Association Between Serum Elabela Levels and Chronic Totally Occlusion in Patients with Stable Angina Pectoris.

BACKGROUND: The beneficial effects of Elabela on the cardiovascular system have been shown in studies.
OBJECTIVE: To compare serum Elabela levels of chronic total occlusion (CTO) patients with control patients with normal coronary arteries, and to investigate whether there is a correlation with collateral development.
METHODS: The study was planned cross-sectionally and prospectively. Fifty patients (28.0% female, mean age 61.6±7.3years) with CTO in at least one coronary vessel and 50 patients (38% female, mean age 60,7±6.38 years) with normal coronary arteries were included in the study. Patients in the CTO group were divided into two groups as Rentrop 0-1, those with weak collateral development, and Rentrop 2-3 with good collateral development. In addition to the age, sex, demographic characteristics and routine laboratory tests of the patients, Elabela levels were measured.
RESULTS: Demographic characteristics and laboratory values were similar in both groups. While the mean NT-proBNP and troponin were higher in the CTO group, the Elabela mean was lower (p <0.05 for all). In the multivariate regression analysis, NT-proBNP and Elabela levels were found to be independent predictors for CTO. Also, Elabela level was found to be statistically higher in Rentrop class 2-3 patients compared to Rentrop class 0-1 patients (p<0.05).
CONCLUSION: In our study, we showed that the average Elabela level was low in CTO patients compared to normal patients. In addition, we found the level of Elabela to be lower in patients with weak collateral development compared to patients with good collateral development. (Arq Bras Cardiol. 2021; [online].ahead print, PP.0-0).

Introdução

Define-se oclusão total crônica (OTC) como a obstrução aterosclerótica completa (trombólise em infarto do miocárdio (TIMI) grau 0) do fluxo de artéria coronária, com duração de oclusão estimada de ≥ 3 meses. Os dados sobre a prevalência da OTC resultam de registros de pacientes submetidos a angiocoronariografia por suspeita de doença arterial coronariana (DAC). Assim, desconhece-se a prevalência geral na população (assintomática). A frequência de pelo menos uma OTC varia de 30% a 50% em pacientes com diagnóstico prévio de DAC submetidos a cateterismo cardíaco.

O elabela foi recentemente descoberto como um novo ligante peptídico endógeno do receptor de apelina (APJ), um receptor acoplado à proteína G. A expressão de elabela é mais elevada no tecido cardíaco embrionário e depois diminui gradualmente. O elabela é encontrado principalmente em fibroblastos e células endoteliais do coração. A sinalização de elabela tem se mostrado crucial para o desenvolvimento normal do sistema cardiovascular durante a embriogênese. As funções biológicas do elabela no corpo são semelhantes às do apelina, o ligante do outro receptor de apelina. Em geral, o apelina e o elabela são conhecidos por seus efeitos protetores do sistema cardiovascular. A ligação desse receptor e seus ligantes desempenha algumas funções regulatórias no sistema cardiovascular, sistema nervoso central, sistema circulatório e diversos outros sistemas.,

O elabela e o apelina promovem a angiogênese por meio do APJ. O elabela e o apelina desempenham funções em diferentes estágios da morfogênese vascular. O elabela é mais potente do que o apelina no que diz respeito ao aumento da contratilidade miocárdica e vasodilatação coronariana. Embora o elabela e o apelina compartilhem muitas semelhanças, eles funcionam por meio de diferentes vias de sinalização e têm diferentes atividades biológicas. No entanto, relativamente pouco se sabe sobre as propriedades e funções biológicas do elabela. Evidências crescentes sugerem que o APJ não é o único receptor do elabela. Sugeriu-se que o elabela possa ter diversos efeitos cardioprotetores por meio de vias adicionais., Portanto, são necessários outros estudos para elucidar os mecanismos moleculares e as funções biológicas do elabela e a regulação das vias de sinalização celular.

Diversos estudos na literatura examinaram a função do apelina no corpo humano. No entanto, quase todos os estudos acima mencionados sobre o elabela foram realizados in vitro ou em modelos animais. Recentemente, diversas pesquisas em humanos foram relatadas na literatura., Tanto quanto sabemos, não existem estudos sobre a função do elabela nas doenças cardiovasculares humanas e o seu potencial de tratamento. Em pacientes com OTC, que representa um espectro da doença arterial coronariana, estudos anteriores não investigaram os níveis séricos de elabela em comparação com pacientes com artérias coronárias normais. Tendo em vista que o elabela tem efeitos sobre a angiogênese e arteriogênese, pode ser que haja uma relação entre a extensão do desenvolvimento colateral coronariano e os níveis de elabela. Assim, no presente estudo, nosso objetivo foi investigar os níveis séricos de elabela em pacientes com OTC em comparação com pacientes com artérias coronárias normais e examinar a relação entre o desenvolvimento colateral coronariano e os níveis de elabela.

Método

Desenho do estudo

Trata-se de um estudo transversal. A decisão pela angiografia coronária foi feita de acordo com um teste de esforço não invasivo positivo ou alta suspeita clínica de doença arterial coronariana. O tamanho ou poder da amostra não foi calculado para o estudo. Definiu-se o tamanho da amostra por conveniência. O comitê de ética local aprovou o protocolo deste estudo, conduzido de acordo com os princípios estabelecidos na Declaração de Helsinque. Todos os participantes assinaram consentimento informado por escrito antes do início do estudo.

População do estudo

Cinquenta pacientes com OTC, conforme demonstrado por angiocoronariografia, e 50 pacientes com artérias coronárias normais (grupo controle) foram incluídos no estudo. As características clínicas e demográficas basais da população do estudo, todos os parâmetros laboratoriais de rotina e dados ecocardiográficos foram registrados no formulário especificamente elaborado para este estudo, e gerado para cada paciente. Não houve diferença no tratamento farmacológico entre os pacientes Rentrop 0–1 e 2–3 com OTC.

Definiu-se hipertensão como medidas sistêmicas repetidas da pressão arterial >140/90 mmHg ou uso de medicação anti-hipertensiva. Diagnosticou-se diabetes mellitus de acordo com um dos seguintes critérios: (1) glicemia em jejum ≥126 mg/dL, (2) glicemia >200 mg/dL a qualquer momento, (3) histórico de diabetes mellitus ou pacientes sob medicação antidiabética. Definiu-se hipercolesterolemia como tratamento em curso com hipolipemiantes ou nível basal total de colesterol >200 mg/dL. Definiu-se tabagismo como tabagismo regular nos últimos 6 meses. Definiu-se histórico familiar de doença coronariana como a presença de doença arterial coronariana em parentes de primeiro grau com idade inferior a 55 (masculino) ou 65 (feminino).

Os critérios de exclusão do estudo foram os seguintes: doença cardíaca valvar moderada a grave, doença hepática crônica, doença renal crônica (TFG <60 ml/kg/min), disfunção tireoidiana, fibrilação atrial, síndrome coronariana aguda, malignidade, infecção ativa, doença autoimune, pacientes com idade ≤18 e ≥85.

Parâmetros laboratoriais

Os parâmetros laboratoriais de rotina (glicose, troponina I de alta sensibilidade, porção N-terminal do pró-hormônio do peptídeo natriurético do tipo B, função renal, painel lipídico e hemograma completo) de todos os pacientes foram analisados. Os níveis séricos de elabela foram obtidos por meio de kits comercialmente disponíveis (Sunred Biological Technology, Xangai, China). Mediu-se a isoforma elabela-32. O kit utiliza um ensaio imunoenzimático (ELISA) sanduíche com duplo anticorpo para determinar o nível de elabela em amostras de sangue. Para medir o apelina, o soro foi separado do sangue por centrifugação a 3.000 rpm por 10 min e mantido congelado a −80 °C até a análise. De acordo com o fabricante, esse ensaio tem um coeficiente de variação interensaio inferior a 12% e um coeficiente de variação intraensaio inferior a 10%.

Avaliação angiográfica

Realizou-se angiocoronariografia de rotina pela técnica de Judkins com cateteres cardíacos direito e esquerdo de 6 ou 7 French, sem o uso de nitroglicerina, adenosina ou bloqueador dos canais de cálcio. Os angiogramas foram gravados em mídia digital DICOM a 15 quadros/ms e foram revisados por dois angiógrafos experientes que desconheciam o estado clínico dos pacientes. Artérias coronárias normais foram definidas como ausência de lesões coronárias. As OTCs foram vistas a partir de pelo menos dois ângulos após injeção seletiva de material de contraste. Definiu-se OTC como estenose de 100% do diâmetro luminal quando não havia lúmen perceptível e fluxo anterógrado por mais de 3 meses. As coronariografias foram reavaliadas para circulação colateral por dois cardiologistas intervencionistas experientes completamente cegos para o estudo. A circulação colateral coronariana foi graduada pela classificação Rentrop, onde grau 0=nenhum preenchimento de vasos colaterais; grau 1=preenchimento de ramos laterais arteriais a serem dilatados por canais colaterais sem visualização do segmento epicárdico; grau 2=preenchimento parcial do segmento epicárdico por vasos colaterais; e grau 3=preenchimento completo do segmento epicárdico da artéria dilatada por vaso colateral. Pacientes com desenvolvimento colateral coronário grau 0‒1 foram considerados como grupo colateral ruim, e pacientes com desenvolvimento colateral coronário grau 2‒3 foram considerados grupo colateral bom. Em pacientes com mais de 1 vaso colateral preenchendo o vaso ocluído, utilizou-se para análise o vaso colateral com o maior grau Rentrop.

Análise estatística

Analisou-se a normalidade da distribuição dos dados das variáveis contínuas pelo teste de Kolmogorov-Smirnov. As variáveis com distribuição normal foram apresentadas como média (± desvio padrão) e aquelas sem distribuição normal foram apresentadas como mediana (intervalo interquartil). As variáveis que apresentaram distribuição normal entre os grupos foram comparadas pelo teste t de Student não pareado e aquelas sem distribuição normal foram comparadas pelo teste U de Mann-Whitney. As variáveis categóricas foram expressas em números e porcentagens, e comparadas entre os grupos através do teste exato de Fisher ou do qui-quadrado. Foram utilizadas curvas receiver operating characteristic (ROC) para demonstrar a sensibilidade e especificidade dos valores de corte do elabela para a OTC. Análises de regressão logística binária foram realizadas para determinar preditores independentes de OTC. Variáveis que apresentavam valor de p<0,05 não ajustado na análise univariada foram incluídas na análise multivariada. As análises estatísticas foram realizadas utilizando o software Statistical Package for Social Science (SPSS 20.0) para Windows (SPSS Inc., Chicago, Illinois, EUA). O valor de p<0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

O estudou incluiu cinquenta pacientes com OTC e 50 pacientes com artérias coronárias normais. As características demográficas e clínicas basais dos grupos estudados estão resumidas na Tabela 1. A comparação das características demográficas entre os grupos mostrou que a intervenção coronária percutânea foi mais comumente realizada no grupo OTC (p=0,006). Não houve diferença estatisticamente significativa entre os grupos em termos de idade média, sexo e número de pacientes com hipertensão, diabetes mellitus, hiperlipidemia, doença arterial periférica, insuficiência cardíaca, acidente vascular cerebral e doença pulmonar obstrutiva crônica (todos p>0,05).

Tabela 1

Características demográficas basais e fatores de risco cardiovascular da população do estudo

Variável	Pacientes com OTC (n=50)	Controles (-) (n= 50)	p
Idade, anos	61,6 ± 7,31	60,7 ± 6,38	0,495
Sexo feminino, % (n)	28,0 (14)	38 (19)	0,288
Fração de ejeção ventricular esquerda, %	55,3 ± 7,0	55,7 ± 6,83	0,795
Hipertensão, % (n)	70,0 (35)	50 (28)	0,147
Diabetes mellitus, % (n)	66,0 (33)	50 (25)	0,105
Hiperlipidemia, % (n)	62 (31)	44 (22)	0,071
Doença vascular periférica, % (n)	10,0 (5)	6 (3)	0,461
Acidente vascular cerebral, % (n)	4,0 (2)	2(1)	0,558
Insuficiência cardíaca, % (n)	16,0 (8)	12 (6)	0,564
Doença pulmonar obstrutiva crônica, %(n)	10,0 (5)	18 (9)	0,249
Intervenção coronariana percutânea prévia% (n)	14,0 (7)	0 (0)	0,006
Fumante atual, % (n)	58 (29)	48 (24)	0,316
Histórico familiar de DAC, % (n)	22,0 (11)	24 (12)	0,812

A Tabela 2 apresenta os parâmetros laboratoriais e os níveis de elabela. Os níveis médios de NT-proBNP e troponina apresentaram-se significativamente maiores no grupo OTC do que no grupo controle (p<0,05 para ambos). No entanto, os níveis médios de elabela apresentaram-se significativamente mais baixos no grupo OTC do que no grupo controle (p<0,001). Não houve diferenças significativas entre os grupos em relação a outros parâmetros laboratoriais (todos p>0,05).

Tabela 2

Parâmetros laboratoriais e níveis de elabela dos grupos do estudo.

Variável	Pacientes com OTC (n=50)	Controles (n=50)	p
Glicemia de jejum, md/dL, mediana (IIQ)	102,5 (28,0)	121 (55,0)	0,057
Hemoglobina, g/dL	13,9 ± 1,90	13,2 ± 1,52	0,107
Hematócrito, %	39,9 ± 5,57	39,3 ± 3,95	0,584
Contagem de glóbulos brancos, x103/mL	8,2 ± 2,02	8,4 ± 2,40	0,692
Contagem de plaquetas, x103/mL	265 ± 82	271 ± 51	0,743
Contagem de neutrófilos, x103/mL	5,4 ± 1,68	5,2 ± 1,57	0,357
Contagem de linfócitos, x103/mL	2,2 ± 0,7	2,1 ± 0,6	0,417
Contagem de monócitos, x103/mL	0,6 ± 0,23	0,7 ± 0,29	0,640
Volume médio plaquetário, fL	8,8 ± 1,14	8,8 ± 1,02	0,933
Colesterol total, mg/dl, mediana (IIQ)	206,5 (53,5)	216 (46,5)	0,955
Colesterol LDL, mg/dL, mediana (IIQ)	132,5 (40,5)	147 (34,5)	0,389
Colesterol HDL, mg/dL	42,1 ± 9,5	44,6 ± 8,5	0,236
Triglicerídeos, mg/dL, mediana (IIQ)	173 (103,7)	159 (101,5)	0,147
Ureia, mg/dL	34,9 ± 13,93	33,4 ±7,89	0,580
Creatinina, mg/dL	0,84 ±0,27	0,78 ±0,15	0,275
Albumina, mg/dL	3,7 ± 0,59	3,8 ± 0,34	0,424
Troponina, ng/mL, mediana (IIQ)	6,0 (12,0)	4,0 (7,0)	0,013
Elabela, ng/mL, mediana (IIQ)	0,64 (0,40)	1,20 (1,14)	<0,001
PCR, mg/L, mediana (IIQ)	1,8 (1,4)	1,4 (2,0)	0,506
NT-proBNP, pg/ml, mediana (IIQ)	25,5 (16,5)	16.0(11,0)	0,001
Escore SYNTAX	12,3 ± 7,1	-	-

IIQ: Intervalo Interquartil; LDL: Lipoproteína de baixa densidade; HDL: Lipoproteína de alta densidade; PCR: Proteína C-reativa; NT-proBNP: Porção N-terminal do pró-hormônio do peptídeo natriurético do tipo B.

Em pacientes com OTC, a artéria coronária direita (n=26, 52%) foi o vaso mais afetado, seguida pela artéria descendente anterior esquerda (n=20, 40%), a artéria circunflexa esquerda (n=11, 22%) e múltiplos vasos (n=7, 14%).

Para a previsão de OTC, o valor de corte de <0,9 para elabela apresentou sensibilidade de 84,8% e especificidade de 80,0% (AUC: 0,824; intervalo de confiança de 95%, 0,723–0,924; p<0,001) na análise da curva ROC (Figura 1).

Figura 1

Análise da curva receiver operating characteristic para o Elabela para predição de OTC.

Os pacientes foram divididos em dois grupos de acordo com a classificação Rentrop: Rentrop 0–1 (n=17) e Rentrop 2–3 (n=33). O valor elabela mediano do grupo Rentrop 0–1 (mediana 0,430, IIQ: 0,170) com desenvolvimento colateral ruim foi menor do que o do grupo Rentrop 2–3 (mediana 0,740, IIQ: 0,380) com bom desenvolvimento colateral (p<0,001) (Figura 2).

Figura 2

Relação entre o nível de Elabela e o escore Rentrop (barras de erro: Intervalo de confiança [IC] de 95%).

Os resultados das análises de regressão univariada e multivariada estão resumidos na Tabela III. A análise univariada mostrou que o NT-proBNP, elabela e troponina foram preditores independentes de OTC. No entanto, na análise multivariada, apenas o NT-proBNP (p=0,003) e o elabela (p=0,001) permaneceram como preditores independentes de OTC.

Tabela 3

Análises de regressão logística univariada e multivariada

Análise	Univariada		Multivariada
Variáveis	p	OR [IC de 95%]	p	OR [IC de 95%]
NT-proBNP	0,008	1,071 (1,018- 1,127)	0,003	1,134 (1,043-1.232)
Troponina	0,027	1,100 (1,011-1.197)	-	-
Elabela	<0,001	0,160 (0,112-0.401)	0,001	0.137(0,105-0.358)
Hipertensão	0,149	0,545 (0,239-1.242)	-	-
Diabetes melitus	0,107	0,515 (0,230-1.153)	-	-
Hiperlipidemia	0,073	0,482 (0,217-1.070)	-	-

NT-proBNP: Porção N-terminal do pró-hormônio do peptídeo natriurético do tipo B; IC: intervalo de confiança.

Discussão

O principal achado do nosso estudo foi que os pacientes com OTC apresentaram níveis séricos de elabela mais baixos em comparação com os pacientes com artérias coronárias normais. Além disso, os pacientes com bom desenvolvimento colateral coronariano apresentaram níveis séricos de elabela mais elevados do que pacientes com baixo desenvolvimento colateral coronariano. Até onde sabemos, nosso estudo é o primeiro a examinar a relação entre os níveis séricos de elabela e a OTC e o desenvolvimento colateral coronariano.

O sistema cardiovascular humano contém uma família de peptídeos denominada sistema apelinérgico, composta por receptores de apelina, elabela e APJ. Estudos têm demonstrado que o apelina e o sistema receptor têm alguns efeitos positivos na aterosclerose, infarto do miocárdio (IM), insuficiência cardíaca e hipertensão arterial pulmonar.– Embora o apelina fosse inicialmente considerado o único ligante para APJ, um novo peptídeo denominado elabela foi identificado por pesquisas conduzidas pela equipe do laboratório Reversade. Estudos revelaram que o apelina e o elabela agem via APJ e têm funções semelhantes. Além disso, o elabela demonstrou ser mais potente do que o apelina na produção de efeitos cardíacos positivos. Pacientes com angina estável apresentaram níveis plasmáticos de apelina significativamente mais baixos em comparação com os controles. Além disso, o nível de apelina plasmática esteve negativamente correlacionado com o escore de Gensini em pacientes com síndrome coronariana aguda. Em seu estudo, Weir et al. mostraram que a concentração plasmática de apelina mostrou-se reduzida no período inicial após o infarto agudo do miocárdio, aumentou significativamente ao longo do tempo, mas permaneceu reduzida em 24 semanas. Como a OTC é um evento coronariano tardio, o nível de elabela mostrou-se similarmente menor em pacientes com OTC do que em pacientes com artérias coronárias normais.

A OTC é um subgrupo de doença cardíaca aterosclerótica e está associada a desfechos clínicos negativos. As funções biológicas do elabela em doenças ateroscleróticas foram exploradas recentemente em um estudo recente de Li et al., que propôs o elabela como um possível agente terapêutico para doenças cardiovasculares. O comprometimento da função endotelial está associado à aterosclerose. O elabela é detectado principalmente em fibroblastos no coração e em células endoteliais intactas. Portanto, a produção de elabela diminui em casos de comprometimento da função endotelial. Em nosso estudo, os baixos níveis de elabela verificados no grupo OTC podem ser explicados pela presença de comprometimento da função endotelial.

O desenvolvimento de colaterais coronários é uma resposta à isquemia miocárdica crônica. Os vasos colaterais fornecem um suprimento sanguíneo alternativo para o miocárdio em pacientes com lesões coronárias obstrutivas. O aumento do fluxo sanguíneo colateral coronário pode reduzir os sintomas de angina e eventos cardiovasculares e manter a função contrátil do miocárdio. Existem evidências importantes de que o desenvolvimento circulatório colateral ocorre como resultado da angiogênese e/ou arteriogênese. A sinalização do elabela demonstrou ter um papel fundamental no desenvolvimento do sistema cardiovascular normal durante a embriogênese. O elabela promove angiogênese e arteriogênese via APJ., Em seu estudo, Sharma et al. verificaram que o eixo de sinal elabela-APJ induz a migração de células progenitoras do seio venoso em camundongos e, portanto, desempenha um papel no desenvolvimento dos vasos coronários. Além disso, detectaram defeitos no desenvolvimento de vasos coronários em camundongos sem o sinal elabela-APJ. Em nosso estudo, o alto nível sérico do elabela em pacientes da classe Rentrop 2–3 com bom desenvolvimento colateral em comparação com pacientes da classe Rentrop 0–1 com desenvolvimento colateral ruim pode ser explicado pelos efeitos positivos do elabela na angiogênese e arteriogênese.

Perjes et al. mostraram em camundongos que os níveis de elabela aumentaram no período pós-IM devido aos seus efeitos cardioprotetores, mas diminuíram posteriormente ou após tratamento malsucedido. A OTC, um espectro de doença cardíaca aterosclerótica, é definida como estenose de 100% do diâmetro do lúmen por mais de 3 meses, quando não há lúmen perceptível e fluxo anterógrado. O baixo nível do elabela em pacientes com OTC, conforme encontrado em nosso estudo, é compatível com os achados deste estudo.

Estudos anteriores relataram que o elabela está envolvido em diversos quadros e doenças cardiovasculares. A atividade do sistema apelinérgico aumenta consideravelmente na remodelação após o infarto do miocárdio, na hipertensão arterial, e exerce efeitos benéficos pelo bloqueio do sistema renina-angiotensina-aldosterona. Além disso, os efeitos positivos do elabela na insuficiência cardíaca e na diabetes também foram demonstrados em estudos.,, Em nosso estudo, não houve diferença entre os grupos em termos de hipertensão, diabetes e insuficiência cardíaca.

As evidências atuais dos efeitos cardioprotetores do elabela são escassas. No entanto, estudos in vitro e em animais sugerem que o elabela ou um derivado sintético pode ter potencial terapêutico ou biomarcador para doenças cardiovasculares.

Limitações

O desenho transversal e o tamanho da amostra do estudo são as principais limitações do nosso estudo. Embora medições bioquímicas tenham sido realizadas em nosso estudo, não examinamos o nível do receptor APJ das amostras de tecido. Além disso, não foram obtidas medidas de apelina e APJ, que poderiam ter fornecido mais informações sobre o sistema apelinérgico em pacientes com OTC.

Conclusão

Neste estudo, mostramos níveis reduzidos de elabela em pacientes com OTC. Também observamos uma correlação positiva entre o desenvolvimento colateral coronariano e os níveis séricos de elabela. São necessários estudos de maiores dimensões e mais abrangentes para estabelecer a função do elabela como um biomarcador cardíaco ou agente terapêutico em humanos.

Introduction

Chronic Total Occlusion (CTO) is defined as an atherosclerotic complete obstruction (Thrombolysis in Myocardial Infarction (TIMI) grade 0) of flow of a coronary artery, with an estimated occlusion duration of ≥ 3 months. Data on the prevalence of CTO are derived from registries of patients undergoing coronary angiography for suspected coronary artery disease (CAD); thus, the overall prevalence in the general (asymptomatic) population is unknown. The frequency of at least one CTO ranges from 30% to 50% in patients with a prior diagnosis of CAD who undergo cardiac catheterization.

Elabela was recently discovered as a new endogenous peptidic ligand of the Apelin receptor (APJ), a G protein-coupled receptor. Elabela expression is highest in embryonic heart tissue and then declines gradually. Elabela is mainly found in fibroblasts and endothelial cells in the heart. Elabela signaling has been demonstrated to be crucial for normal development of the cardiovascular system during embryogenesis. The biological functions of Elabela in the body are similar to those of Apelin, the ligand of the other apelin receptor. In general, Apelin and Elabela are known for their protective effects on the cardiovascular system. Binding of this receptor and its ligands plays some regulatory roles in the cardiovascular system, central nervous system, circulatory system and many other systems.,

Elabela and Apelin promote angiogenesis through APJ. Elabela and Apelin play roles in different stages of vascular morphogenesis. Elabela is more potent than Apelin when it comes to increasing myocardial contractility and coronary vasodilation. Although Elabela and Apelin share many similarities they function through different signaling pathways and have different biological activities. However, relatively little is known about the biological properties and functions of Elabela. Mounting evidence suggests that APJ is not the only receptor for Elabela. It was suggested that Elabela may have multiple cardioprotective effects via additional pathways., Therefore, further studies are warranted to elucidate the molecular mechanisms and biological roles of Elabela and the regulation of cellular signaling pathways.

There are several studies in the literature that examined the role of Apelin in the human body. However, almost all of the aforementioned studies on Elabela have been conducted in vitro or in animal models. Recently, a number of research studies in humans have been reported r in the literature., To our best knowledge, there is no study on the role of Elabela in human cardiovascular disease and its treatment potential. In patients with CTO, which represents a spectrum of coronary artery disease, former studies did not investigate serum Elabela levels compared to patients with normal coronary arteries. Since Elabela has effects on angiogenesis and arteriogenesis, there may be a relationship between the extent of coronary collateral development and Elabela levels. Thus, in the present study, we aimed to investigate serum Elabela levels of patients with CTO in comparison to patients with normal coronary arteries and to examine the relationship between coronary collateral development and Elabela levels.

Method

Study design

This was a cross-sectional study. The decision for coronary angiography was made according to a positive noninvasive stress test or high clinical suspicion for a coronary artery disease. Sample size or power was not calculated for the study. The sample size was defined for convenience. The local ethics committee approved the study protocol which was implemented in accordance with the principles established in the Declaration of Helsinki. All subjects signed written informed consent prior to initiation of the study.

Study population

Fifty patients with CTO as demonstrated by coronary angiography and 50 patients with normal coronary arteries (control group) were included in the study. Baseline clinical and demographic characteristics of the study population, all routine laboratory parameters, and echocardiographic data were recorded in the study-specific forms that were generated for each patient. There was no difference in pharmacological treatment between Rentrop Class 0-1 and 2-3 CTO patients.

Hypertension was defined as >140/90 mmHg in repeated systemic blood pressure measurements or use of antihypertensive drugs. Diabetes mellitus was defined according to the presence of one of the following criteria: (1) fasting blood glucose ≥126 mg / dL, (2) blood glucose > 200 mg / dL at any time, (3) a history of diabetes mellitus, or anti-diabetic medication use. Hypercholesterolemia was defined as current treatment with lipid-lowering agents or a baseline total cholesterol level >200 mg/dL. Smoking was defined as regular smoking for the past 6 months. Family history of coronary artery disease was defined as the presence of coronary artery disease in first-degree relatives of males under 55 years of age or females under 65 years of age.

The study exclusion criteria were as follows: known moderate to severe valvular heart disease, chronic liver disease, chronic kidney disease (GFR <60 ml/kg/min), thyroid dysfunction, atrial fibrillation, acute coronary syndrome, malignancy, active infection, autoimmune disease, patients age ≤ 18 and ≥ 85 years.

Laboratory parameters

Routine laboratory parameters (glucose, high-sensitivity troponin I, N-terminal pro-brain natriuretic peptide, renal function, lipid panel and complete blood count) were analyzed for all patients. Serum Elabela levels were obtained using commercially available kits (Sunred Biological Technology, Shanghai, China). Elabela-32 isoform was measured. The kit uses a double-antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to determine the level of Elabela in blood samples. To measure apelin, serum was separated from the blood by centrifugation at 3,000 rpm for 10 min and kept frozen at −80°C until analysis. According to the manufacturer, this assay has an inter-assay coefficient of variation of less than 12% and an intra-assay coefficient of variation of less than 10%.

Angiographic evaluation

Coronary angiography was routinely performed using the Judkins technique with 6- or 7-French right and left heart catheters without the use of nitroglycerin, adenosine, or a calcium channel blocker. Angiograms were recorded in DICOM format at 15 frames/sec and were reviewed by two experienced angiographers who had no knowledge of the patients' clinical condition. Normal coronary arteries were defined as the absence of coronary lesions. CTOs were visualized from at least two angles after selective injection of the contrast material. CTO was defined as a 100% stenosis of the luminal diameter when there was no noticeable lumen and anterograde flow for more than 3 months. Coronary angiograms were re-evaluated for collateral circulation by two experienced interventional cardiologists who were completely blinded to the study. The coronary collateral circulation was graded using the Rentrop classification, where grade 0=no filling of collateral vessels; grade 1=filling of side branches of the artery to be dilated via collateral channels without visualization of the epicardial segment; grade 2=partial filling of the epicardial segment by collateral vessels; and grade 3=complete filling of the epicardial segment of the artery being dilated by a collateral vessel. Patients with grade 0–1 coronary collateral development were considered as poor collateral group, and patients with grade 2–3 coronary collateral development were considered as good collateral group. In patients with more than 1 collateral vessel filling the occluded vessel, the collateral vessel with the highest Rentrop grade was used for analysis.

Statistical analysis

Continuous variables were analyzed for data normality using the Kolmogorov-Smirnov test. The variables following a normal distribution were presented as mean (± standard deviation) and those without a normal distribution were presented as median (interquartile range). The variables that showed normal distribution between the groups were compared using the unpaired Student's t-test and those without a normal distribution were compared using the Mann-Whitney U-test. Categorical variables were summarized as numbers and percentages, and compared between the groups using the Chi-square test or the Fisher's Exact test. The receiver operating characteristics (ROC) curve was used to demonstrate the sensitivity and specificity of Elabela cut-off values for CTO. Binary logistic regression analyses were performed to determine independent predictors of CTO. Variables with an unadjusted p value <0.05 in univariate analysis were included in the multivariate analysis. All statistical analyses were performed using the Statistical Package for the Social Sciences (SPSS 20.0) for Windows (SPSS Inc., Chicago, Illinois, USA). A p value <0.05 was considered statistically significant.

Results

A total of 50 CTO patients and 50 patients with normal coronary arteries were included in the study. Baseline demographic and clinical characteristics of the study groups are summarized in Table 1. Comparison of the demographic features between groups showed that previous percutaneous coronary intervention was more commonly performed in the CTO group (p=0.006). There was no statistically significant difference between groups in terms of mean age, sex, and the number of patients with hypertension, diabetes mellitus, hyperlipidemia, peripheral artery disease, heart failure, stroke, and chronic obstructive pulmonary disease (all p>0.05).

Table 1

Baseline demographic characteristics and cardiovascular risk factors of the study population

Variable	CTO patients (n=50)	Controls (-) (n= 50)	p
Age, years	61.6 ± 7.31	60,7 ± 6.38	0.495
Female, % (n)	28.0 (14)	38 (19)	0.288
Left ventricular ejection fraction, %	55.3 ± 7.0	55.7 ± 6.83	0.795
Hypertension, % (n)	70.0 (35)	50 (28)	0.147
Diabetes mellitus, % (n)	66.0 (33)	50 (25)	0.105
Hyperlipidemia, % (n)	62 (31)	44 (22)	0.071
Peripheral vascular disease, % (n)	10.0 (5)	6 (3)	0.461
Stroke, % (n)	4.0 (2)	2(1)	0.558
Heart failure, % (n)	16.0 (8)	12 (6)	0.564
Chronic obstructive pulmonary disease, %(n)	10.0 (5)	18 (9)	0.249
Previous Percutaneous Coronary Intervention% (n)	14.0 (7)	0 (0)	0.006
Current smoker, % (n)	58 (29)	48 (24)	0.316
Family history of CAD, % (n)	22.0 (11)	24 (12)	0.812

CAD: Coronary artery disease

Laboratory parameters and Elabela levels are presented in Table 2. Mean NT-proBNP and troponin levels were significantly higher in the CTO group than in the control subjects (p<0.05, for both). However, mean Elabela levels were significantly lower in the CTO group than in control subjects (p <0.001). There were no significant differences between groups with respect to other laboratory parameters (all p>0.05).

Table 2

Laboratory parameters and Elabela levels of the study groups.

Variable	CTO patients (n=50)	Controls (n= 50)	P
Fasting glucose level, mg/dL, median (IQR)	102.5 (28.0)	121 (55.0)	0.057
Hemoglobin, g/dL	13.9 ± 1.90	13.2 ± 1.52	0.107
Hematocrit, %	39.9 ± 5.57	39.3 ± 3.95	0.584
White blood cell count, x103/mL	8.2 ± 2.02	8.4 ± 2.40	0.692
Platelet count, x103/ mL	265 ± 82	271 ± 51	0.743
Neutrophil count, x103/ mL	5.4 ± 1.68	5.2 ± 1.57	0.357
Lymphocyte count, x103/ mL	2.2 ± 0.7	2.1 ± 0.6	0.417
Monocyte count, x103/ mL	0.6 ± 0.23	0.7 ± 0.29	0.640
Mean platelet volume, fL	8.8 ± 1.14	8.8 ± 1.02	0.933
Total cholesterol, mg/dL, median (IQR)	206.5 (53.5)	216 (46.5)	0.955
LDL-Cholesterol, mg/dL, median (IQR)	132.5 (40.5)	147 (34.5)	0.389
HDL-Cholesterol, mg/ dL	42.1 ± 9.5	44.6 ± 8.5	0.236
Triglyceride, mg/dL, median (IQR)	173 (103.7)	159 (101.5)	0.147
Urea, mg/dL	34.9 ± 13.93	33.4 ±7.89	0.580
Creatine, mg/dL,	0.84 ±0.27	0.78 ±0.15	0.275
Albumin, mg/dL	3.7 ± 0.59	3.8 ± 0.34	0.424
Troponin, ng/ml median (IQR)	6.0 (12.0)	4.0 (7.0)	0.013
Elabela, ng/mL, median (IQR)	0.64 (0.40)	1.20 (1.14)	<0.001
CRP, mg/l, median (IQR)	1.8 (1.4)	1.4 (2.0)	0.506
NT-proBNP, pg/ml, median (IQR)	25.5 (16.5)	16.0(11.0)	0.001
SYNTAX score	12.3 ± 7.1	-	-

IQR: Interquartile Range, LDL: Low-density lipoprotein, HDL: High-density lipoprotein, CRP: C reactive protein, NT-proBNP: N-terminal pro-brain natriuretic peptide

In CTO patients, the right coronary artery (n=26, 52%) was the most affected vessel, followed by the left anterior descending artery (n=20, 40%), the left circumflex artery (n=11, 22%) and multiple vessels (n=7, 14%).

For the prediction of CTO, the cut-off value of <0.9 for Elabela had a 84.8% sensitivity and 80.0% specificity (AUC: 0.824; 95% confidence interval, 0.723-0.924; p<0.001) in the ROC curve analysis (Figure 1).

Figure 1

Receiver–operating characteristic curve analysis for Elabela for prediction of CTO.

The patients were divided into two groups based on the Rentrop classification: Rentrop 0-1 (n=17) and Rentrop 2-3 (n=33). The median Elabela value of the Rentrop 0-1 group (median 0.430, IQR: 0.170) with poor collateral development was lower than that of the Rentrop 2-3 group (median 0.740, IQR: 0.380) with a good collateral development (p<0.001) (Figure 2).

Figure 2

Relationship between Elabela level and Rentrop score (error bars: 95% confidence interval [CI]).

The results of univariate and multivariate regression analyses are summarized in Table III. Univariate analysis showed that NT-proBNP, Elabela and troponin were independent predictors of CTO. However, in the multivariate analysis, only NT-proBNP (p=0.003) and Elabela (p=0.001) remained as independent predictors of CTO.

Discussion

The main finding of our study was that CTO patients had lower serum Elabela levels compared to patients with normal coronary arteries. In addition, patients with a good coronary collateral development had higher serum Elabela levels than patients with poor coronary collateral development. To our best knowledge, our study is the first to examine the relationship between serum Elabela levels and CTO and coronary collateral development.

The human cardiovascular system contains a family of peptides called the Apelinergic system, consisting of Apelin, Elabela and APJ receptors. Studies have shown that Apelin and the receptor system have some positive effects on atherosclerosis, myocardial infarction (MI), heart failure, and pulmonary artery hypertension.– Although Apelin was initially believed to be the only ligand for APJ, a new peptide they named Elabela was identified by the research conducted by the Reversade team. It has been shown in studies that Apelin and Elabela act via APJ and have similar functions. Moreover, Elabela was shown to be more potent than Apelin in producing positive cardiac effects. Patients with stable angina were found to have significantly lower plasma Apelin levels in comparison to controls. In addition, plasma Apelin level was found to be negatively correlated with Gensini score in patients with acute coronary syndrome. In their study, Weir et al. showed that plasma Apelin concentration was reduced in the early period after acute myocardial infarction, increased significantly over time, but remained depressed at 24 weeks. As CTO is a late coronary event, Elabela level was similarly lower in CTO patients than in patients with normal coronary arteries.

CTO is a subgroup of atherosclerotic heart disease and is associated with negative clinical outcomes. The biological roles of Elabela in atherosclerotic diseases have recently been explored in a recent study by Li et al. who proposed Elabela as a new possible therapeutic agent for cardiovascular diseases. Impaired endothelial function is associated with atherosclerosis. Elabela is mainly detected in fibroblasts in the heart and intact endothelial cells. Therefore, Elabela production decreases in impaired endothelial function. In our study, low Elabela levels measured in the CTO group can be explained by the presence of of impaired endothelial function.

The development of coronary collaterals is a response to chronic myocardial ischemia. Collateral vessels provide an alternative blood supply for myocardium in patients with obstructive coronary lesions. Increased coronary collateral blood flow can reduce angina symptoms and cardiovascular events and maintain the contractile function of the myocardium. There is important evidence that collateral circulatory development occurs as a result of angiogenesis and/or arteriogenesis. Elabela signaling has been shown to have a key role in the development of normal cardiovascular system during embryogenesis. Elabela promotes angiogenesis and arteriogenesis via APJ., In their study, Sharma et al. found that the Elabela-APJ signal axis induces progenitor cell migration from sinus venosus in mice and thus plays a role in the development of coronary vessels. In addition, they detected defects in coronary vessel development in mice lacking the Elabela-APJ signal. In our study, the high serum level of Elabela in Rentrop class 2-3 patients with good collateral development compared to patients in Rentrop class 0-1 with poor collateral development can be explained by the positive effects of Elabela on angiogenesis and arteriogenesis.

Perjes et al. showed in mice that Elabela levels increased in the early post- MI period due to its cardioprotective effects but decreased later or after unsuccessful treatment. CTO, a spectrum of atherosclerotic heart disease, is defined as 100% lumen diameter stenosis for more than 3 months when there is no noticeable lumen and anterograde flow. The low level of Elabela in CTO patients as found in our study is consistent with the findings of that study

Previous studies reported that Elabela is involved in a wide range of cardiovascular conditions and diseases. Apelinergic system activity increases substantially in remodeling after myocardial infarction, in arterial hypertension and exerts beneficial effects by blocking the Renin-Angiotensin-Aldosterone system. In addition, positive effects of Elabela on heart failure and diabetes have also been shown in studies,,. In our study, there was no difference between the groups in terms of hypertension, diabetes and heart failure.

Current evidence for the cardioprotective effects of Elabela is scarce. However, in vitro and animal studies suggest that Elabela or a synthetic derivative may have therapeutic or biomarker potential for cardiovascular diseases.

Limitations

The cross-sectional design and the sample size of the study are the main limitations of our study. Although biochemical measurements were performed in our study, we did not examine the APJ receptor level of the tissue samples. Also, Apelin and APJ measurements were not obtained and they could have provided more information about the Apelinergic system in CTO patients.

Conclusion

In this study, we showed decreased Elabela levels in CTO patients. We also observed a positive correlation between coronary collateral development and serum Elabela levels. Larger and more comprehensive studies are needed to establish the role of Elabela as a cardiac biomarker or therapeutic agent in humans.