[Acute promyelocytic leukemia with PML cryptic breakpoint t (15; 17) (q22; q21) negative: a case report and literatures review].

大多数急性早幼粒细胞白血病（APL）患者携带t（15;17）（q22;q12），从而导致早幼粒细胞白血病基因（PML）与RARα的融合[1]–[4]。PML-RARα融合基因既是分子病因又是治疗靶点。近年来，RARα基因新的伙伴基因不断被发现[5]–[7]，PML-RARα除了经典型的L型、S型和V型外，其新的变异体也偶有报道[8]。最近，我们发现了一种罕见的PML-RARα融合基因变异体，由PML外显子4和RARα外显子3断裂拼接形成PML-RARα。患者对全反式维甲酸（ATRA）和三氧化二砷治疗无效，现报告如下并对相关文献进行复习。

病例资料

患者，女，82岁。因发热、咳嗽、咳痰伴乏力5 d入院。血常规：WBC 1.30×109/L，RBC 1.69×109/L，HGB 39 g/L，PLT 8.0×109/L。查体：体温39.5 °C，重度贫血貌，急性面容，周身散在瘀斑，齿龈出血。全身浅表淋巴结无肿大；胸骨无压痛，双肺呼吸音粗，双下肺可闻及湿性啰音；心律齐，未闻及病理性杂音；腹平坦，无压痛、反跳痛，下肢水肿。实验室检查：血浆凝血酶原时间12.6 s（参考范围11～17 s），活化部分凝血活酶时间29.2 s（参考范围28～43.5 s），纤维蛋白原4.20 g/L（参考范围2～4 g/L），D-二聚体1.37 mg/L（参考范围0～0.5 mg/L）；胸部CT提示肺部炎症、双肺结节、左侧少量胸腔积液。外周血涂片分类计数：幼稚细胞占15%。髂骨穿刺骨髓涂片分类：骨髓增生活跃，粒系异常增生，以颗粒增多的异常早幼粒细胞为主，其胞体大小不等，呈圆形、椭圆形，核圆形、不规则形，可见扭曲、折叠等；染色质细致，核仁2～4个，隐显不一；胞质量丰富，着蓝色，含有大量细小或粗大的嗜天青颗粒。中幼粒以下阶段细胞少见或缺如。嗜酸性粒细胞可见。细胞化学染色：过氧化物酶（POX）染色阳性率100%（图1A、B）。免疫分型显示异常髓系幼稚细胞占有核细胞的55.85%，表达CD117、CD33、CD13、CD123、MPO，部分表达CD38、CD15、CD64、CD4、HLA-DR，不表达CD34、CD11b、CD14、CD300e、CD10、CD19、CD20、CD8、CD3、CD7、CD2、CD56、cCD79a、cCD3、CD22、CD5、cTDT。染色体核型分析：46，XY[20]（图1C）。双色标记RARα探针荧光原位杂交（FISH）检测显示RARα基因有断裂重排信号（图1D）。荧光定量PCR结果显示白血病相关56种融合基因筛查均阴性，其中包括PML-RARα（L型）、PML-RARα（S型）、PML-RARα（V型）、PLZF-RARα、NPM-RARα、STAT5b-RARα、FIP1L1-RARα、PRKAR1A-RARα、NUMA1-RARα等已报道的RARα重排的伙伴基因。mRNA测序分析发现该患者15号染色体上的PML基因的4号外显子右侧1353位点发生断裂（NM_001077397.1），同时17号染色体上的RARα基因的3号外显子左侧703位点发生断裂（NM_000964.3），从而使得15号染色体与17号染色体易位形成PML-RARα融合基因。该融合基因与国内外文献报道的PML-RARα的L型、S型及V型断裂位点均不一致，参考NCBI数据库该基因的序列信息设计出PML基因引物（上游引物：5′-AGAGCAGCTGTATCCAAGA-3′，RARα基因下游引物：5′-TGCTTGTAGATGCGGGGTAG-3′）进行PCR扩增，获得154 bp的目的条带（图2），PCR产物一代测序证实PML-RARα融合基因的产生（图3A、3B，图4）。急性髓系白血病（AML）或骨髓增生异常综合征相关的常见22个基因二代测序发现患者存在IDH1:exon4:p.R132C突变，突变频率0.233。本例患者临床诊断为APL，“亚砷酸+ATRA”双诱导治疗过程中发生感染合并多脏器功能衰竭，抢救无效死亡，总生存期仅14 d。

图1

t（15;17）（q22;q21）阴性急性早幼粒细胞白血病患者细胞形态和遗传学检测结果

A：骨髓细胞涂片显示早幼粒细胞具有明显的细胞质颗粒（瑞特-吉姆萨染色，×1000）；B：骨髓细胞化学染色显示早幼粒细胞对髓过氧化物酶呈强阳性（×1000）；C：骨髓细胞染色体核型分析显示正常核型；D：FISH显示RARα基因断裂重排

图2

RT-PCR检测PML-RARα融合基因的琼脂糖凝胶电泳结果

M：DL2000 Marker；1：目的条带（使用来自PML外显子4的正向引物和来自RARα外显子3的反向引物的RT-PCR产生了154个碱基对的目的条带）

图3

t（15;17）（q22;q21）阴性急性早幼粒细胞白血病患者PML与RARα融合的分子特征

A：PCR产物的直接测序检出PML-RARα融合基因，断点来自PML外显子4和RARα外显子3的序列；B：用genetyx对PML外显子4、PML-RARα融合基因和RARα外显子3的基因组序列进行比对，发现PML基因外显子4和RARα基因外显子3存在断裂重组点，但融合点位置的两个胞嘧啶尚无法证实其来源

图4

PML-RARα融合基因各型断裂位点

讨论及文献复习

APL是AML的一个亚型，具有独特的分子发病机制、临床表现和治疗方案，细胞遗传学存在t（15；17）（q24；q21）平衡易位[9]–[10]。在本文中，我们报道1例非典型的PML断裂位点t（15；17）阴性APL患者。PML断点通常聚集在三个区域内：内含子6（bcr1或L型）、外显子6（bcr2或V型）和内含子3（bcr3或S型）。最频繁的断点是bcr1（40%～60%）和bcr3（30%～50%），而只有10%～15%的患者观察到bcr2断点[11]–[12]。也有学者描述bcr1可以包含外显子7a，但对这些患者的详细研究表明，PML基因在PML外显子7a的第3个碱基剪接点处被破坏[10]。

检索国内外文献共发现3例伴非经典PML-RARα融合基因断裂点的APL报道。国内郑丽霞等[13]曾报道1例PML-RARα融合基因S型的变异体，并认为这一变异体仅存在于初诊的APL患者中，在随后的化疗过程中，S型变异体会被普通S型所取代,而且该患者经过化疗获得临床完全缓解。遗憾的是文献中并未报道患者的基本信息、临床状况及治疗方案。

通过对本例PML-RARα融合基因隐匿断裂点的鉴定再次证实S型变异体的存在。本例与首次报道的患者疾病进展、预后差异较大，与国际上报到的两例伴非经典型PML-RARα（L/S/V）APL患者的情况一致。常规的PML-RARα（L/S/V型）融合基因检测试剂盒无法检测到该位点的融合，表明这些新的PML断裂点到目前为止还没有得到充分的诊断，这些罕见性融合点的发现可以有助于避免假阴性或解释异常的阳性。

不同的实验数据表明，在所有APL患者体内都存在着PML-RARα融合蛋白或异常PML蛋白，而它们就是导致肿瘤发生的关键因素，因此PML-RARα融合基因既是分子病因又是治疗靶点，ATRA与三氧化二砷联合诱导化疗都是针对分子靶点的药物。然而，除了PML和RARα基因本身突变会造成敏感性差异外[14]，不同的PML-RARα融合转录本对ATRA的敏感性也不同。伴PML-RARα V型的APL患者对ATRA敏感性降低，而另一些报告显示伴PML-RARα S型融合转录本患者的预后明显比PML-RARα L型差[15]–[18]。

本例患者形态学诊断为APL，细胞遗传学检查未发现t（15;17）（q22;q21），分子生物学检查也未检测到PML-RARα融合基因（包含L型、V型、S型），但利用双色双融合探针检测到RARα基因存在重排现象，后经RNAseq检测出PML-RARα融合基因S型变异体（较常规PML-RARα融合基因S型多出PML基因的4号外显子），并经一代测序证实。诊断明确后该患者接受ATRA、三氧化二砷诱导治疗，未获得缓解，在入院第14天因多器官衰竭死亡。提示该患者对ATRA、三氧化二砷不敏感并在短期内死亡。虽然伴该种PML-RARα变异体患者在异常骨髓细胞形态、流式免疫表型等方面与常见APL临床和实验室特点基本无差异，但是这种新的易位可能与预后差相关联。由于现有患者病例数较少，因此需要进一步扩大样本量进行统计分析。