[The incidence of high-grade B-cell lymphoma with MYC and BCL2 and/or BCL6 rearrangements in diffuse large B-cell lymphoma].

Objective: To investigate the incidence of high-grade B-cell lymphoma with MYC and BCL2 and/or BCL6 rearrangement in Chinese diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) .
Methods: From January 2013 to August 2020, 922 DLBCL cases were collected. C-MYC and BCL2 protein expression levels were analyzed by immunohistochemistry staining. Fluorescence in situ hybridization was used to detect the structural abnormalities of MYC, BCL2, and BCL6, including gene breaks and copy number changes.
Results: MYC and BCL2 and/or BCL6 gene breaks were found in 29 out of 922 DLBCL cases (3.15%) , including 25 cases of double-hit lymphoma (DHL; 14 cases involving MYC and BCL2 rearrangements and 11 cases involving MYC and BCL6 rearrangements) and four cases involving MYC, BCL2, and BCL6 rearrangements, referring to triple-hit lymphoma. According to the threshold of C-MYC ≥40% and BCL2 ≥50%, 541 cases (58.68%) overexpressed C-MYC and BCL2 proteins, including 22 DHL cases. Moreover, according to the threshold of C-MYC ≥70% and BCL2 ≥50%, 52 cases (5.64%) overexpressed C-MYC and BCL2 proteins, including nine DHL cases. The P53 protein expression was detected by immunohistochemistry staining. The mutant P53 expression pattern was shown in 101 out of 709 cases (14.25%) , whereas 13 cases (1.83%) were negative, likely indicating P53 gene fragment deletion.
Conclusion: The incidence of high-grade B-cell lymphoma with MYC and BCL2 and/or BCL6 rearrangements was low in DLBCLs, and no significant correlation between gene abnormality and protein overexpression was shown. The correct diagnosis of DHL depends on molecular genetic detection.

双重打击淋巴瘤（Double-hit lymphoma，DHL）是弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）近年来的研究热点，DHL指具有MYC基因断裂伴其他重现性染色体断裂的淋巴瘤，以伴BCL2或BCL6基因断裂最为常见，同时出现MYC、BCL2和BCL6基因断裂即三重打击淋巴瘤（Triple-hit lymphoma，THL）。DHL在B细胞恶性肿瘤中约占2％，在DLBCL中所占比例不超过12％。DHL或THL是一类侵袭性淋巴瘤，预后极差，尚无统一的标准治疗方案，2017年WHO淋巴瘤第4版修订版分类将其正式命名为高级别B细胞淋巴瘤伴MYC、BCL2和（或）BCL6重排[1]–[2]。近年学者提出双重表达淋巴瘤（Double-expressor lymphoma，DEL）的概念[2]–[3]，即检测C-MYC和BCL2蛋白的表达水平，筛选出同时高表达C-MYC和BCL2蛋白的病例，认为对DHL具有一定提示作用。但目前国内尚无关于DHL和DEL的大宗病例报道，本研究纳入922例DLBCL患者，在蛋白水平及基因层面进行检测，希望进一步了解DHL或THL在DLBCL中的发生率、DHL与DEL的鉴别与相关性。

病例与方法

1. 病例：本研究回顾性收集2013至2020年北京大学第三医院病理科及北京大学基础医学院病理学系血液病理研究室常规诊断及会诊的922例DLBCL患者，所有患者均符合2017年WHO分类的诊断标准。

2. 试剂：一抗P53、BCL2、C-MYC为北京中杉金桥公司产品，CD10、BCL6、MUM1为美国DAKO公司产品，二抗采用美国DAKO公司的兔/鼠通用试剂。

3. 免疫组化染色：采用石蜡组织切片免疫组化染色，Envision二步法检测肿瘤细胞CD10、BCL6及MUM1的表达，阳性细胞/肿瘤细胞≥30％定义为阳性，染色强度强弱均可，并根据Hans蛋白模型确定肿瘤细胞来源。检测C-MYC和BCL2的表达情况，阳性细胞比例以阳性细胞占肿瘤细胞总数的百分比表示，染色强度强弱均可。

4. 位点特异性间期荧光原位杂交（LSI-FISH）：根据HE切片中的常规组织学形态选择肿瘤细胞丰富区域作为杂交区域，所用探针及DAPI复染剂均购自美国雅培公司，包括MYC双色分离重排探针（01N63-020）、BCL2双色分离重排探针（05N51-020）和BCL6双色分离重排探针（01N23-020）。每例患者计数100个肿瘤细胞，>5％肿瘤细胞出现信号分离判断为阳性，同一细胞核内黄色融合信号≥3个视为基因多拷贝。

结果

1. 基本情况：男467例，女455例，男性略多于女性，中位年龄58（3～88）岁。淋巴结内发病388例（42.08％），淋巴结外发病534例（57.92％），结外发病部位以胃肠道最为多见（138例）。

2. 免疫组化结果：对所有患者的CD10、BCL6、MUM1、P53、C-MYC及BCL2蛋白表达情况进行检测。依据Hans模型将患者分为生发中心B细胞（GCB）组（223例）及非GCB（Non-GCB）组（699例）。892例（96.75％）C-MYC蛋白表达阳性，其中642例（71.97％）阳性细胞比例≥40％，64例（7.17％）阳性细胞比例≥70％。810例（87.85％）BCL2蛋白表达阳性，其中738例（91.11％）阳性细胞比例≥50％。若将C-MYC表达≥40％且BCL2表达≥50％（DEL-MYC 40％）定义为阳性，541例（58.68％）同时高表达C-MYC和BCL2；若将C-MYC表达≥70％且BCL2表达≥50％（DEL-MYC 70％）定义为阳性，52例（5.64％）同时高表达C-MYC和BCL2。709例患者检测了P53蛋白表达情况，595例（83.92％）为野生型（少数细胞强阳性，大多数细胞阴性或弱阳性），101例（14.25％）为突变型（>80％细胞强阳性），13例（1.83％）为缺失型（内对照阳性，肿瘤细胞均为阴性）。

3. FISH结果：本研究中922例DLBCL患者全部进行了FISH-MYC检测，其中51例（5.53％）检测到基因断裂，100例（10.85％）检测到基因多拷贝，4例（0.43％）同时检测到基因断裂和多拷贝；389例进行了FISH-BCL2检测，其中32例（8.23％）检测到基因断裂，69例（17.74％）检测到基因多拷贝，3例（0.77％）同时检测到基因断裂和多拷贝；368例进行了FISH-BCL6检测，其中58例（15.76％）检测到基因断裂，56例（15.22％）检测到基因多拷贝，1例（0.27％）同时检测到基因断裂和多拷贝；368例同时检测了3个基因，29例检测到MYC、BCL2和（或）BCL6断裂（3.15％），其中14例（48.26％）为MYC合并BCL2基因断裂，11例（37.93％）为MYC合并BCL6基因断裂，4例（13.79％）为MYC、BCL2和BCL6基因均断裂（THL）。DHL与THL患者无明显性别差异（男14例，女15例）；结外部位更为常见（结内11例，结外18例）；GCB来源更为常见（GCB17例，Non-GCB12例），但MYC合并BCL6基因断裂的DHL更常见于Non-GCB（GCB 4例，Non-GCB 7例）。368例患者中，24例（6.52％）出现3个基因异常（包括基因断裂及多拷贝），72例（19.57％）出现2个基因异常（包括基因断裂及多拷贝）。

29例DHL或THL患者中，22例为DEL-MYC40％，9例为DEL-MYC 70％。在DEL患者中，541例为DEL-MYC 40％，其中19例为DHL，3例为THL，7例非DEL患者为DHL或THL。52例DEL-MYC70％患者中7例为DHL，2例为THL，20例非DEL患者为DHL或THL。642例C-MYC表达≥40％的患者中，FISH检测基因断裂46例，基因多拷贝69例，基因断裂合并多拷贝2例，DHL或THL 25例。64例C-MYC表达≥70％的患者中，FISH检测基因断裂20例，基因多拷贝4例，基因断裂合并多拷贝未检出，DHL或THL 11例。595例P53野生型表达患者中检出DHL或THL 15例；101例突变型表达患者中检出DHL或THL 2例；13例缺失型表达患者中检出DHL或THL 1例。

讨论

随着分子遗传学研究的迅速发展，多种DLBCL相关分子异常逐渐被发现，许多造血和淋巴组织肿瘤存在特征性染色体易位，这些染色体易位多产生融合基因或基因重排，所涉及基因大多为细胞凋亡和（或）增殖信号通路的关键分子，而癌基因和抑癌基因的突变及表达改变已成为肿瘤相关重要分子生物学标志，用于预测肿瘤的进展、疗效及预后。具有双重打击遗传学特征的DLBCL近年来受到关注，虽然相对罕见，但由于具有明显的侵袭性，常规治疗疗效不佳，故成为研究热点。

本研究的结果显示，DLBCL中存在多种分子异常，其中BCL6基因异常［断裂和（或）多拷贝］率达31.25％，BCL2基因次之，MYC基因异常率亦达16.81％。基因异常中，BCL6以断裂重排最为常见，而MYC和BCL2以基因多拷贝最为常见，偶见两者合并发生。本研究检测到伴MYC、BCL2和（或）BCL6基因重排的患者29例，其中DHL 25例，THL4例，总阳性率约3.15％，以MYC合并BCL2基因重排最为常见，且多为GCB来源，与大多数研究数据相近，而国内部分研究显示MYC合并BCL6基因异常较为常见，与本研究结果存在差异，可能与DHL病例数较少有关[4]–[11]。本研究29例DHL、THL患者中仅9例获得临床随访结果，失访率较高，且采取的治疗方案不一，难以进行统计学分析，目前未显示出明显的预后倾向。与基因断裂重排相比，基因多拷贝的比例较高，其预后意义尚不明确，有待进一步研究探讨。杨海燕等[12]的研究显示，同时存在MYC及BCL2基因异常（主要为多拷贝）患者的预后明显较单基因异常患者差，其他基因异常是否与临床预后相关有待进一步研究。

本研究病例均为初诊DLBCL，Ki-67增殖指数均在40％以上，约80％的DHL或THL病例Ki-67指数超过80％，非DHL、THL病例中Ki-67增殖指数平均值为61％，提示DHL或THL肿瘤增殖明显活跃。但有研究报道，部分DHL病例Ki-67增殖指数可低至30％，提示低增殖指数并不能除外DHL[2]，因此无法通过形态学及简单的蛋白水平标志对DHL进行筛选。

由于DHL检出率低，而FISH检测费用较高，许多医疗机构并不推荐对所有DLBCL患者常规行FISH检查。基于DEL的概念，目前国内大多数病理科常规检测C-MYC和BCL2蛋白的表达，当两者均高表达，符合DEL时，方进行FISH检测以除外DHL或THL。关于DEL中C-MYC及BCL2高表达的阈值，目前应用较为广泛的是C-MYC 40％和BCL2 50％，但有学者认为这一阈值导致DEL筛出率过高，不能很好地提示DHL[1],[13]。最近德国研究者提出MYC≥70％的新阈值，使DEL与DHL更为接近[14]。本研究数据显示，依据MYC≥40％和BCL2≥50％的阈值，DEL阳性率高达58.68％，远高于DHL 3.15％的筛出率，且仅有4.07％的DEL病例为DHL或THL，24.14％的DHL病例为DEL阴性病例。MYC≥70％和BCL2≥50％的阈值将DEL阳性率降至5.64％，DEL中DHL或THL的筛出率提高至17.34％，明显高于MYC≥40％的阈值，但有高达68.97％的DHL为DEL阴性病例。分析DEL与DHL不一致的原因可能为：①MYC蛋白高表达的原因众多，MYC基因断裂重排只是原因之一，蛋白过表达可能存在除基因重排以外的其他异常，包括基因扩增，本研究数据显示MYC蛋白的高表达与断裂及扩增无明显相关性。②FISH检测所用探针的局限性。虽然文献报道，Vysis探针的敏感性较高，但同样存在漏检情况[15]，即MYC基因存在断裂重排，但FISH未检测出。③伴MYC及BCL6重排而无BCL2断裂的DHL病例，CD10及BCL2表达高低不等，而MUM1表达较其他DHL更常见[1]，因此部分DHL或THL病例并不会出现双重表达。④免疫组化检测及结果判读受到诸多因素影响，如组织处理、试剂、实验操作及人为判读差异，重复性较差。因此常规临床工作中，并不能使用DEL筛查DHL，否则会造成DHL或THL的漏检。但研究发现DEL病例的预后亦较差[16]–[18]，DEL的检测可用于提示临床预后，尤其是对于组织过少、患者经济情况差或无法接受高强度化疗者。

DHL或THL的诊断必须依赖基因检测，FISH检测具有诸多优势，包括需要的组织少（一项FISH仅用一张胶白片，厚度3 µm）、易操作及判读、与形态学结合紧密等，值得推广使用。根据大宗病例的研究结果，建议对所有DLBCL患者常规进行FISH检测以筛查DHL或THL，鉴于FISH检测成本较高，可先进行FISH-MYC检测，如检测到MYC基因断裂重排，再进一步行FISH-BCL2及BCL6检测以明确是否是DHL或THL，此检测流程最为精准，也最经济可行。

也有研究认为仅出现MYC基因断裂重排的单打击淋巴瘤的生物学行为与DHL类似，且具有较高的P53基因突变率[19]。免疫组化检测中，P53蛋白存在多种表达模式：野生型、突变型及缺失型，可能分别对应P53基因正常、点突变及大片段丢失。本研究因材料所限，无法进行P53基因突变的检测，但免疫组化结果显示，呈P53突变型表达的患者约101例，其中仅6例出现MYC基因断裂重排，远低于文献报道[19]。同样也有研究认为MYC拷贝数增加或扩增可能亦是DLBCL的不良预后因素[20]–[21]。因此建议FISH检查不仅要关注MYC基因断裂，亦应关注和明确拷贝数异常。MYC基因重排的伙伴基因可以是免疫球蛋白（MYC/IG）和非免疫球蛋白（MYC/Non-IG），有研究显示MYC/IG重排患者的预后较MYC/Non-IG重排患者差[22]–[23]。本研究数据显示，虽然DHL或THL发生率很低，但超过25％的患者出现了2个以上基因异常，显示DLBCL中异常分子遗传学改变是DLBCL中常见的分子学事件。众多研究提示，DLBCL复杂的分子学异常与DLBCL生物学行为差异有关[24]。因此，如条件允许，建议对DLBCL患者行较完整的分子遗传学检测，包括FISH、二代测序等，以更为精准地为临床预后及治疗提供参考。

综上所述，本研究对大样本DLBCL病例进行了免疫组化及FISH检测，结果显示，需对DLBCL患者进行全面的FISH-MYC检测以有效鉴别高级别B细胞淋巴瘤伴MYC、BCL2和（或）BCL6重排。