[Preliminary study on immunological changes and clinical significance of decitabine treatment for relapsed acute myeloid leukemia after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation].

异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）是恶性血液病的主要治疗手段，移植后复发仍然是影响移植疗效的主要问题。目前，复发后的治疗包括化疗、供者淋巴细胞输注（DLI）及靶向药物治疗。单纯化疗或靶向药物可诱导缓解，但是不能维持；DLI具有抗白血病效应，可诱导缓解并改善预后，但是如果不加用免疫抑制剂，将加重移植后移植物抗宿主病（GVHD）发病，尤其是对于DLI后仍然处于复发状态或者持续微小残留病患者，治疗选择受限。以往的临床前研究提示去甲基化药物可以增强NK细胞功能[1]、增加肿瘤细胞抗原表达有助于恢复T细胞免疫识别[2]，同时可扩增调节性T细胞（Treg）[3]–[4]，具有潜在的降低GVHD同时保留移植物抗白血病作用。因此，去甲基化药物地西他滨、阿扎胞苷等被尝试应用于allo-HSCT后复发的急性髓系白血病（AML）患者[3],[5]–[6]。此外，去甲基化药物也被用于移植后白血病复发的预防和干预[7]–[9]。我们采用小剂量地西他滨（20 mg·m−2·d−1×5 d或15 mg·m−2·d−1×5 d）治疗4例改良DLI/大剂量化疗无效的移植后复发AML患者，采用8色流式细胞术检测CD4+T细胞及CD8+ T细胞CD25+Foxp3+、CD127、IL-17a及IFN-γ表达并采用流式细胞术检测基于CD107a表达及细胞内因子IFN-γ的分泌，检测不同亚群NK细胞毒性及胞内细胞因子IFN-γ分泌功能的差异。

病例与方法

1．病例：4例患者均于2011年11月至2013年3月期间在北京大学血液病研究所进行allo-HSCT且移植后复发、经化疗联合改良DLI效果不佳。患者主要临床特征见表1。

表1

4例异基因造血干细胞移植后复发急性髓系白血病患者一般资料及地西他滨治疗前情况

例号	年龄（岁）	性别	移植前疾病状态	染色体核型	供者	HLA位点不合数	急性GVHD	慢性GVHD	地西他滨前植活状态
1	14	女	复发，ETO 3.4%，C-KIT突变（+）	正常	兄供妹	3	Ⅱ度	中度	完全供者型
2	42	男	CR1	良好，t(8;22)	弟供兄	0	无	中度	完全供者型
3	41	女	复发，NPM1 14.32%，FLT3-ITD（+）	正常	兄供妹	0	无	无	移植后1个月完全供者型，地西他滨治疗前未查
4	48	男	复发，WT1 61.1%	正常	非血缘	1	Ⅰ度	轻度	完全供者型

注：GVHD：移植物抗宿主病；MRD：微小残留病；CR1：第一次完全缓解；FCM：流式细胞术；DLI：供者淋巴细胞输注；HAA：高三尖杉酯碱+阿克拉霉素+阿糖胞苷；IA：去甲氧柔红霉素+阿糖胞苷

2．预处理方案：全部采用常规的改良BU/CY（白消安/环磷酰胺）方案，HLA配型不合移植预处理中加用抗胸腺细胞球蛋白（ATG）。

3．干细胞的动员和采集：全部患者采用骨髓联合外周血干细胞移植，所有患者均以G-CSF进行干细胞动员。

4．急性GVHD的预防：采用环孢素A（CsA）+霉酚酸酯（MMF）+短程甲氨蝶呤（MTX）方案。

5．植活标准：中性粒细胞绝对计数（ANC）≥0.5×109/L连续3 d为粒细胞植活，PLT≥20×109/L连续7 d且脱离血小板输注为血小板植活。

6．移植后微小残留病（MRD）监测：对于伴重现性染色体异常的急性白血病患者，以其特征性标志基因作为监测指标，高于0.4%定义为阳性[10]；对于没有特征性标志基因的急性白血病患者，我们采用WT1基因作为监测指标，≥0.6%定义为阳性[11]。采用流式细胞术检测白血病相关免疫表型（LAIP）。移植后1、2、3、4.5、6、9、12个月检测MRD，基因检测或LAIP阳性者2周后复查。MRD阳性（分子生物学复发）定义如下：①连续2次出现特异性基因或LAIP阳性；②同时检出特异性基因和LAIP阳性。血液学复发定义为骨髓中原始细胞大于5%。

入组标准：对于复发患者（血液学复发/分子生物学复发），给予改良DLI[12]，改良DLI疗效不满意的患者给予地西他滨治疗。改良DLI和地西他滨治疗后继续监测MRD。所有接受治疗的患者均签署知情同意书。

7．改良DLI疗效判定：①完全有效（CR）：治疗后1个月特异性基因或WT1转阴，且在随访过程中未再转阳；②部分有效：治疗后1个月特异性基因或WT1下降≥1个log，且在随访过程中上升<1个log；③稳定：治疗后特异性基因下降≤1个log，但在随访过程中无进一步下降；WT1治疗后1个月没有上升，且较前有所下降，但在随访过程中未能转阴；④无效：治疗后1个月基因进一步上升；⑤失去疗效：特异性基因或WT1：曾经达到完全有效，但在随访过程中再次从阴性转成阳性。

将稳定、无效和失去疗效定义为DLI疗效不满意，可以考虑给予地西他滨干预。

8．治疗方案：患者的预处理、GVHD预防、移植复发后化疗和改良DLI的方案按照我所常规方案[10],[13]–[14]进行。在改良DLI治疗后，对于疗效稳定的患者可以根据患者意愿，选择观察3~6个月，若仍判断改良DLI疗效为稳定可尝试停用免疫抑制剂，同时给予小剂量IL-2治疗（1×106 U·kg−1·d−1，连续2周为1个疗程）；若停用免疫抑制剂后1~2个月判断疗效仍为稳定、无效或失去疗效则给予干扰素α或小剂量地西他滨治疗；对于改良DLI无效或失去疗效的患者直接给予地西他滨治疗，同时停用免疫抑制剂。地西他滨选用20 mg·m−2·d−1（2例）或15 mg·m−2·d−1（2例），连续应用5 d。

9．标本采集：地西他滨治疗前、采集外周血标本；治疗后5周内，每周采集1次外周血标本。采用8色流式细胞术分别检测CD4+CD25−CD127+效应性T细胞（Tcon细胞）、CD4+CD25highCD127low、CD4+Treg细胞、CD3+CD8−IFN−γ+T细胞（Th1细胞）、CD3+CD8−IL17a+T细胞（Th17细胞）、CD8+CD25+FoxP3+ Treg细胞（CD8+ Treg细胞）、CD3+CD8+IFN-γ+T细胞（Tc1细胞）、CD3+CD8+IL17+ T细胞（Tc17细胞）表达，同时检测NK细胞IFN-γ分泌水平以及杀伤活性。

10．流式细胞术检测：①第1管（膜表面抗体标记）：采用8色抗体组合，CD62L-FITC、CD56-PE、CD4-Percp、CD69-APC、CD3-V500（美国Becton Dickinson公司产品）、CD16-APC/CY7、CD25-PE/CY7、CD127-Brilliant Violet（美国BioLegend公司产品）；②第2管（FoxP3及胞内细胞因子IL-17a、IFN-γ检测）：免疫荧光抗体包括CD3-APC/CY7、CD25-PE/CY7、CD8-Eflour 660（美国ebioscience公司产品）；按照Cytofix/Cytoperm试剂盒（美国ebioscience公司产品）说明操作固定破膜后，标记胞质内FoxP3-Eflour 450、ROR-γ-PE、IFN-γ-Percp和IL-17a-FITC的表达（美国ebioscience公司产品）；③第3管CD107a及IFN-γ检测：具体方法检测按我所之前研究[15]。所用细胞膜表面免疫荧光包括：CD3-多甲藻黄素叶绿素蛋白质复合物（PerCP），CD107a-PE，CD158a-异硫氰酸荧光素（FITC），CD158b-FITC，CD158e-FITC（美国Becton Dickinson公司产品）及CD56-APC/cy7，CD57-太平洋蓝（美国Biolengend公司产品）；所用细胞内免疫荧光抗体为IFN-γ-PE-CY7。固定破膜采用Cytofix/Cytoperm试剂盒（美国Becton Dickinson公司产品）。

结果

1．一般资料：如表1所示，1例接受同胞HLA单倍型造血干细胞移植，1例接受非血缘HLA9/10相合造血干细胞移植，2例接受同胞HLA全相合造血干细胞移植。其中2例为伴t（8；21）染色体异位的AML（例1、2），1例为NPM1阳性，伴有FLT3-ITD突变AML（例3）；男性2例，女性2例；1例移植时处于完全缓解状态，移植后8个月复发，3例移植前为复发状态。3例移植前复发状态患者，在移植后1~2个月给予预防性改良DLI，1例移植后复发的患者在移植后8个月接受治疗性改良DLI输注。在地西他滨治疗前，例1接受了化疗+改良DLI、停免疫抑制剂加IL-2治疗，仍持续MRD阳性；例2接受化疗+改良DLI、停免疫抑制剂加IL-2、干扰素治疗，MRD持续阳性；例3和例4仅接受预防性改良DLI。例1、2、3、4从改良DLI到地西他滨治疗的间隔分别为150、90、46、24 d。地西他滨治疗前，4例患者均为复发状态（分子生物学复发、血液学复发各2例）。

2．疗效及转归：2例治疗有反应（例1、例4）。例1地西他滨治疗后ETO基因水平下降1个Log（地西他滨前ETO基因0.69%，地西他滨后ETO基因0.02%）；例4地西他滨治疗后获得血液学缓解且MRD阴性，WT1基因由11.3%降至0.48%。地西他滨治疗前，例1、例4嵌合状态均为100%供者型，地西他滨治疗后嵌合未查；例1随访至allo-HSCT后5年，持续保持无白血病存活状态；例4于allo-HSCT后骨髓持续MRD阴性，移植后19个月死于心律失常。

2例（例2、例3）治疗无反应。例2地西他滨治疗后由分子生物学复发变为血液学复发，地西他滨治疗前ETO基因3%，治疗后ETO基因升至179.6%，骨髓原始细胞6%。例3地西他滨治疗前为血液学复发，治疗后无变化。例2地西他滨治疗前后嵌合状态均为100%供者型，例3在移植后1个月（DLI前）为完全供者型，但地西他滨治疗前未查，地西他滨治疗后为供受者混合型（表1）。例2、例3分别在allo-HSCT后12、7个月死于血液学复发。

3．移植后应用地西他滨的不良反应：如图1A所示，地西他滨不良反应主要为骨髓抑制，持续时间为2周左右，均在地西他滨应用后3周血象达到低谷，在第4周明显回升。例1、2在接受地西他滨治疗前有中度慢性GVHD，地西他滨治疗后患者慢性GVHD无变化，例3在接受地西他滨治疗前后均无GVHD，例4在地西他滨治疗前急性GVHD已缓解，地西他滨治疗后出现皮疹，诊断轻度慢性GVHD，给予糖皮质激素治疗后迅速缓解，未观察到其他明显不良反应。

图1

地西他滨治疗前后白细胞总数及淋巴细胞亚群变化

A：白细胞总数；B：淋巴细胞总数；C：NK细胞；D：T细胞；E：NKT细胞

4．地西他滨体内应用前后淋巴细胞数量的变化：如图1B所示，地西他滨在治疗后2周淋巴细胞总数达到最低点。其中地西他滨治疗有反应2例患者（例1和例4），在达珂后第5周淋巴细胞恢复超过2000个/µl，而地西他滨治疗无反应且最终死于复发的2例患者（例2和例3），在地西他滨治疗后第5周淋巴细胞绝对值低于1000个/µl。NK细胞亚群（图1C）、T细胞亚群（图1D）以及NKT细胞亚群（图1E）数量重建规律与淋巴细胞总数相近，恢复快慢与疾病最终预后相关。

5．地西他滨体内应用对T淋巴细胞亚群的影响：如图2A所示，地西他滨治疗前后对Tcon在CD4+T细胞中所占比例影响不大，而且持续缓解病例（例1与例4）与最终死于复发病例（例2、例3）效应性T细胞比例非常接近。地西他滨治疗后，例1的Treg逐渐扩增，而例2、3、4地西他滨治疗前后Treg在CD4+T细胞中所占比例变化不大。治疗有反应组CD4+T细胞IFN-γ和IL-17α的分泌水平，在地西他滨治疗后第4周达到最低点，在第5周恢复至治疗前水平；CD8+T细胞IFN-γ和IL-17α的分泌水平与CD4+T细胞基本一致；而且地西他滨治疗有反应病例（例1与例4）CD4+T细胞和CD8+T细胞IFN-γ和IL-17α的分泌恢复水平与淋巴细胞总数恢复规律一致（先下降，然后上升），而地西他滨治疗无反应患者（例2、例3）则持续下降。

图2

流式细胞术检测地西他滨治疗前后T细胞亚群及其功能改变

A：效应性T细胞（Tcon）占CD4+T细胞的比例；B：调节性T细胞（Treg）占CD4+T细胞的比例；C：CD4+T细胞分泌IFN-γ的变化；D：CD8+T细胞分泌IFN-γ的变化；E：CD4+T细胞分泌IL-17的变化；F：CD8+T细胞分泌IL-17的变化

6．地西他滨体内应用对NK细胞亚群及功能的影响：如图3所示，CD56dimNK细胞亚群比例在复发病例（例2、3）中明显低于持续缓解患者（例1、4），CD56brightNK细胞亚群比例则相反，且复发病例（例2、3）在地西他滨治疗后3周CD56bright呈现明显回升趋势。与地西他滨治疗对NK数量影响一致，地西他滨治疗后NK杀伤功能和IFN-γ分泌水平大约在地西他滨治疗后2周达到最低点，在第3周很快恢复；而且似乎地西他滨治疗无反应病例（例2、3），NK杀伤活性恢复要快于地西他滨治疗有反应患者（例1、4）；同样，例3的NK细胞IFN-γ分泌水平要高于地西他滨治疗有反应患者，与CD56brightNK细胞亚群的变化趋势一致。提示地西他滨治疗对NK细胞功能只有短暂影响；最终地西他滨治疗后无反应患者NK数量恢复差，尽管NK杀伤活性增强并未能阻止最终白血病复发。

图3

流式细胞术检测地西他滨治疗前后NK细胞亚群比例及功能变化

A：CD56brightNK细胞亚群；B：CD56dimNK细胞亚群；C：CD107a在NK细胞中的表达；D：NK细胞分泌IFN-γ水平的变化

讨论

改良DLI可通过增强移植物抗白血病效应清除白血病，但同时有诱发GVHD的风险，如果患者改良DLI后持续不缓解或持续残留白血病阳性，限制了进一步复发治疗的选择。以往研究显示CD4+ CD25high FoxP3+调节性T细胞降低可移植后急性GVHD的发病率和严重程度，但并不减弱移植物抗白血病效应。Choi等[16]在小鼠模型中进行的研究显示，移植后早期给予Azacitidine可体内扩增CD4+CD25high FoxP3+调节性T细胞，降低GVHD的发病率和严重程度，同时不影响中性粒细胞植入，仍具有抗白血病效应。但地西他滨在人体内中是否有类似的免疫学变化尚无报道。基于Choi等动物实验的结果，我们在本研究中纳入4例对改良DLI/大剂量化疗疗效不满意、无效或失去疗效的移植后复发AML患者，给予小剂量地西他滨（20 mg·m−2·d−1×5 d或15 mg·m−2·d−1×5 d）治疗，地西他滨治疗有反应的患者，在地西他滨治疗后T细胞分泌IL-17a及IFN-γ能力要明显优于无反应患者，提示肿瘤负荷的下降有助于T细胞功能恢复，与刘龙等[17]研究结果一致。在本组4例患者中，只有1例观察到了地西他滨治疗后调节性T细胞数量增多，另外3例治疗前后无明显变化，也和治疗反应无明显关系。

NK细胞从细胞表型可区分为CD56dimNK亚群和CD56brightNK亚群，前者具有更成熟的细胞表型，以发挥杀伤功能为主，后者表型幼稚，主要以分泌细胞因子功能为主，以往研究提示在初诊急性白血病患者中CD56dimNK细胞亚群减少，治疗缓解后有所恢复[18]，本研究也发现在地西他滨治疗有反应患者存在NK细胞（主要是CD56dimNK细胞）恢复，而无反应患者总体NK细胞数量少，而且主要为CD56bright亚群，CD56dim亚群不恢复，提示白血病细胞可诱导NK细胞数量减少且对CD56dimNK细胞亚群影响更大。动物实验结果显示，地西他滨联合体外扩增NK细胞回输在清除小鼠急AML肿瘤负荷方面具有协同作用[19]。而本研究结果显示，地西他滨无反应患者治疗后NK细胞功能较治疗前有所增强，但NK细胞数量很低，而地西他滨有反应患者，NK细胞功能变化不大，也提示当存在大量肿瘤负荷时，肿瘤联合地西他滨可进一步激活体内NK细胞功能，但NK数目低，最终未能清除白血病。进一步研究白血病复发时NK细胞数量减少的机制，促进NK细胞数量和抗白血病功能，可进一步增强小剂量地西他滨的疗效。

从本组4例患者结果来看，有2例能够诱导缓解或MRD转阴，其中1例后续经过干扰素联合治疗持续MRD阴性，另外1例骨髓持续CR，但最终死于心律失常。Motabi等[20]回顾性分析了强化疗（73例）或去甲基化药物（27例）单用或联合DLI治疗造血干细胞移植后复发患者，化疗组比去甲基化药物组具有更好的反应率（51%对19%，P=0.004）和更好的缓解率（40%对7%，P=0.002）。与上述结果不同，本组2例有反应患者后续随访持续缓解状态，分析原因可能为：①4例患者都是在改良DLI后，2例为血液学复发，2例为分子生物学复发，相对肿瘤负荷较低；②DLI治疗后再用地西他滨是否会有更好的协同作用值得进一步探讨。

本研究重点为初步探讨改良DLI/大剂量化疗无效的移植后复发AML患者地西他滨治疗前后体内免疫学变化，该方案的安全性和有效性尚需进一步探讨。

表2

4例异基因造血干细胞移植后复发急性髓系白血病患者地西他滨治疗情况及转归

例号	地西他滨前疾病状态	地西他滨前MRD水平	地西他滨剂量	地西他滨后疾病状态	地西他滨后MRD水平	地西他滨后GVHD	血液学毒性	地西他滨后治疗			转归
								DLI	干扰素	化疗
1	CR	ETO 0.69%	20 mg·m−2·d−1×5 d	CR	ETO 0.02%	无变化	Ⅱ级	无	每周2次	无	移植后5年，无病生存
2	CR	ETO 3.0%	20 mg·m−2·d−1×5 d	NR	ETO 179.6%	无变化	Ⅱ级	无	无		移植后1年死于复发
3	NR	WT1 2.9%；NPM 18.88%	20 mg·m−2·d−1×5 d	NR	WT1 36.1%，NPM1 127.58%	无	Ⅲ级	地西他滨后15 d、移植后3个月治疗性DLI	无	MA、FLAG、ME	移植后7个月死于复发
4	NR	WT1 11.3%	20 mg·m−2·d−1×5 d	CR	WT1 0.48%	轻度慢性GVHD	Ⅳ级	无	无	无	移植后19个月死于心律失常

注：DLI：供者淋巴细胞输注；HAA：高三尖杉酯碱+阿克拉霉素+阿糖胞苷；MA：米托蒽醌+阿糖胞苷；FLAG：氟达拉滨+阿糖胞苷+G-CSF；ME：米托蒽醌+依托泊苷。CR：血液学完全缓解，NR：血液学未缓解