[Effect of endoplasmic reticulum stress induced by all-trans retinoic acid on apoptosis of FLT3-ITD mutated leukemia cells by activating autophagy in FLT3-ITD mutated protein].

Objective: Endoplasmic reticulum stress(ERS)was used as the research emphasis to further investigate the mechanisms of apoptosis of FLT3-ITD-mutated leukemia cells and decreased expression of FLT3-ITD mutated protein induced by all-trans retinoic acid(ATRA).
Methods: FLT3-ITD-mutated leukemia cell lines(MV4-11 and MOLM13)were treated with ATRA. Flow cytometry was conducted to assess cell apoptosis. Real-time fluorescent quantitative PCR(RT-qPCR)and Western blot were used to detect the expression of ERS-related and autophagy-related genes and protein, respectively.
Results: A low-dose ATRA further increased FLT3-ITD cells and ERS levels. ATRA acted on the ERS-related PERK/eif2ɑ signaling pathway and continued to increase the ERS of FLT3-ITD cells, resulting in an upregulation of apoptotic gene CHOP expression. After the treatment with ATRA, FLT3-ITD protein in FLT3-ITD cells was decreased. Of the two main ERS-related protein degradation pathways, ER-associated degradation(ERAD)and ER-activated autophagy(ERAA), the expression of ERAD-related protein ATF6 in FLT3-ITD cells was not significantly changed on ATRA, whereas the expression of ERAA-related proteins Atg7 and Atg5 were significantly increased. Conclusions: ATRA further raises the ERS level of FLT3-ITD cells continuously by activating the ERS-related PERK/eif2ɑ signal pathway and induces FLT3-ITD protein autophagy degradation through ERAA pathway, which induces apoptosis of FLT3-ITD-mutated leukemia cells. These results provide preliminary evidence on the use of ATRA in the treatment of refractory leukemia with FLT3-ITD.

FMS样酪氨酸激酶3（FMS-like tyrosine 3，FLT3）属于Ⅲ型酪氨酸受体，在急性髓系白血病（AML）患者中高表达且部分发生基因突变[1]。其中FLT3内部串联重复（FLT3-ITD）突变最常见[2]，具有更高的致癌潜能[3]，导致疗效差和易复发[4],是难治性AML的独立高危因素[5]–[6]。靶向降低FLT3-ITD表达是治疗该类难治性白血病的关键环节。

内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）是指细胞受应激事件影响时，蛋白的翻译、转运、加工和分泌出现异常，错误折叠蛋白在内质网蓄积，无法向高尔基体和细胞膜转运，导致内质网压力升高，其形态和功能发生改变。ERS激活的错误折叠蛋白降解主要有内质网关联的降解（ER-associated degradation，ERAD）和内质网激活的自噬（ER-activated autophagy，ERAA）途径[7]–[9]，前者与ATF6和IRE1ɑ通路介导的蛋白酶体途径相关，后者与PERK和（或）IRE1ɑ通路或钙离子介导的巨自噬途径相关[7],[10]。当ERS持续且无法缓解时，细胞发生凋亡[11]。

研究表明，肿瘤细胞的ERS水平较正常细胞高，有利于维持其生存[12]–[14]。FLT3蛋白发生ITD突变后，自发形成同源二聚体，蓄积在内质网腔内[15]，FLT3-ITD突变阳性AML细胞的ERS水平可能较高。本研究组前期研究显示，全反式维甲酸（ATRA）可诱导FLT3-ITD蛋白表达降低并促进白血病细胞凋亡[16]，但机制未明。有报道显示，ATRA能提高急性早幼粒细胞白血病（APL）细胞的ERS水平[17]。据此推测ATRA增强FLT3-ITD突变阳性AML细胞的ERS，是导致FLT3-ITD蛋白表达降低和诱导FLT3-ITD突变阳性白血病细胞凋亡的重要机制之一。本研究以FLT3-ITD突变阳性AML细胞株MV4-11和MOLM13为模型，探究ATRA诱导FLT3-ITD蛋白表达降低、促进FLT3-ITD突变白血病细胞凋亡是否与ERS相关，为FLT3-ITD突变AML的治疗提供新思路。

材料与方法

1. 细胞株与细胞培养：实验用的细胞株均为人类白血病细胞株，MV4-11和MOLM13为FLT3-ITD突变阳性AML细胞株，RS4-11、THP1和HL-60为FLT3-ITD突变阴性细胞株。其中MOLM13购自德国DSMZ细胞库，其他细胞株购自美国模式培养物研究所（ATCC）或中国医学科学院血液学研究所。MV4-11细胞株用含10％胎牛血清的IMDM培养液，其他细胞株用含10％胎牛血清的RPMI 1640培养液，于含5％的CO2、37°C培养箱中培养，根据细胞增殖情况定期更换培养液。

2. 主要试剂：ATRA（美国Sigma-Aldrich公司产品，货号R2625）溶于DMSO保存。4-PBA、GSK2606414和Guanabenz购自索拉宝公司，溶于DMSO保存，DMSO在培养基的终浓度<0.1％。PERK、p-PERK、BiP、eif2ɑ、p-eif2ɑ、Atg5和Atg7抗体购自美国Cell Signaling Technology公司。

3. 凋亡检测：用AnnexinⅤ-FITC/PI凋亡检测试剂盒［东仁化学科技（上海）有限公司产品］检测细胞凋亡。取对数生长期的细胞进行细胞计数，用培养基调整细胞密度为1×105/L，接种于12孔板内，予不同浓度的ATRA处理。处理后避光培养24、48及72 h，分别收集不同培养时间的细胞离心（1000 r/min，10 min）。弃上清，4°C预冷的PBS洗涤细胞2次后用结合缓冲液制成细胞悬液。依次加入AnnexinⅤ-FITC和PI各5 µl，吹打混匀，室温下避光孵育15 min。在2 h内用流式细胞仪完成各组细胞凋亡率的检测。

4. 实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测基因表达水平：用TRIzol法提取总RNA。将细胞离心后弃上清，裂解于TRIzol试剂，氯仿将RNA分离后用75％乙醇和无水乙醇各洗涤2次。真空抽干乙醇溶液，将RNA溶解于DEPC水，检测RNA的浓度和纯度。去除基因组DNA以及cDNA的合成采用Promage RR047a试剂盒。RT-qPCR以cDNA为模板扩增目的基因和内参基因。引物：GAPDH上游引物：5′-GCCAACACAGTGCTGTCTGG-3′；下游引物：5′-GCTCAGGAGGAGCAATGATCTTG-3′。BiP上游引物：5′-CTCCTGAAGGGGAACGTCTG-3′；下游引物：5′-CCACCTTGAACGGCAAGAAC-3′。CHOP上游引物：5′-TCCAGCCACTCCCCATTATC-3′；下游引物：5′-GCAGGGTCAAGAGTGGTGAA-3′。XBP1-s上游引物：5′-CTGAGTCCGCAGCAGGTG-3′；下游引物：5′-AGGGAGGCTGGTAAGGAACT-3′。XBP1-u上游引物：5′-CAGACTACGTGCACCTCTGC-3′；下游引物：5′-GGGTCCTTCTGGGTAGACCT-3′。

5. Western blot法检测蛋白表达水平：ATRA避光处理细胞24、48和72 h后，分别收集、洗涤和裂解细胞，提取细胞总蛋白及胞质蛋白进行定量和热变性处理。根据目的蛋白大小配制不同浓度的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶进行电泳（SDS-PAGE），根据蛋白大小选择合适的转膜条件将蛋白转移到硝酸纤维素（NC）膜上，加入一抗在4°C过夜孵育印迹，加入辣根过氧化物酶（HRP）耦联的二抗孵育1 h，用增强型化学发光法（ECL）检测确定目的蛋白的表达强弱，GAPDH或β-actin作为内参，确保每个泳道的总蛋白及胞质蛋白上样量一致。

6. 统计学处理：实验数据均来自于3次或3次以上结果相似的独立实验，计量资料数据采用均数±标准差表示，采用SPSS 22.0软件进行数据分析，采用直方图和Kolmogorov-Smirnov检验正态性，对每组数据进行方差齐性检验，两独立样本均数比较采用Student's t检验，多个样本均数比较采用方差分析，P<0.05为差异有统计学意义，统计图采用Graphpad Prism 8.0进行绘制。

结果

1. 低剂量ATRA对FLT3-ITD突变阳性AML细胞凋亡的影响：不同浓度的ATRA（0、0.5和1.0 µmol/L）作用于MV4-11、MOLM13和RS4-11细胞48和72 h，流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果显示，ATRA对MV4-11和MOLM13细胞的促凋亡作用呈现明显的时间依赖性和剂量依赖性，其中低剂量ATRA（0.5 µmol/L）在72 h已有明显的促凋亡作用（图1A、B）。而ATRA对RS4-11细胞的促凋亡作用较弱（图1C）。提示ATRA选择性地杀伤FLT3-ITD突变阳性AML细胞。

图1

全反式维甲酸（ATRA）诱导FLT3-ITD突变阳性和阴性白血病细胞株凋亡的比较（实验重复3次）

A、B分别为FLT3-ITD突变阳性细胞MV4-11和MOLM13；C为FLT3-ITD突变阴性细胞RS4-11。1：空白对照组；2：0.5 µmol/L ATRA作用组；3：1.0 µmol/L ATRA作用组。与空白对照组比较，aP<0.05，bP<0.01，cP<0.001

2. ATRA对FLT3-ITD突变阳性AML细胞ERS水平的影响：BiP和XBP1-s上调是ERS的生物学标志。将不同浓度的ATRA（0、0.5和1.0 µmol/L）作用于MV4-11、MOLM13、RS4-11和HL-60细胞24、48及72 h，RT-qPCR检测ERS标志基因BiP和XBP1-s的表达。结果显示，与RS4-11和HL-60细胞比较，MV4-11和MOLM13细胞在ATRA作用下BiP基因的表达明显升高，MOLM13细胞XBP1-s基因的表达亦明显升高。与空白对照组相比，差异具有统计学意义（P值均<0.05），其中0.5 µmol/L ATRA对ERS水平上调作用最明显（表1）。提示低剂量ATRA可显著上调FLT3-ITD突变阳性AML细胞的ERS水平。

表1

全反式维甲酸（ATRA）对FLT3-ITD突变阳性和阴性白血病细胞株细胞内质网应激水平的影响（±s，n＝3）

组别	MV4-11细胞			MOLM13细胞
	24 h	48 h	72 h	24 h	48 h	72 h
BiP基因
空白对照组	1.00±0.15	1.00±0.08	1.00±0.08	1.00±0.09	1.00±0.06	1.00±0.05
0.5 µmol/LATRA组	1.74±0.15b	2.33±0.13c	2.50±0.11c	1.49±0.05b	2.24±0.09c	2.41±0.12c
1.0 µmol/LATRA组	1.59±0.20a	1.83±0.30b	2.00±0.04c	1.59±0.05c	2.32±0.11c	3.19±0.05c
XBP1-s基因
空白对照组	1.00±0.08	1.00±0.12	1.00±0.04	0.98±0.06	1.07±0.11	1.10±0.11
0.5 µmol/LATRA组	0.81±0.07	1.12±0.14	0.87±0.04	1.22±0.08a	2.22±0.26b	1.74±0.14b
1.0 µmol/LATRA组	0.72±0.02	1.01±0.15	0.61±0.02	1.41±0.07b	2.36±0.28b	2.34±0.21c

注：表中的数据为BiP和XBP1-s基因的相对表达量，内参基因为GAPDH。与空白对照组比较，aP<0.05，bP<0.005，cP<0.001

3. ATRA对FLT3-ITD突变阳性AML细胞的PERK/eif2ɑ信号通路的影响：为进一步明确低剂量ATRA调控FLT3-ITD突变阳性细胞ERS的信号通路，我们检测了参与持续ERS最重要的PERK/eif2ɑ通路。Western blot检测结果显示，0.5 µmol/L ATRA作用于细胞72 h后，MV4-11和MOLM13细胞的PERK磷酸化蛋白表达增加，RS4-11和THP1细胞的PERK磷酸化蛋白表达无明显变化（图2A）；另外，ATRA处理后MV4-11和MOLM13细胞的BiP蛋白表达上升，eif2ɑ蛋白磷酸化水平降低（图2B）。

图2

全反式维甲酸（ATRA）对FLT3-ITD突变阳性白血病细胞的PERK/eif2ɑ信号通路的影响

A：ATRA作用于FLT3-ITD突变阳性和阴性白血病细胞株后PERK及其磷酸化蛋白的表达（1：空白对照组；2：ATRA作用组）；B：ATRA作用于FLT3-ITD突变阳性细胞株后BiP和eif2ɑ及其磷酸化蛋白的表达变化（1：空白对照组；2：ATRA作用组）；C：干预eif2ɑ蛋白的磷酸化后ATRA处理MV4-11细胞72 h对细胞凋亡率的影响（1：空白对照组；2：ATRA作用组。与单用ATRA组比较，a P<0.05，b P<0.001)；D：ATRA作用于MV4-11细胞后CHOP基因的表达情况（1：空白对照组；2：0.5 µmol/L ATRA作用组；3：1.0 µmol/L ATRA作用组。与空白对照组比较，a P<0.005，bP<0.001)

进一步使用GSK2606414（简称GSK，抑制eif2ɑ磷酸化）和Guanabenz（维持eif2ɑ磷酸化）分别干预eif2ɑ的磷酸化。结果发现，将ATRA（0.5 µmol/L）与GSK（1.0 µmol/L）共处理MV4-11细胞72 h，其细胞凋亡率较单用ATRA时升高；而ATRA（0.5 µmol/L）与Guanabenz（17 µmol/L）共处理MV4-11细胞72 h，其细胞凋亡率较单用ATRA时下降。采用单因素方差分析不同处理组MV4-11细胞凋亡率，其差异具有统计学意义（F＝1656，P<0.001）。以单用ATRA组为对照，采用Dunnett's法两两比较，结果差异均具有统计学意义（P值均<0.05）（图2C）。表明维持eif2ɑ磷酸化可减弱ATRA的作用，ATRA通过抑制eif2ɑ磷酸化作用于FLT3-ITD突变白血病细胞。RT-qPCR检测PERK通路下游与凋亡相关的靶基因CHOP，结果发现ATRA处理后的MV4-11细胞CHOP基因表达明显上调（图2D）（P<0.05）。

4. ATRA通过提高ERS水平自噬降解FLT3-ITD蛋白：4-苯基丁酸钠盐（4-PBA）是常用的ERS抑制剂。为探究ERS、ATRA和FLT3-ITD蛋白表达三者的关系，将MV4-11细胞分为空白对照组、ATRA组和ATRA+4-PBA组，ARTA和4-PBA的剂量分别为0.5 µmol/L和2.5 mmol/L，细胞处理后避光培养72 h。Western blot检测结果显示：①与空白对照组比较，ATRA组的FLT3-ITD蛋白表达水平明显降低，而ATRA+ 4-PBA组的FLT3-ITD蛋白表达水平高于ATRA组，但较空白对照组低（图3A）；②ATRA处理后，各组ERAD途径相关的ATF6蛋白表达量无明显变化（图3B）。另外，进一步检测ATRA处理后MV4-11和MOLM13细胞的ERAA途径相关的自噬标志物Atg5和Atg7的蛋白表达情况，Western blot结果显示，与空白对照组相比，ATRA组的Atg5和Atg7蛋白表达增高（图3C）。提示ATRA通过ERAA途径诱导FLT3-ITD蛋白自噬降解。

图3

全反式维甲酸（ATRA）通过提高内质网应激（ERS）水平诱导FLT3-ITD突变蛋白自噬降解

A：ERS水平对ATRA降低MV4-11细胞FLT3-ITD蛋白表达作用的影响（1：空白对照组；2：ATRA作用组；3：ATRA+4-PBA作用组）；B：ATRA对FLT3-ITD突变阳性AML细胞ATF6蛋白表达的影响（1：空白对照组；2：ATRA作用组）；C：ATRA对FLT3-ITD突变阳性MV4-11细胞自噬相关蛋白Atg5和Atg7表达的影响（1：空白对照组；2：ATRA作用48 h组；3：ATRA作用72 h组）

讨论

本研究在前期研究[16]的基础上，从ERS的角度深入探讨ATRA通过降低FLT3-ITD蛋白表达促进FLT3-ITD突变阳性白血病细胞凋亡的机制。结果显示，ATRA通过激活PERK/eif2ɑ信号通路持续上调FLT3-ITD突变阳性细胞的ERS水平，通过ERAA途径诱导FLT3-ITD突变蛋白自噬降解，最终促进白血病细胞凋亡。

与正常细胞比较，多数肿瘤细胞ERS水平升高[12]。研究表明，蛋白发生突变后，构象不稳定，在内质网中容易形成低聚物或聚合物，蓄积在内质网造成ERS[7]。Chunaram等[15]研究FLT3突变蛋白在细胞的分布发现，FLT3发生ITD突变后，可自发形成同源二聚体，并蓄积在内质网腔内，FLT3-ITD突变阳性AML细胞的ERS水平可能较高。

临床上可利用肿瘤细胞ERS水平较高这一特点，用于肿瘤的治疗。研究显示，维莫非尼（vemurafenib）可通过提高ERS水平诱导BRAFV600E基因突变的黑色素瘤细胞凋亡[18]。ATRA常用于APL的治疗[19]，其主要机制是靶向融合基因PML-RARɑ中的RARɑ部分，降解PML-RARɑ蛋白，恢复野生型PML和RARɑ基因的功能，诱导APL细胞分化成熟[20]。近年研究还发现，ATRA能提高APL细胞的ERS[17]。

ERS过程中主要激活非折叠蛋白反应（unfolding protein respone, UPR），包括PRRK、ATF6和IRE1ɑ通路，通过抑制翻译、协助蛋白正确折叠和激活蛋白发生泛素化和自噬降解，缓解ERS。细胞在非ERS时，PERK、ATF6和IRE1ɑ与免疫球蛋白结合分子（BIP/Grp78）结合，维持信号通路的非活化；ERS时UPR信号通路被激活，BIP与PERK、ATF6和IRE1ɑ分离且表达上调，XBP1-s表达增加，PERK和ATF6通路以及XBP1-s可进一步促进BIP的表达[21]–[22]。因此BIP和XBP1-s常作为评估ERS水平的重要因子。本研究通过实验检测ATRA处理后白血病细胞BIP和XBP1-s的mRNA相对表达量变化情况，结果发现ATRA可上调FLT3-ITD突变阳性的白血病细胞ERS，但对FLT3-ITD突变阴性的白血病细胞ERS无明显上调作用。证明ATRA可选择性地上调FLT3-ITD突变阳性的AML细胞系的ERS水平。

为此，我们提出一个问题：ATRA调控FLT3-ITD白血病细胞ERS的信号通路是什么？有研究发现当细胞处于持续ERS时，PERK/eif2α通路起关键作用[23]。当PERK磷酸化激活后，eif2ɑ发生磷酸化改变，主要作用有：①抑制细胞大部分蛋白的翻译速率，缓和ERS；②随后恢复ATF4蛋白表达，激活GADD34表达，eif2ɑ进入去磷酸化状态，恢复胞内蛋白合成[24]–[25]，该负反馈机制在ERS缓解时起恢复细胞正常活动的作用。当内质网压力持续且无法缓解时，PERK/eif2ɑ持续激活[23]，下游凋亡相关的靶基因CHOP大量表达，细胞稳态失衡，发生凋亡[11]。本研究显示，ATRA选择性地增强FLT3-ITD突变阳性AML细胞的PERK磷酸化，BiP表达上调，提高ERS水平。另一方面，ATRA抑制eif2ɑ磷酸化，使得细胞内蛋白继续大量合成，ERS持续存在且难以缓解。我们在研究中还发现，ATRA使FLT3-ITD AML细胞的PERK通路下游促凋亡基因CHOP基因表达明显上调，提示其诱导的细胞凋亡与ERS水平持续升高有关。

本课题组前期研究显示，ATRA可降低FLT3-ITD突变蛋白表达[16]，但机制有待进一步阐明。有研究报道，ERS可激活细胞内蛋白包括错误蛋白的降解，主要有ERAD和ERAA途径，前者与ATF6和IRE1ɑ通路介导的蛋白酶体途径相关，后者与PERK和（或）IRE1ɑ通路或钙离子介导的巨自噬途径相关[7]。本研究发现，ATRA可降低FLT3-ITD蛋白的表达，其作用在高水平的ERS细胞内环境下更为明显，但主要通过ERAA通路相关的巨自噬而不是ERAD相关的泛素化-蛋白酶体途径降解。有研究表明[7]，蛋白发生突变后，构象不稳定，在内质网中容易形成低聚物或聚合物，蓄积在内质网内难以发生泛素化，较难通过ERAD途径（蛋白酶体相关）降解。FLT3-ITD突变蛋白与野生型FLT3蛋白不同，会自发形成同源二聚体[15]，可解释FLT3-ITD主要不是通过ERAD途径降解的现象。ERAA是与PERK通路相关的巨自噬途径[7]，本研究显示，ATRA促进PERK磷酸化，激活PERK通路，并使自噬标志蛋白Atg5和Atg7[26]表达上升，而与ERAD相关的ATF6蛋白无明显变化，提示ATRA降低FLT3-ITD蛋白的表达，与其上调的ERS水平相关，且主要通过激活ERAA途径自噬降解FLT3-ITD。

综上，ATRA可选择性地上调FLT3-ITD突变阳性AML细胞的ERS水平，导致FLT3-ITD自噬降解，最终促进白血病细胞凋亡。在ERS状态下，ATRA的重要作用靶点是ERS的关键通路——PERK/eif2ɑ通路，通过促进PERK磷酸化激活，抑制eif2ɑ磷酸化，使FLT3-ITD突变阳性AML细胞的ERS持续处于高水平，激活ERAA途径自噬降解FLT3-ITD蛋白，最终导致白血病细胞凋亡。本研究初步揭示了ATRA通过调控ERS诱导FLT3-ITD蛋白自噬降解促进白血病细胞凋亡的分子机制，为今后将ATRA用于临床治疗难治性FLT3-ITD突变阳性AML和改善预后提供初步实验依据。