Differences in iron intake during pregnancy influence in trainability response of male rat offspring.

OBJECTIVE: To evaluate if different concentrations of iron in diets during pregnancy would interfere in the aerobic and anaerobic performance of the offspring, observed during 8-week swimming training and measured by lactate minimum test.
METHODS: Pregnant rats were divided into four groups with different dietary iron concentrations: standard (40mg/kg), supplementation (100mg/kg), restriction since weaning, and restriction only during pregnancy (4mg/kg). After birth, the offspring were assigned to their respective groups (Standard Offspring, Supplementation Offspring, Restriction Offspring or Restriction Offspring 2). The lactate minimum test was performed at three time points: before starting exercise training, after 4 weeks and after 8 weeks of exercise training.
RESULTS: The Restriction Offspring Group had a significant reduction in the concentration of lactate minimum and in swimming time to exhaustion, after 4 and 8 weeks of training as compared to before training. Therefore, the results showed the Restriction Offspring Group was not able to maintain regularity during training in lactate minimum tests.
CONCLUSION: Our results suggested the Restriction Offspring Group showed a marked decrease in its performance parameters, which may have occurred due to iron restriction.

INTRODUCTION

Iron is the functional component of hemoglobin and myoglobin, and an essential nutrient for the efficient transport of oxygen to body tissues. Iron also plays a key role in the electron transport chain, in oxidative phosphorylation within the mitochondria, and red blood cell production.()

Iron deficiency (ID) is a common micronutrient deficiency all over the world, and may cause some symptoms, such as fatigue, exhaustion, heart palpitations, and pallor, besides influencing body functions, such as physical performance, thermoregulation, immune response, and neurological functions.(,)

The risk groups for ID include women during pregnancy and postpartum. Many studies have shown that the consequences of ID during a development period, such as gestation, can extend throughout adult life, even with iron replacement. These consequences are behavioral, neuroanatomic, neurochemical, and neurophysiological.(–) Iron supplementation seems to be adequate to prevent ID in 90% of women during pregnancy and postpartum.()

Maternal intake during pregnancy can impact health and cause physical and mental changes throughout the life of the offspring.(,) In addition, some habits developed during life (such as diet and exercise) contribute to these changes.()

However, to date, little is known about the effect of this exposure of mothers to ID or iron supplementation on the physical performance of offspring in adult life.

Some studies have shown that physical exercise can reduce iron-blood concentration, including serum ferritin (sFer), hemoglobin and erythrocytes, and increases the soluble transferrin receptor (sTfR), indicating impaired iron metabolism.(–)

Iron deficiency can attenuate aerobic performance, sincethere is a decrease in hemoglobin levels, oxygen transport in skeletal muscle, maximal oxygen uptake, and ability to withstand submaximal exertion. Moreover, ID negatively interferes in the activity of oxidative enzymes and respiratory proteins. Iron status can affect endurance and energy efficiency.(–) Thus, an individual who does not have adequate iron levels may show a noticeable drop in his physical performance.()

Studies have shown an association between iron status and anaerobic performance.(,) However, since anaerobic exercise does not require the availability of oxygen, it is difficult to explain these relations. One hypothesis debated is that the process of resynthesis of creatine phosphate used as energy by the adenosine triphosphate (ATP) and creatine phosphate (CP) system is oxygen-dependent.()

One way to analyze aerobic and anaerobic parameters in just one assessment session is by means of the lactate minimum test (LMT),() adopted for this purpose in human() and animal models.()

OBJECTIVE

To evaluate if different concentrations of iron in diets during pregnancy would interfere in the aerobic and anaerobic performances of the offspring, observed during 8-week swimming training and measured by lactate minimum test.

METHODS

Animals

All procedures were approved by the Ethics Committee on the Use of Animals of the Universidade Estadual de Campinas (Unicamp) (number 3876-1). The experiment was carried out in 2 moments ( Figure 1 ): with the mothers and with the offspring.

Figure 1

Flowchart showing the groups and exercise

First moment

This experiment used 12 female and 3 male Wistar rats, aged 21 days and over, acquired from the Bioethics Center of Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica na Área da Ciência em Animais de Laboratório (CEMIB), of Unicamp. Rats were kept transparent cages, four animals per cage, until induction of pregnancy, under controlled conditions of 12-hour light-dark cycle (lights on at 6 a.m.), at a temperature of 23±2°C, with unrestricted access to water and food.

For the induction of pregnancy, two females were placed with one male in each cage. After pregnancy was identified, the mothers were housed in individual cages and randomly distributed into the following groups: pregnant with standard iron diet (PFeSt; n=3); pregnant with iron supplementation diet (PFeSu; n=3); pregnant with iron-restricted diet since weaning - 21 days (PFeR1; n=3); and pregnant with iron-restricted diet only in pregnancy (PFeR2; n=3).

The PFeSt Group remained on the standard iron diet (40mg/kg)() throughout the experiment. The PFeR1 Group received the reduced iron (4mg/kg) diet until the offspring was born. The PFeSu (100mg/kg) and PFeR2 (4mg/kg) groups received the standard diet until the pregnancy was detected, and during the whole pregnancy period, they received the supplementation and restriction diets, respectively. All diets were freely available, and body weight was recorded weekly throughout the experiment. After birth and until weaning the mothers received a standard iron diet (40mg/kg). After 21 days of lactation, the female offspring was separated from the male offspring.

Second moment

The male offspring were distributed into the groups according to the diet ingested by the mother: offspring of mothers who received a standard diet (OFeSt; n=6); offspring of mothers who received iron supplementation diet during pregnancy (OFeSu; n=8); offspring of mothers who received iron-restricted diet since weaning (OFeR1; n=8); and offspring of mothers who received iron-restricted diet only in pregnancy (OFeR2; n=8).

The offspring was weighed at birth and, after weaning, all groups received standard iron diet. At 70 days of age, the offspring was submitted to procedures of adaptation to a liquid medium progressively for 14 consecutive days. After adaptation, they were evaluated by the LMT for individual determination of anaerobic threshold (AT) and determination of the aerobic condition. The training was performed for 8 weeks, with reevaluations after 4 and 8 weeks of exercise. After the last LMT, the animals were submitted to euthanasia ( Figure 1 ).

Experimental procedures

Iron diet

The diet used to feed the females was produced from purified ingredients, following the composition of the AIN93-G formulations. The values presented in AIN93-G correspond to the needs of the rodent diet in the growth, pregnancy and lactation stages.() The diets for restriction (4mg/kg) and supplementation (100mg/kg) of iron were performed by manipulating the mineral mix, according to the specific percentage for that condition, adjusting the general composition of the mix by the vehicle (sucrose), not altering the caloric density of the diet. The 40mg/kg-diet was used for the Standard Mothers’ Group and Offspring Groups.

Diet samples were sent to the Instituto Adolfo Lutz, São Paulo (SP, Brazil), to verify the iron concentration of each specific diet (standard, restriction, and supplementation).

Exercise

The swimming training and the LMT were applied with controlled loads always at the same time (6 p.m.). All procedures were performed in water maintained at 31±1°C and individually, with swimming tanks divided by cylindrical 30cm diameter PVC tubes.

Adaptation to water

The animals were submitted to 14 sessions of adaptation to water, being three sessions in water at 15cm of depth. On subsequent days, five sessions of adaptation to free swimming with 120cm of depth, starting with 2 minutes of exercise and increments of 2 minutes daily, until 10 minutes of effort were reached. Next, six specific sessions of adaptation were applied with the mouse swimming and carrying different loads, in percentages of body weight, and time interval varying as a function of the intensity applied. These were only aimed for adaptation to the liquid environment, thermal stress, manipulation, and loads, which remained attached to the animal (back), and were not designed to improve physical condition (training).

Lactate minimum test

For determination of aerobic and anaerobic parameters, the LMT protocol described by de Araujo et al.,() was adopted, applied at three-time points during the experimental period: before the training program (animals approximately 84 days old), aiming to identify the individual intensity of AT for training prescription (test 1); after 4 weeks of training (animals approximately 112 days old), to follow the aerobic and anaerobic evolutions and to adjust the training loads (test 2); after 8 weeks of training (animals approximately 140 days old), to identify the training effects on the aerobic and anaerobic parameters analyzed (test 3).

For the LMT and during training, the loads were attached to the animal's back and the percentage of load was calculated for the weight of each animal.

The LMT consisted of a phase of induction of hyperlactatemia, followed by the protocol of incremental loads. The phase of hyperlactatemia was divided into three consecutive parts: 30 seconds effort swimming (load of 13%); 30 seconds of rest interval; and swimming time to exhaustion (TLim) (load of 13%). After the TLim, a passive rest lasting 9 minute (to reach blood lactate peak). After 9 minutes, a protocol of incremental loads was applied to determine the intensity at which the lowest lactatemia was observed, representing the highest intensity of balance between the production and removal of blood lactate. The incremental protocol was performed by swimming with loads of 4%, 4.5%, 5%, 5.5%, 6%, and 7% of the animal weight (lasting 5 minutes for each load) or until exhaustion.

In this way, the lactate minimum concentration was used as an individualized parameter of aerobic capacity and the time to exhaustion during the induction phase as the anaerobic capacity parameter.

Blood samples were drawn from the tip of the animal tail (25μL per collection) through disposable capillary tubes calibrated with heparin.

Subsequently, the extracted blood was stored in Eppendorf tubes with an addition of 50μL of 1% sodium fluoride. Lactate concentrations were determined using the YSI-2300 Yellow Spring lactometer, calibrated and operated according to the manufacturer's specifications.

The value of the balance between production and lactate removal was used to calculate the training load (80% of this value versus body weight). The loads were adjusted weekly.

Training program

The individual intensity of exercise corresponded to the product of body weight for 80% of the intensity obtained in the LM, with a volume of 60 minutes per day of swimming, six times a week.() The loads added to the back were readjusted according to the body mass weekly. Physical exercise was performed in the dark period (corresponding to the daytime period of the rats).

Statistical analysis

The results were analyzed through the Statistica 7.0 software. The mean number of animals per mother was analyzed by analysis of variance (Anova) one-way, followed by Tukey test post-hoc analysis. For analysis of the lactate minimum, TLim (of the LMT) and the weight of offspring, the repeated measure Anova was applied, followed by Tukey test post-hoc analysis. The level of significance was set at p<0.05 and data were expressed as mean±standard error.

RESULTS

The results did not present statistically significant differences for the mean number of animals per mother (PFeSt: seven animals; PFeSu: ten animals; PFeR1: seven animals, and PFeR2: nine animals). All groups of offspring had a similar pattern of body weight gain throughout the experiment. All groups had a significant increase, relative to themselves, as from 84 days of life.

The results presented here from the LMT were the TLim during the hyperlactatemia phase and contraction of lactate at the moment of balance between production and removal of lactate in the blood (lactate minimum).

The OFeR1 Group had a statistically significant reduction of TLim from tests 2 and 3 to test 1, as well as the OFeSu and OFeR2 Groups in test 3 to test 1 of the OFeR1 Group. In addition, a tendency (p=0.06) of limit time reduction was demonstrated for the OFeSu Group in test 3 compared to the OFeSt Group in test 1 ( Figure 2A ). Results showed that the OFeR1 Group had a statistically significant reduction of lactate minimum value in tests 2 and 3 in relation to test 1 ( Figure 2B ).

Figure 2

Results of lactate minimum test. (A) swimming time to exhaustion seconds obtained through the lactate minimum test at three time points: baseline (test 1), after 4 weeks of training (test 2) and after 8 weeks of training (test 3). Analysis of variance repeated measures, post Tukey test. Time [F(6.52) = 20,1922; p<0.00001] Group [F(6.52) = 1,7200; p<0.187469] interaction [F(6.52) = 2,2092; p=0.056]. (B) lactate minimum concentration obtained through the lactate minimum test at three time points: baseline (test 1), after 4 weeks of training (test 2) and after 8 weeks of training (test 3). Analysis of variance repeated measures, post Tukey test. Time [F(6.52) = 8,627, p<0.001] group [F(6.52) = 0,889; p=0.459668] interaction [F(6.52) = 4,068; p<0.01]

No statistical differences were found between groups at the time of test 1. The other groups did not show significant alterations in the lactate minimum concentration and TLim after tests 2 and 3 to test 1.

DISCUSSION

The use of animals in laboratory research helps to investigate stress conditions observed in humans, and enables the monitoring of further changes arising, like iron restriction and exercise.

The study evaluated if different concentrations of iron in diet during pregnancy would interfere in the aerobic and anaerobic performance, measured through the LMT, of rat offspring.

In LMT, our results showed a reduction in aerobic and anaerobic capacity in OFeR1 Group over 8 weeks of training. A possible hypothesis for these changes would be through epigenetics, when there are modifications in the genome through chemical changes that occur in the DNA molecule, which are caused by external factors, such as exercise, diet and stress, and that can be inherited during cellular division.()

The literature has shown remarkable results of inheritable epigenetics in an animal models. Some studies have shown that altering the mother's diet affects the metabolism, gene expression of offspring and, consequently, generates metabolic disorders in adult life.(,)

In the study, serum iron and/or gene expression were not performed, however, the diet produced was analyzed; it was found that it presented the specific concentrations for each group.

Even though there were no statistically significant differences in the mean number of animals per mother, the mothers receiving a diet with supplementation had a higher number of pups as compared to other groups. However, it was verified that the weight of the animals throughout the experiment remained similar, not showing changes due to the mother's diet.

The analyses performed for LMT demonstrated the OFeR1 Group showed a significant decrease in lactate values in the first test. The mothers of the OFeR1 Group offspring suffered iron restriction before and during pregnancy, demonstrating a possible relation between diet, epigenetics, and aerobic capacity. However, the OFeR2 Group, in which the mothers received the iron-restricted diet only during pregnancy, did not obtain the same results, suggesting the duration of iron restriction intake influenced the changes.

Studies have shown the reversibility of iron changes in the body depends on the severity and duration of ID.(,,) Also, a study conducted in 2000 with rats fed an iron-deficient diet during pregnancy showed the brain iron levels returned to normal values in 2 weeks of standard iron diet.() Another study with ID during pregnancy showed that iron and monoamine levels in offspring fed standard dietary after weaning were restored.() However, further studies are warranted to understand the different consequences caused by iron restriction for longer or shorter periods.

One of the properties of iron is to be ergogenic, that is, iron can help in the formation of hemoglobin and improve the transport of oxygen in the blood and muscles, and also in the production of energy via oxidative phosphorylation.() The OFeSt and OFeSu Groups did not show significant differences in the values of the tests; therefore, they were able to maintain regularity in the results in all tests of LMT, but without improvement. These results open a space for the hypothesis that a regular iron diet or supplementation during pregnancy can enable the offspring to maintain constancy in their aerobic capacity results, being able to present regularity in their training.

The TLim was established to verify the anaerobic performance of the offspring, in which the OFeR1 Group showed a significant decrease to itself when compared to the first test. The iron restriction of this group did not allow them to progress or maintain their performance throughout the tests. According to some studies, when hemoglobin and iron are not at normal levels it can lead to a significant worsening of anaerobic performance.(,) Our results showed a reduction in TLim of the OFeSu, OFeR2, and OFeR1 in test 3 compared to OFeR1 in test 1. However, the OFeSt, OFeSu and OFeR2 groups maintained similar results throughout the experiment (test 1, test 2 and, test 3) to themselves.

Research groups around the world are dedicated to understanding the effects of epigenetic changes during pregnancy, and how the offspring's lifestyle habits can interact with these changes. Studies have shown that iron restriction causes epigenetic changes in the hippocampus of mice and mitochondrial proteins.(,) In this sense, we believe that restriction and supplementation during pregnancy was sufficient to cause changes in iron metabolism, due to the results demonstrated in the offspring.

CONCLUSION

These results obtained from swimming training of the animals showed that the offspring of mothers who received an iron-restricted diet, before and during pregnancy, showed a marked decrease in their aerobic capacity and anaerobic metabolism indicator through lactate minimum test, while the other groups (offspring of mothers who received standard diet, offspring of mothers who received iron supplementation diet during pregnancy and offspring of mothers who received iron- restricted diet only in pregnancy) had no change in performance over the experiment. However, further studies are required on the subject, since little is known about the consequences of iron restriction on inheritable epigenetics about physical performance.

INTRODUÇÃO

O ferro é o componente funcional da hemoglobina e da mioglobina, sendo um nutriente essencial para o transporte eficiente de oxigênio aos tecidos do organismo. Além disso, desempenha papel fundamental na cadeia de transporte de elétrons, na fosforilação oxidativa dentro da mitocôndria e na produção de glóbulos vermelhos.()

A deficiência de ferro (DFe) é uma deficiência de micronutrientes comum no mundo todo e pode causar alguns sintomas, como fadiga, exaustão, palpitações e palidez, além de afetar funções orgânicas, como desempenho físico, termorregulação, resposta imune e funções neurológicas.(,)

Os grupos de risco para DFe incluem mulheres durante a gravidez e no pós-parto. Muitos estudos mostraram que as consequências da DFe ocorrida durante um período de desenvolvimento, como a gestação, podem se prolongar ao longo da vida adulta, mesmo com reposição de ferro. Tais consequências são comportamentais, neuroanatômicas, neuroquímicas e neurofisiológicas.(–)A suplementação de ferro parece ser adequada para prevenir DFe em 90% das mulheres durante a gravidez e no pós-parto.()

A ingestão materna de ferro durante a gravidez pode impactar na saúde e causar alterações físicas e mentais ao longo da vida da prole.(,)Além disso, há hábitos mantidos ao longo da vida, como alimentação e exercícios, que contribuem para essas alterações.()

Porém, até o momento, pouco se sabe do efeito da exposição da mãe à DFe ou da suplementação de ferro no desempenho físico da prole na vida adulta.

Alguns estudos mostraram que o exercício físico pode reduzir a concentração de ferro no sangue, incluindo ferritina sérica (sFer), hemoglobina e eritrócitos, e aumentar a concentração do receptor de transferrina solúvel (sTfR), indicando a presença de um metabolismo de ferro prejudicado.(–)

A DFe pode atenuar o desempenho aeróbio, pois há diminuição dos níveis de hemoglobina, do transporte de oxigênio no músculo esquelético, do consumo máximo de oxigênio e da capacidade de suportar esforços submáximos. Ainda, a DFe interfere de forma negativa na atividade de enzimas oxidativas e proteínas respiratórias. Os níveis de ferro podem afetar a resistência e a eficiência energética.(–)Assim, um indivíduo que não apresenta níveis adequados de ferro pode apresentar queda perceptível em seu desempenho físico.()

Há estudos que mostram associação entre os níveis de ferro e o desempenho anaeróbio.(,)No entanto, como o exercício anaeróbio não requer a disponibilidade de oxigênio, é difícil explicar tais relações. Uma hipótese debatida é a de que o processo de ressíntese do fosfato de creatina (usado como energia pelo sistema anaeróbio alático – ATP-CP: adenosine triphosphate - creatine phosphate) é dependente de oxigênio.()

Uma forma de analisar os parâmetros aeróbios e anaeróbios em apenas uma sessão de avaliação é por meio do teste de lactato mínimo (TLM),()adotado para esse fim em humanos()e modelos animais.()

OBJETIVO

Avaliar se diferentes concentrações de ferro na dieta durante a gestação afetam o desempenho aeróbio e anaeróbio da prole, observado durante 8 semanas de treinamento de natação e medido por meio do teste de lactato mínimo.

MÉTODOS

Animais

Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética no Uso de Animais da Universidade Estadual de Campinas (Unicamp) (nº 3876-1). O experimento foi realizado em dois momentos ( Figura 1 ): com as mães e com a prole.

Figura 1

Fluxograma mostrando os grupos e os exercícios

Primeiro momento

Este experimento utilizou ratos Wistar, sendo 12 fêmeas e três machos, com pelo menos 21 dias de idade, adquiridos no centro de bioética do Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica na Área da Ciência em Animais de Laboratório (CEMIB) da Unicamp. Os ratos foram mantidos em gaiolas transparentes, com quatro animais em cada, até a indução da prenhez, sob condições controladas de ciclo claro-escuro de 12 horas (luzes acesas às 6h), a uma temperatura de 23±2°C, com acesso irrestrito à água e à comida.

Para a indução da prenhez, duas fêmeas foram colocadas com um macho em cada gaiola. Após a identificação da prenhez, as mães foram alojadas em gaiolas individuais e distribuídas aleatoriamente nos seguintes grupos: prenhes com dieta padrão de ferro (PFeSt; n=3); prenhes com dieta de suplementação de ferro (PFeSu; n=3); prenhes com dieta com restrição de ferro desde o desmame, de 21 dias (PFeR1; n=3) e prenhes com dieta restrita em ferro apenas na prenhez (PFeR2; n=3).

O Grupo PFeSt manteve a dieta padrão com ferro (40mg/kg)()durante todo o experimento. O Grupo PFeR1 recebeu dieta com redução de ferro (4mg/kg) até o nascimento da prole. Os Grupos PFeSu (100mg/kg) e PFeR2 (4mg/kg) receberam a dieta padrão até a detecção da prenhez e, durante todo o período gestacional, receberam as dietas de suplementação e restrição, respectivamente. Todas as dietas estavam disponíveis livremente, e o peso corporal foi registrado a cada semana, durante o experimento. Após o nascimento e até o desmame, as mães receberam uma dieta padrão de ferro (40mg/kg). Após 21 dias de lactação, a prole feminina foi separada da masculina.

Segundo momento

Os filhotes machos foram distribuídos nos grupos de acordo com a dieta ingerida pela mãe: prole de mães que receberam dieta padrão (OFeSt; n=6); prole de mães que receberam dieta de suplementação de ferro durante a prenhez (OFeSu; n=8); prole de mães que receberam dieta com restrição de ferro desde o desmame (OFeR1; n=8) e prole de mães que receberam dieta com restrição de ferro apenas na prenhez (OFeR2; n=8).

A prole foi pesada ao nascer e, após o desmame, todos os grupos receberam dieta padrão com ferro. Aos 70 dias de idade, os filhotes foram submetidos progressivamente a procedimentos de adaptação a meio líquido por 14 dias consecutivos. Após a adaptação, foram avaliados pelo TLM para determinação individual do limiar anaeróbio (LA) e determinação da condição aeróbia. O treinamento foi realizado por 8 semanas, com reavaliações após 4 e 8 semanas de exercícios. Após o último TLM, os animais foram submetidos à eutanásia ( Figura 1 ).

Procedimentos experimentais

Dieta de ferro

A dieta utilizada na alimentação das fêmeas foi produzida a partir de ingredientes purificados, seguindo a composição das formulações AIN93-G. Os valores apresentados no AIN93-G correspondem às necessidades da dieta de roedores nas fases de crescimento, prenhez e lactação.()As dietas de restrição (4mg/kg) e suplementação (100mg/kg) de ferro foram realizadas por manipulação da mistura de minerais, de acordo com o percentual específico para aquela condição, ajustando a composição geral da mistura pelo veículo (sacarose), sem alterar a densidade calórica da dieta. A dieta de 40mg/kg foi usada no grupo de mães padrão e nos grupos de filhotes.

Amostras das dietas foram enviadas ao Instituto Adolfo Lutz, de São Paulo (SP), para verificar a concentração de ferro de cada dieta específica (padrão, restrição e suplementação).

Exercício

O treinamento de natação e o TLM foram aplicados com cargas controladas, sempre no mesmo horário (18h). Todos os procedimentos foram realizados em água mantida a 31±1°C e individualmente, com tanques de natação divididos por tubos cilíndricos de PVC de 30cm de diâmetro.

Adaptação à água

Os animais foram submetidos a 14 sessões de adaptação à água, sendo três em água com 15cm de profundidade. Nos dias subsequentes, ocorreram cinco sessões de adaptação para natação livre com 120cm de profundidade, iniciando com 2 minutos de exercício e incrementos de 2 minutos diários, até atingir 10 minutos de esforço. Em seguida, foram aplicadas seis sessões específicas de adaptação com diferentes cargas amarradas ao corpo do animal, em percentagens do peso corpóreo, com os tempos variando em função da intensidade aplicada. As sessões se destinavam apenas à adaptação ao meio líquido, ao estresse térmico, à manipulação e às cargas, as quais ficavam presas ao animal (dorso), não objetivando melhorar a condição física (treinamento).

Teste mínimo de lactato

Para a determinação dos parâmetros aeróbios e anaeróbios, foi adotado o protocolo TLM descrito por de Araujo et al.,()sendo aplicado em três momentos durante o período experimental: antes do programa de treinamento (animais com aproximadamente 84 dias de idade), visando identificar a intensidade individual do LA para a prescrição do treinamento (teste 1); após 4 semanas de treinamento (animais com aproximadamente 112 dias de idade), para acompanhar a evolução aeróbios e anaeróbios e ajustar as cargas de treinamento (teste 2) e após 8 semanas de treinamento (animais com aproximadamente 140 dias de idade), para identificar os efeitos do treinamento sobre os parâmetros aeróbios e anaeróbios analisados (teste 3).

Para o TLM e durante o treinamento, as cargas foram fixadas no dorso do animal, e a percentagens da carga foi calculada para o peso de cada animal.

O TLM consistiu em uma fase de indução de hiperlactatemia, seguida do protocolo de cargas incrementais. A fase de hiperlactatemia foi dividida em três partes consecutivas: 30 segundos de esforço de natação (carga de 13%); 30 segundos de intervalo de descanso e tempo de nado até a exaustão (TLim; carga de 13%). Após o TLim, foi feito repouso passivo, com duração de 9 minutos (para atingir o pico de lactato sanguíneo). Após 9 minutos, foi aplicado um protocolo de cargas incrementais, para determinar a intensidade em que foi observada a menor lactatemia, representando a maior intensidade de equilíbrio entre a produção e a retirada do lactato sanguíneo. O protocolo incremental foi realizado com o animal nadando com cargas de 4%, 4,5%, 5%, 5,5%, 6% e 7% de seu peso (com duração de 5 minutos para cada carga) ou até a exaustão.

Dessa forma, a concentração mínima de lactato foi utilizada como parâmetro individualizado da capacidade aeróbia e o tempo até a exaustão durante a fase de indução, como parâmetro da capacidade anaeróbia.

Foram retiradas amostras de sangue da ponta da cauda do animal (25μL por coleta), por meio de tubos capilares descartáveis e calibrados com heparina.

Posteriormente, o sangue extraído foi armazenado em tubos de Eppendorf com adição de 50μL de fluoreto de sódio a 1%. As concentrações de lactato foram determinadas usando o lactômetro YSI-2300 Yellow Spring, calibrado e operado de acordo com as especificações do fabricante.

O valor do equilíbrio entre a produção e a retirada de lactato foi utilizado para calcular a carga de treinamento (80% desse valor em relação ao peso corpóreo). As cargas foram ajustadas semanalmente.

Programa de treinamento

A intensidade individual de exercício correspondeu ao produto do peso corpóreo por 80% da intensidade obtida no LM, com volume de 60 minutos de natação por dia, seis vezes por semana.()As cargas somadas ao dorso foram reajustadas de acordo com a massa corpórea semanalmente. O exercício físico foi realizado no período escuro (correspondendo ao período diurno dos ratos).

Análise estatística

Os resultados foram analisados por meio do programa Statistica 7.0. O número médio de animais por mãe foi avaliado por análise de variância (Anova) simples, seguida de análise post-hoc do teste de Tukey. Para análise do lactato mínimo, TLim (do TLM) e do peso da prole, foi aplicada a Anova com medidas repetidas, seguida do teste de Tukey post-hoc. O nível de significância foi estabelecido como p<0,05, e os dados foram expressos como média±erro padrão.

RESULTADOS

Os resultados não apresentaram diferenças estatisticamente significativas para o número médio de animais por mãe (PFeSt: sete animais; PFeSu: dez animais; PFeR1: sete animais e PFeR2: nove animais). Todos os grupos de filhotes tiveram um padrão semelhante de ganho de peso corpóreo ao longo do experimento. Todos os grupos tiveram aumento significativo, em relação a eles próprios, a partir dos 84 dias de vida.

Os resultados do TLM aqui apresentados foram o TLim durante a fase de hiperlactatemia e a contração do lactato no momento do equilíbrio, entre a produção e a retirada do lactato no sangue (lactato mínimo).

O Grupo OFeR1 teve redução estatisticamente significativa do TLim dos testes 2 e 3 para o teste 1, assim como os Grupos OFeSu e OFeR2 do teste 3 para o teste 1 do Grupo OFeR1. Além disso, foi demonstrada tendência (p=0,06) de redução do tempo limite para o Grupo OFeSu no teste 3 em relação ao Grupo OFeSt no teste 1 ( Figura 2A ). Os resultados mostraram que o Grupo OFeR1 apresentou redução estatisticamente significativa do valor mínimo de lactato nos testes 2 e 3 em relação ao teste 1 ( Figura 2B ).

Figura 2

Resultados do teste de lactato mínimo. (A) medida, em segundos, do tempo de nado até a exaustão obtida por meio do teste de lactato mínimo em três momentos: início/basal (teste 1), após 4 semanas de treinamento (teste 2) e após 8 semanas de treinamento (teste 3). Análise de variância com medidas repetidas, pós-teste de Tukey. Tempo [F (6,52) = 20,1922; p<0,00001] grupo [F (6,52) = 1,7200; p<0,187469] interação [F (6,52) = 2,2092; p=0,056]. (B) concentração do lactato mínimo obtida do teste de lactato mínimo em três momentos: basal (teste 1), após 4 semanas de treinamento (teste 2) e após 8 semanas de treinamento (teste 3). Análise de variância com medidas repetidas, pós-teste de Tukey. Tempo [F (6,52) = 8,627; p<0,001] grupo [F (6,52) = 0,889; p=0,459668] interação [F (6,52) = 4,068; p<0,01]

Não foram encontradas diferenças estatísticas entre os grupos no momento do teste 1. Os demais grupos não apresentaram alterações significativas na concentração mínima de lactato e no TLim, após os testes 2 e 3 para o teste 1.

DISCUSSÃO

O uso de animais em pesquisas laboratoriais auxilia na investigação das condições de estresse observadas em humanos e possibilita o monitoramento de novas alterações decorrentes disso, como restrição de ferro e exercícios.

O estudo avaliou se diferentes concentrações de ferro na dieta durante a prenhez poderiam interferir no desempenho aeróbio e anaeróbio, medido por meio do TLM, da prole de ratas.

No TLM, nossos resultados mostraram redução na capacidade aeróbia e anaeróbia no Grupo OFeR1 ao longo de 8 semanas de treinamento. Uma possível hipótese para essas alterações seria a epigenética, quando há modificações na expressão do genoma, por meio de alterações químicas que ocorrem na molécula de DNA, que são causadas por fatores externos, como exercícios, dieta alimentar e estresse, e que podem ser herdadas durante a divisão celular.()

A literatura mostrou resultados notáveis de epigenética hereditária em modelos animais. Alguns estudos mostraram que uma alteração na dieta da mãe afeta o metabolismo e a expressão gênica da prole e, consequentemente, gera distúrbios metabólicos na vida adulta.(,)

Neste estudo, não foi realizada a expressão gênica e/ou do ferro sérico, mas a dieta produzida foi analisada, e se constatou que apresentava concentrações específicas para cada grupo.

Embora não tenham existido diferenças estatisticamente significativas no número médio de animais por mãe, as mães que receberam dieta com suplementação apresentaram maior número de filhotes em relação aos outros grupos. Porém, verificou-se que o peso dos animais ao longo do experimento permaneceu semelhante, sem apresentar alterações decorrentes da dieta da mãe.

As análises realizadas para o TLM demonstraram que o Grupo OFeR1 apresentou diminuição significativa dos valores de lactato no primeiro teste. As mães da prole do Grupo OFeR1 sofreram restrição de ferro antes e durante a prenhez, demonstrando possível relação entre dieta, epigenética e capacidade aeróbia. Porém, o Grupo OFeR2, no qual as mães receberam dieta restrita em ferro apenas durante a gestação, não obteve os mesmos resultados, sugerindo que o tempo de restrição da ingestão de ferro influenciou nas mudanças.

Estudos têm demonstrado que a reversibilidade das alterações do ferro no organismo depende da gravidade e da duração da DFe.(,,)Além disso, um estudo realizado em 2000 com ratas alimentadas com dieta deficiente em ferro durante a prenhez mostrou que os níveis de ferro no cérebro voltaram aos valores normais em 2 semanas de dieta padrão de ferro.()Outro estudo com DFe durante a prenhez mostrou que os níveis de ferro e monoamina na prole alimentada com dieta padrão após o desmame foram restaurados.()No entanto, mais estudos são necessários para compreender as diferentes consequências da restrição de ferro por períodos mais longos ou mais curtos.

Uma das propriedades do ferro é a de ser ergogênico, ou seja, o ferro pode auxiliar na formação de hemoglobina e melhorar o transporte de oxigênio no sangue e nos músculos, além de ajudar na produção de energia, por meio de fosforilação oxidativa.()Os grupos OFeSt e OFeSu não apresentaram diferenças significativas nos valores dos testes, de forma que conseguiram manter a regularidade nos resultados em todos os testes do TLM, porém sem melhora. Esses resultados abrem espaço para a hipótese de que uma dieta regular com ferro ou uma suplementação durante a gestação podem permitir que a prole mantenha constância em seus resultados de capacidade aeróbia, podendo apresentar regularidade em seu treinamento.

O TLim foi estabelecido para verificar o desempenho anaeróbio da prole, e o Grupo OFeR1 apresentou redução significativa em relação a ele próprio quando comparado ao primeiro teste. A restrição de ferro desse grupo não permitiu que ele progredisse ou mantivesse seu desempenho ao longo dos testes. De acordo com alguns estudos, quando a hemoglobina e o ferro não estão em níveis normais, eles podem levar a uma piora significativa do desempenho anaeróbio.(,)Nossos resultados mostraram redução no TLim dos grupos OFeSu, OFeR2 e OFeR1 no teste 3, em comparação com o grupo OFeR1, no teste 1. No entanto, os grupos OFeSt, OFeSu e OFeR2 mantiveram resultados semelhantes ao longo do experimento (teste 1, teste 2 e teste 3) em relação a eles mesmos.

Há grupos de pesquisa em todo o mundo que se dedicam a compreender os efeitos das mudanças epigenéticas durante a gravidez e como os hábitos de vida da prole podem interagir com essas mudanças. Estudos demonstraram que a restrição de ferro causa alterações epigenéticas no hipocampo de camundongos e nas proteínas mitocondriais.(,)Nesse sentido, acreditamos que a restrição e a suplementação durante a gestação foram suficientes para causar alterações no metabolismo do ferro, devido aos resultados demonstrados na prole.

CONCLUSÃO

Os resultados obtidos no treinamento de natação dos animais mostraram que a prole de mães que receberam dieta restrita em ferro, antes e durante a gestação, apresentou diminuição acentuada em sua capacidade aeróbia e no indicador de metabolismo anaeróbio, por meio do teste de lactato mínimo, ao passo que os demais grupos (prole de mães que receberam dieta padrão, prole de mães que receberam dieta de suplementação de ferro durante a prenhez e prole de mães que receberam dieta com restrição de ferro apenas na gravidez) não tiveram alteração no desempenho durante o experimento. No entanto, mais estudos são necessários sobre o assunto, pois pouco se sabe sobre as consequências da restrição de ferro na epigenética hereditária sobre o desempenho físico.