44 ±2.72	4.98± 3.22	0.338
8 weeks	1.75±0.94#	3.88±2.13	0.047
Baseline glucose (mmol/L)	7.05±1.39	7.14±2.95	0.536
8 weeks	6.51±3.95	6.59±2.02	0.374
Baseline insulin (UI/mL)	7.49±4.45	6.67±3.12	0.746
8 weeks	5.48±2.96#	7.59±3.89	0.039
Baseline HOMA-IR	2.91± 1.91	2.76±0.61	0.645
8 weeks	2.08±1.25#	2.81±0.76	0.037
Baseline NO (μmol/L)	137.41± 94.17	154.82±87.12	0.585
8 weeks	141.92±40.62	167.15±119.89	0.139
Baseline ET-1 (μmol/L)	2.71±1.18	2.61 ±1.28	0.998
8 weeks	1.62±0.66#	2.51±1.17	0.041

HOMA-IR: homeostasis model assessment for insulin resistance; TC: total cholesterol; TG: triglycerides; LDL-C: low-density lipoprotein cholesterol; HDL-C: high-density lipoprotein cholesterol; Hs-CRP: high-sensitive C-reactive protein; HCY: homocysteine; NO: nitric oxide; ET-1: endothelin-1. p value refers to comparison between different groups (unpaired t test). #p<0.05 compared with baseline (paired t test).

Exercise training increased EPC colony formation

Colonies of EPC emerged 5 to 7 days after start of MNC culture. The colony exhibited “cobblestone” morphology and monolayer growth pattern (Figure 1).

Figure 1

– Figure 1 — Colony of cultured EPCs. A) 6 days after culture, cobblestone-shaped EPCs appeared (100 × magnification). B) 12 days after culture, colony of EPCs (50 × magnification).

As shown in Figure 2, after 8 weeks exercise training, the number of EPC-CFUs was bigger in the exercise group than in the control group (p<0.05).

Figure 2

– Exercise training increased EPC-CFU. EPC-CFU was increased in the exercise group after 8 weeks. * p<0.05 comparison between exercise group and control group; #p<0.05 compared with baseline.

Exercise training improved tube-formation ability of EPCs

As shown in Figure 3, EPCs formed tubular networks on matrigel. Total length of tubular network, total area of tubular network and number of junctions were measured by image analysis system. After 8 weeks exercise training, EPCs in the exercise group demonstrated increased network formation, compared with the control group (p<0.05) (see table 3).

Figure 3

– Exercise training improved tube-formation ability of EPCs. A: control group at baseline; B: control group after 8 weeks; C: exercise group at baseline; D: exercise group after 8 weeks. The figure show that EPCs formed tubular networks on matrigel. After 8 weeks, exercise group EPCs had longer and better tubular networks.

Table 3

– Comparison of tube-formation ability between the exercise group and control group

	Exercise group (n =15)	Control group (n = 15)	p value
Baseline length (μm/field)	2913.20± 662.05	2512.01±829.46	0.154
8 weeks	3982.67 ±832.94#	2713.33±705.57	0.000
Baseline area (μm2/field)	278.60±93.34	274.86±95.57	0.915
8 weeks	440.66±100.74#	276.01± 72.88	0.000
Baseline junction (/field)	8.93±3.59	9.06±2.84	0.911
8 weeks	12.60±2.74#	8.93±2.08	0.001

p value refers to comparison between exercise group and control group (unpaired t test was used). #p<0.05 compared with baseline (paired t test was used).

Exercise training increased PI3-K/Akt /eNOS phosphorylation

There were no differences of phosphorylated protein expression of PI3-K, AKT and eNOS at baseline. After 8 weeks, as shown in figures 4–6, exercise training increased phosphorylation level of PI3-K, AKT and eNOS in EPCs compared with THE control group (p<0.05).

Figure 4

– Western blot of eNOS. Exercise training could increase eNOS phosphorylation level of EPCs. N=4, *p<0.05 comparison between exercise group and control group; #p<0.05 compared with baseline.

Discussion

The present study demonstrated that eight weeks of exercise training could improve EPC functions in patients with MetS. The mechanism may be related to exercise activating the PI3-K/AKT/eNOS pathway.

EPCs are involved in neovasculogenesis and maintenance of vascular integrity. An altered status of circulating EPCs represents a marker of endothelial dysfunction.[3] In fact, some studies indicated that the number of circulating EPCs is an independent indicator of overall cardiovascular health.[16,17] Our previous study demonstrated that patients with MetS had significantly decreased levels of circulating EPCs compared with healthy controls.[6] A study by Jialal et al. found that EPCs from MetS subjects presented significantly impaired clonogenic capacity, decreased colony-forming units, and impaired capacity to incorporate into tubular structures.[7] Exercise training is an important physiological stimulus to mobilize EPCs in healthy individuals.[18] As we know, EPCs are a heterogeneous group of cells.[19] There are two types of EPCs in circulation: early EPCs and outgrowth endothelial cells (OEC). Early EPCs are spindle-shaped cells and have no colony-forming ability. OECs have colony-forming potential and cobblestone shape. OECs have higher adhesive capacity and tubular forming capacity, and are more important in angiogenesis than early EPCs.[8] In the current study, we observed a colony of cobblestone-shape cells but not spindle-shape cells. Our findings indicated that exercise training increased CFUs of EPCs in patients with MetS.

The results of this study indicated that exercise training improved the tube-formation ability of EPCs. These findings are consistent with previous studies. Silva et al. reported that exercise training could preserve endothelial function in obese mice.[11] Choi et al.[8] demonstrated that regular exercise increased EPC-CFUs in healthy individuals.[8] A study by Landers-Ramos et al. showed that 10 days of aerobic exercise training was sufficient to increase CD34+/KDR+ and KDR+ cells number and improve flow-mediated dilation in previously sedentary older adults.[20] Although these studies have demonstrated the benefits of exercise training, its mechanism is not elucidated yet. The current study shows that exercise training elevated phosphorylation of eNOS of EPCs. As we know, nitric oxide bioavailability is an important regulator of vascular reactivity and endothelial function. It does not only promote vasorelaxation but also regulates angiogenesis in response to tissue ischemia.[12] Diabetes may impair EPC function by modifying nitric oxide-related mechanisms. Chen et al. found that eNOS phosphorylation and NO production in EPC culture media was reduced when cells were incubated in 25 mmol/L glucose compared with 5 mmol/L glucose.[21] The PI3-K/Akt /eNOS pathway is a classical pathway to promote NO production and plays a vital role in regulating angiogenesis of EPCs. Our previous study testified that hyperinsulinemia depressed eNOS phosphorylation by depressing the PI3-K/Akt pathway, which was associated with the impaired tube-formation ability of EPCs.[13] The current study indicated that exercise training could activate PI3-K/Akt /eNOS pathway in patients with MetS. As a result, exercise training restored impaired tube-formation ability of EPCs in patients with MetS.

Endothelial function depends on the delicate balance between vasodilators and vasoconstrictors.[22] As a strong vasoconstrictor, high ET-1 plays a key role in the development of endothelial dysfunction. Our results demonstrated that exercise reduced circulating concentrations of ET-1 in MetS. This finding was consistent with a study by Dow et al.[23] Reduction of ET-1 may be an important mechanism underlying the exercise-induced improvement in endothelium-dependent vasodilator function.

Limitations

Firstly, we did not explore paracrine secretion of EPCs. Although we detected cytokines including NO, CRP, HCY and ET-1 in circulation, we did not detect cytokines in the EPC culture medium. Secondly, we did not measure flow-mediated dilation (FMD) in patients with MetS. FMD is a kind of ubiquitous method to evaluate endothelial function. But we did not measure FMD because FMD has not enough sensibility in MetS. Thirdly, metabolic syndrome may induce EPC apoptosis. But in this study, we did not detect apoptosis of EPCs. Fourthly, exercise training-related mechanisms are very complex. Exercise may influence inflammation and oxidative stress. Results of this study show that exercise training decreased circulating levels of CRP and HCY, which indicated that exercise training could depress inflammation and oxidative stress in patients with MetS. But we still did not know the correlation of inflammation and EPC dysfunction.

Conclusions

In conclusion, this study demonstrated that eight weeks of exercise training improved EPC functions in patients with MetS. The mechanism may be related to exercise activating the PI3-K/AKT/eNOS pathway. This study also revealed that exercise depressed inflammation and oxidative stress in patients with MetS. But we did not know the correlation of inflammation and EPC dysfunction.