[Analysis of the molecular pathogenesis and clinical phenotypes of 10 patients with inherited coagulation factor Ⅺ deficiency].

遗传性凝血因子Ⅺ（FⅪ）缺陷症是一种罕见的出血性疾病，为常染色体隐性遗传性疾病，患者血浆中FⅪ促凝活性（FⅪ∶C）降低，但患者少有发生自发性出血，临床表现有较大的异质性[1]。目前关于遗传性FⅪ缺陷症的临床出血程度与FⅪ∶C及基因突变类型和数量的相关性研究较少。我们对10例遗传性FⅪ缺陷症患者的F11基因进行了检测，以探讨其分子发病机制与临床表现的关系。

病例与方法

1．家系资料：10例无亲缘关系的遗传性FⅪ缺陷症家系中先证者（男1例，女9例），年龄20~64岁，3例长辈存在近亲婚配关系。1例先证者平素在无明显诱因下易出现齿龈出血，以“牙龈出血难止”来我院就诊；1例先证者有术后出血难止史；1例先证者有产后出血增多；9例先证者因术前检查因活化部分凝血活酶时间（APTT）明显延长而确诊。

150名正常对照为我院健康体检者，男81名，女69名，中位年龄32（18~60）岁，均无肝肾功能疾病，无出血和血栓史。所有受试者均知情同意。

2．标本采集：征得患者及其家属同意后，采集患者及其家属成员的外周静脉血标本，以0.109 mol/L枸橼酸钠1∶9抗凝。标本分2份，一份用于凝血指标检测，2 h内检测完毕；另一份用于DNA提取，−40 °C冻存待检。

3．凝血指标检测：凝血酶原时间（PT）、APTT、FⅧ促凝活性（FⅧ∶C）、FⅨ促凝活性（FⅨ∶C）、FⅪ∶C和FⅫ促凝活性（FⅫ∶C）等指标采用一期凝固法在法国Stago STA-R全自动血凝仪上测定（配套试剂由法国Stago公司提供）；FⅪ∶Ag采用ELISA法测定。所有操作均按照试剂说明书进行。

4．DNA提取及PCR扩增：采用酚-氯仿法抽提受试者的外周血基因组DNA，参照文献[2]设计PCR引物，由上海桑尼生物科技有限公司合成。PCR扩增：反应体积共50 µl，包括Taq PCR Mastermix 25 µl、ddH2O 18 µl、DNA模板3 µl、正向引物2 µl、反向引物2 µl。反应条件：95 °C预变性5 min，95 °C变形30 s，根据不同引物以相应退火温度（60~64 °C）退火30 s，72 °C延伸45 s（共35个循环），72 °C延伸10 min。取扩增产物5 µl经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

5．DNA序列分析：PCR扩增产物纯化后送上海桑尼生物工程有限公司直接测序，所用测序仪为ABI PRISM 3730。测序结果用Chromas软件与美国NCBI基因库所公布的F11基因序列（Genbank M17262）进行比对，寻找基因突变位点。发现基因突变的序列则反向测序予以证实，再扩增其他家系成员相应外显子片段。对150名健康对照组人群相应的区域进行PCR扩增、测序，用于排除基因多态性。

6．pMD18-TTA克隆载体：将含有缺失突变的序列克隆入pMD18-TTA克隆载体中，分别对克隆入载体的单条染色体上的F11基因序列进行测序。

结果

1．凝血指标检测结果：所有先证者的APTT均延长、FⅪ∶C降低，9例先证者FⅪ∶Ag 1.6%~29%，家系其他成员的APTT正常或延长，FⅪ∶C、FⅪ∶Ag正常或降低，先证者及家系成员的PT、FⅧ∶C、FⅨ∶C、FⅫ∶C均在正常范围内。10例先证者的临床资料见表1。

表1

10例遗传性凝血因子Ⅺ缺陷症家系先证者的临床资料

例号	性别	年龄（岁）	APTT（s）	FⅪ∶C（%）	FXI∶Ag（%）	临床表现
1	女	20	50.0	22.5	29.0	无症状
2	女	39	60.0	4.0	6.8	轻型
3	女	32	78.4	2.0	17.6	轻型
4	女	64	59.3	13.0	76.0	无症状
5	女	51	69.6	6.0	10.7	无症状
6	女	25	75.7	2.0	8.0	无症状
7	女	30	49.4	17.0	19.0	无症状
8	女	46	54.7	3.0	1.6	中型
9	男	28	94.2	1.0	1.3	无症状
10	女	32	84.2	3.0	8.6	无症状

注：APTT：活化部分凝血活酶时间，参考值29.0~43.0 s；FⅪ∶C：凝血因子Ⅺ促凝活性，参考值82.0%~118.0%；FⅪ∶Ag：凝血因子Ⅺ抗原，参考值90.0%~110.0%

2．F11基因突变特性：以基因组GENEBANK所公布的M17262序列作为标准，通过对10例遗传性FⅪ缺陷症先证者的F11基因外显子及侧翼，5′、3′端非编码区测序共发现9种类型共15个基因突变（表2），其中13外显子c.1562A>G（Tyr503Cys）、12外显子<span class="Mutation">c.1325delT（Leu424Cys）2种突变为首次发现（图1）；9种基因突变均发生在外显子区，其中1种为缺失突变c.1325delT（Leu424Cys），3种无义突变（Gln263stop、Trp228stop、Trp501stop），余5种为错义突变；有6种突变发生在丝氨酸蛋白酶催化域（SP）、其余3种发生在非催化域（AP3、AP4）；各有3例存在Gln263stop和Trp228stop纯合或杂合突变，这两种突变在无亲缘关系的家系中重复出现。先证者1为Gln263stop杂合突变，先证者2、6为Gln263stop纯合突变，先证者7为Val498Met杂合突变，先证者3、5、8、9、10分别为Trp228stop和Cys482Trp、Trp228stop和Trp501Ser、Gln263stop和Val498Met、Gly350Glu和Trp501stop、Trp228stop和Leu424Cys双杂合突变，表现为交叉反应物质阴性（CRM）阴性；先证者4为Tyr503Cys纯合突变，表现为CRM阳性；对家系成员分析发现，先证者的基因突变均遗传其父亲和（或）母亲，其中3个家系（先证者2、4、6）存在近亲婚配关系。

表2

10例遗传性凝血因子Ⅺ缺陷症家系先证者的F11基因检测结果

例号	核苷酸突变	氨基酸变化	外显子	功能区	突变类型
1	c.841C>T	Gln263stop	8	Ap3	杂合
2	c.841C>T	Gln263stop	8	Ap3	纯合
3	c.738G>A	Trp228stop	7	Ap3	双杂合
	c.1500C>G	Cys482Trp	12	SP
4	c.1562A>G	Tyr503Cys	13	SP	纯合
5	c.738G>A	Trp228stop	7	AP3	双杂合
	c.1556G>C	Trp501Ser	13	SP
6	c.841C>T	Gln263stop	8	AP3	纯合
7	c.1546G>A	Val498Met	13	SP	杂合
8	c.841C>T	Gln263stop	8	AP3	双杂合
	c.1546G>A	Val498Met	13	SP
9	c.1103G>A	Gly350Glu	10	AP4	双杂合
	c.1556G>A	Trp501stop	13	SP
10	c.738G>A	Trp228stop	7	AP3	双杂合
	c.1325delT	Leu424Cys	12	SP

图1

F11基因13外显子c.1562A>G纯合突变（A）和12外显子c.1325delT双杂合突变测序图（B）

讨论

F11基因位于4号染色体的长臂末端4q35，全长23 kb，含15个外显子和14个内含子。成熟的FⅪ由两条相同分子量的多肽链通过二硫键连接形成二聚体。该同源二聚体形成了4个盘状结构的AP结构域和一个催化域：AP1含有凝血酶结合位点，<span class="Gene">AP2含有HMWK结合位点，AP3含有肝素、FⅨ、血小板膜糖蛋白Ib结合位点，AP4第321位半胱氨酸（Cys321）是两个FⅪ单体通过二硫键形成二聚体的部位[3]。遗传性FⅪ缺陷症主要与F11基因突变有关，1953年由Rosenthal等[2]发现。FⅪ缺陷症的发病率与基因突变类型具有种族差异[4]。据最新的F11基因突变数据库统计，引起遗传性FⅪ缺陷症的突变有200余种，突变类型主要包括错义突变、无义突变、剪切突变、小片段缺失及小部分其他类型突变。由于F11基因的突变导致其产生、聚合、分泌及功能方面受影响，FⅪ水平降低。遗传性FⅪ缺陷症的表型突变可分为两种：CRM阴性，FⅪ∶C和FⅪ∶Ag水平均降低；CRM阳性，FⅪ∶C降低，FⅪ∶Ag正常。本研究中我们发现10例遗传性FⅪ缺陷症患者存在9种类型的F11基因突变，其中13外显子c.1562A>G（Tyr503Cys）、12外显子c.1325delT（Leu424Cys）2种突变为新突变，突变类型包括错义突变、无义突变和缺失突变。各突变位点均发生在外显子区，其中6种突变发生在SP区，3种突变发生在AP3-AP4区，可见这些区域可能是本地区F11基因较易发生突变及导致FⅪ功能异常的主要区域，并且还发现了本地区人群中存在导致遗传性FXI缺陷的突变热点：有3例含有Gln263stop和Trp228stop纯合或杂合突变，这两种突变在无亲缘关系的家系中重复出现。Shao等[5]发现这两个突变是中国人群FⅪ缺陷的热点突变。Quélin等[6]指出遗传性FⅪ缺陷症基因突变的纯合子和复合杂合子可致血浆FⅪ∶C降至15%以下；单一位点突变杂合子为15%~70%。本研究中基因突变家系先证者和家系成员的FⅪ∶C水平与此相符。

FⅪ缺陷症在创伤和手术相关的出血增多是最常见的出血表型，而自发性出血则较少见[5]。本研究中我们发现3例纯合突变的先证者，临床表型分别为轻型和无症状；不同的复合杂合突变临床表型有较大差异：表现为轻型、中型、无症状，但是纯合和复合杂合突变的临床出血症状占比较单一杂合性突变高，单一杂合突变均表现为无症状。本研究还发现10例先证者FⅪ∶C均小于23%，其中7例先证者的FⅪ∶C水平小于6%，9例FⅪ∶Ag明显降低。Guéguen等[7]发现FⅪ∶C无法预测临床出血风险及严重程度，严重的出血倾向也不一定显示出较低的FⅪ∶C水平。这也表明遗传性FⅪ缺陷症患者的临床出血表现与FⅪ∶C下降程度、基因突变类型无明显相关性。本研究通过家系分析发现，先证者的基因突变均遗传自父亲和（或）母亲，3个家系存在近亲婚配，均表现为纯合突变，表明近亲结婚容易导致遗传性FⅪ缺陷者患者基因纯合突变。

除了基因突变的数量，基因突变的位点对FⅪ的影响同样重要。我们共发现7种已报道的突变：Gln263stop、Trp228stop、Cys482Trp、<span class="Mutation">Trp501Ser、Val498Met、Gly350Glu和Trp501stop。王静等[8]对Gln263stop的研究发现，该无义突变使得编码263位的氨基酸提前出现终止密码，形成缺失部分结构域的短截型蛋白，该蛋白高度不稳定，并伴细胞内迅速讲解。武文漫等[9]对Trp228stop的研究发现，Trp228残基位于AP3结构域，该无义突变产生的短截蛋白缺失AP4及催化活性区，从而使蛋白的结构完整性和功能受到影响。刁戈等[10]对Cys482Trp的研究发现，Cys482残基位于SP区，当Trp取代Cys后，其会与His267之间形成空间位阻，与Cys362之间的二硫键连接也受到影响，从而导致蛋白结构改变。刘媚娜等[11]对Trp501Ser的研究发现，Trp501突变为Ser501后原有苯环消失，氢键增加，蛋白结构改变，将会被内质网或蛋白酶体降解途径提前降解，导致血浆中含量减低或活性异常。Kwon等[12]对Val498Met研究发现，Val498被Met498取代后催化域结构改变，产生功能异常的异二聚体，导致FⅪ分泌障碍，该突变可致FⅪ∶C下降为1%。Kravtsov等[13]对Gly350Glu的研究发现，该突变可导致FⅪ两个单体不能在细胞内聚合形成二聚体，而无法分泌到细胞外，使得血浆中FⅪ∶C水平极低甚至检测不到。董雷鸣等[14]对Trp501stop的研究发现，Trp501位于SP区，突变后产生短截蛋白，部分功能催化域缺失，蛋白结构高度不稳定而被迅速降解，导致循环中FⅪ∶C减低。本研究中新发现的导致遗传性FⅪ缺陷症的突变位点Tyr503Cys、Leu424Cys对FⅪ功能的影响有待于进一步研究。