[Research on the effect of PD-L1 overexpression on CLL-1 CAR-T anti-acute myeloid leukemia].

Objective: To investigate the effects of programmed death receptor ligand 1(PD-L1)on CLL-1 CAR-T against acute myeloid leukemia(AML).
Methods: In this experiment, the PD-L1 expression vector was constructed, and then the lentivirus vector was packaged by three-plasmid packaging system. THP-1 monoclonal cell lines stably expressing PD-L1 were set up. The CLL-1 CAR-T was developed by our team, as the effector cell for co-culture with the THP-1 or THP1-PDL1 cell lines, respectively. Then, the LDH was tested using the kit, the supernatant cytokine was detected by CBA, and the CLL-1 CAR-T cell proliferation was demonstrated by flow cytometry(FCM)with CSFE labeled.
Results: ①The PD-L1 lentivirus vector was successfully constructed, and monoclonal cell lines of THP-1 with stable PD-L1 was set up and verified by FCM and PCR. ②The overexpression of PD-L1 inhibited CLL-1 CAR-T's ability to lyse THP-1 cells(E∶F ratio 10∶1); the killing efficiency of CLL-1 CAR-T on THP1-PDL1 cells was lower than that of THP-1 cells[(15.70±9.90)% vs(51.95 ± 2.52)%, P<0.05]. ③The overexpression of PD-L1 decrease the release of cytokine[THP1-PDL1 group vs THP-1 group: IFN-γ(115.66±3.13)pg/ml vs(1708.16 ± 26.76)pg/ml, P<0.05; IL-6(17.37±0.72)pg/ml vs(124.92±4.26)pg/ml, P<0.05; IL-10(5.69±0.13)pg/ml vs(124.12±3.02)pg/ml, P<0.05]. Additionally, the proliferation of CLL-1 CAR-T was also inhibited.
Conclusion: Monoclonal cell lines of THP-1 with stable PD-L1 expression were successfully constructed, and the adverse effect of PD-L1 overexpression on CLL-1 CAR-T anti-AML was confirmed, which provided a theoretical basis for the regulation of CLL-1CAR-T through the PD-1/PD-L1 pathway.

急性髓系白血病（AML）是最常见类型白血病，多发于成年人，约占急性白血病的70％[1]–[4]。CAR-T细胞治疗技术作为一种新兴的过继性免疫治疗方法，在复发难治B细胞肿瘤治疗中取得了瞩目成绩。而在AML领域，进展相对缓慢。目前抗AML CAR-T细胞靶抗原主要包括CD123、CD33、叶酸受体等6类抗原[5]–[6]。但CD33 CAR-T细胞等有效性、安全性有待提高。我们前期研究发现，AML患者体内存在T细胞高表达PD-1、TIM3及分泌IFN-γ能力下降等免疫耗竭现象[7]，并且当T细胞进入骨髓环境中，耗竭比外周血中更严重[8]；并且研究显示，AML患者体内白血病细胞表面存在程序性死亡受体配体1（PD-L1）高表达现象[9]。虽然经过基因工程改造，但理论上CAR-T细胞进入体内，尤其进入AML细胞最多的骨髓环境中也会出现免疫耗竭现象。

CLL-1抗原在多数组织及正常造血干细胞不表达，而在白血病干细胞和白血病细胞上相对特异性高表达，被认为是较有潜力的治疗AML的靶标[10]，本课题组前期制备了三代CLL-1 CAR-T细胞（CD28+OX40）。本研究在构建稳定表达PD-L1的THP-1单克隆细胞株基础上，探讨了AML细胞中过表达PD-L1对CLL-1 CAR-T细胞功能的影响，为研究PD-1/PD-L1通路对CLL-1 CAR-T细胞抗AML作用的影响提供一定的理论探索。

材料与方法

1. 主要试剂和耗材：细胞培养液（RPMI 1640、DMEM、IMDM）、CD3/CD28磁珠、Penicillin-streptomycin、Trypsin-EDTA均购自美国Gibco公司；无缝克隆试剂盒、SunBio Trans-EZ购于上海生博公司；Taq酶、dNTP、PrimeSTAR、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、DH5α感受态细胞和逆转录试剂盒购于日本TaKaRa公司；XbaⅠ、EcoRⅠ-HF限制性内切酶购于美国New England BioLabs公司；质粒提取试剂盒购自美国Promega公司；基因测序由美吉生物公司测定；引物由上海瑞捷生物公司合成；ABsoluteqPCR Seals、96-WELL ABgene PCR Plate、7500 Real Time PCR System购于美国Thermo公司；FACS Calilbur购于美国BD公司；所有流式抗体购于美国Biolegend公司；pCMV-dR8.9、pCMV-VSV-G购自美国Addgene公司；THP-1细胞系购于美国模式培养物研究所（American Type Culture Collection,ATCC），载体PMT197购于上海世翱公司；DNA提取试剂盒购于Generay公司；ChamQ SYBR qPCR Master Mix购于Vazyme公司。

2. 细胞培养：293T细胞培养于DMEM（含10％FBS）培养液中；THP-1细胞培养于RPMI 1640（含10％FBS）培养液中；人T细胞、CLL-1 CAR-T细胞培养于含5％FBS、100 IU/ml rhIL-2和与T细胞等量的CD3/CD28磁珠的淋巴细胞培养液中。

3. 载体构建、PCR扩增目的基因：在NCBI中检索获取PD-L1的基因编码序列，合成PD-L1片段a。用XhaⅠ和EcoRⅠ-HF酶切PMT197，回收8924 bp线性载体片段。为获得目的基因，设计1对引物，上游引物：5′-CATAGAAGATTCTAGAGCCACCATGAGGATATTTGCTGTCTTTATATTC-3′；下游引物：5′-CATTCCACAGGAATTCTTACGTCTCCTCCAAATGTGTATC-3′。PCR体系共50 µl：dNTP（2.5 mmol/L）各4 µl，上下游引物（10 µmol/L）各1 µl，Template 1 µl，PrimeSTAR 0.5 µl，5×缓冲液（含Mg2+）10 µl，H2O 32.5 µl。反应条件：98°C预变性3 min，后进行30个循环：98°C变性10 s，55°C退火15 s，72°C延伸60 s。30个循环结束后72°C延伸10 min，将产物于4°C保存。

取PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳（15 g/L），观察是否出现相应条带。将与预计大小相符的目的条带切胶、回收、纯化。PCR上游引物：5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′；下游引物：5′-GCTGACTAATTGAGATGCATGCTT-3′。

4. 目的基因同源重组及转化：使用无缝克隆试剂盒通过PCR将产物a和酶切获得的线性载体以物质的量比2∶1重组，获得重组PD-L1表达载体pse2353。然后取感受态细胞，取10 µl连接液加入混匀，冰浴30 min。42°C水浴热激90 s，冰浴3 min，然后每管加LB培养液900 µl，37°C摇床振荡1 h，LB琼脂平板涂菌（含表达载体相应抗生素），倒置，37°C培养16 h。挑取转化子，10 µl LB培养液重悬，取1 µl菌落PCR鉴定，证实正确后进行接种，抽提质粒，测序正确后扩菌，提质粒，保存备用。

5. 慢病毒包装：37°C、5％CO2培养箱中培养调整293T细胞的状态，融合度大约为80％时进行转染。用三质粒系统包装病毒。取2支无菌离心管，1支向其中依次加入100 µg pse2353载体质粒、65 µg包装质粒pCMV-dR8.9、35 µg包膜质粒pCMV-VSV-G，用Opti-MEM培养基补至5 ml。另1支向其中加入Trans-EZ溶液500 µl、Opti-MEM培养基450 µl。混匀后将Trans-EZ稀释液加入质粒管中混匀。室温孵育20 min，DNA与Trans-EZ反应，形成转染复合体。加入293T细胞培养皿培养48 h，收集上清、浓缩纯化、获得病毒颗粒，测定滴度。EP管分装，−80°C冰箱保存。

6. THP1-PDL1单克隆细胞株筛选：收集对数生长期的THP-1细胞，加入含10％FBS的RPMI 1640培养基。按照MOI＝20，每孔加入1 ml慢病毒载体进行转导，嘌呤霉素浓度为0、0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0、5.0、10.0 µg/ml，探索合适的筛选细胞药物浓度。用筛选培养基重悬转导后的THP-1细胞，摇匀，5％CO2、37°C培养箱中培养。每2 d更换培养基，培养6 d。收集嘌呤霉素筛选后的细胞至离心管离心。用单克隆培养基（含20％FBS的RPMI 1640培养基）重悬，计数。细胞密度调至5个/ml，96孔板按每孔200 µl细胞悬液铺板，置于5％CO2、37°C培养箱培养。显微镜下观察各孔细胞增殖状况，挑出单个细胞的孔并标记，扩大培养，并鉴定稳定株构建效果。

7. 流式细胞术检测THP-1表面抗原表达：每管收集约5×105个细胞，1500 r/min离心3 min，重复1次；每管加入100 µl PBS重悬，再加入1 µl鼠抗PD-L1、CLL-1抗体，室温、避光孵育20 min；1500 r/min离心3 min，重复1次，加入200 µl PBS重悬，上机，分别检测THP-1、THP1-PDL1细胞表面PD-L1、CLL-1抗原表达水平。

8. 荧光定量PCR（qPCR）检测PD-L1表达：使用DNA提取试剂盒提取待测细胞中DNA，然后使用ChamQ SYBR qPCR Master Mix试剂盒合成cDNA，qPCR法检测THP1-PDL1和THP1细胞的PD-L1 DNA。将待测样品CT值代入标准曲线中，得到待测品种WPRE和GAPDH拷贝数。单个细胞中的PD-L1拷贝数（copies/cell）＝WPRE拷贝数/GAPDH拷贝数×2。反应体系：95°C预变性5 min，95°C变性5 s，60°C退火、延伸34 s，共40个循环。WPER上游引物序列：5′-TGCACTGTGTTTGCTGACGCAA-3′；下游引物序列：5′-ATGAGTTCCGCCGTGGCAATA-3′。GAPDH上游引物序列：5′-GGACAGGACCATATTGAGGGACA-3′；下游引物序列：5′-AGGAGTGAGTGGAAGACAGAATGGA-3′。

9. PD-L1过表达对CAR-T细胞裂解白血病细胞能力和CAR-T细胞增殖的影响：以CLL-1 CAR-T细胞为效应细胞，以THP1-PDL1细胞为阳性靶细胞，THP-1细胞为对照组。将上述细胞室温、1500 r/min离心5 min，PBS洗涤3次，1200 r/min离心5 min；分别用2 ml培养基（RPMI 1640+4％FBS）重悬细胞并计数；依据预实验结果，将计数好的细胞用培养基调整细胞密度，效应细胞密度为2×106/ml，靶细胞密度为2×105/ml（效靶比为10∶1）。效靶细胞共培养16 h。取上清，采用LDH试剂盒检测CLL-1 CAR-T细胞杀伤细胞能力。同时通过CFSE染色，采用流式细胞术检测共孵育前及孵育后1、3、5 d CLL-1 CAR-T细胞的增殖能力。

10. 统计学处理：用SPSS 17.0软件进行统计分析，计量资料数据采用均数±标准差表示，两样本均数比较采用t检验，非正态总体资料采用Wilcoxon秩和检验。P<0.05为差异有统计 学意义。

结果

1. 目的基因扩增及载体构建：PCR扩增获得产物a，电泳可见条带大小约为911 bp，与理论值一致。然后进行切胶、凝胶回收纯化试剂盒回收基因片段（图1）。

图1

PD-L1 PCR片段琼脂糖凝胶电泳结果

M：DNA Marker；1：PD-L1

2. 重组载体构建：用XhaⅠ和EcoRⅠ-HF酶切PMT197（图2A），12 g/L琼脂糖凝胶电泳，在8924 bp处可见条带b，为骨架载体，与理论值相符（图2B）。将a和b重组，得到重组慢病毒载体pse2353（图2C），然后进行转化，挑取阳性菌落，并经菌落PCR鉴定正确，得到大小为1251 bp条带（图2D）。取阳性菌落接种，并进行基因测序，经测序证实序列正确，提示重组的慢病毒载体质粒pse2353构建成功。

图2

重组慢病毒载体质粒pse2353构建

A：工具载体PMT197图谱；B：工具载体酶切后获得骨架载体的电泳条带（M：DNA Marker；b：骨架载体）；C：重组慢病毒载体pse2353示意图；D：pse2353转化子阳性菌落PCR产物电泳（M：DNA Marker；1～4为4个阳性菌落）

3. 慢病毒制备：调整好包装细胞293T细胞状态后，进行三质粒共转染293T细胞，转染后镜下动态观察细胞形态，24 h镜下可见293T细胞变圆（图3）。

图3

pse2353慢病毒转染293T细胞24 h镜下形态（A：×4；B：×10；C：×20）

4. THP1-PDL1单克隆细胞株表面PD-L1抗原表达：CLL-1分子主要表达于髓系细胞，尤其在AML细胞上，本实验中选择了THP-1细胞为研究靶细胞，流式细胞术检测证实此细胞表面表达CLL-1抗原分子（>85％），同时选择不表达CLL-1分子的K562细胞作为阴性对照，同时设立同型对照。经过筛选后最终获得了稳定表达PD-L1抗原的THP-1单克隆细胞株（图4）。

图4

THP1-PDL1单克隆细胞株表面PD-L1抗原表达

5. THP1-PDL1单克隆细胞株PD-L1 DNA表达：qPCR法检测筛选的THP1-PDL1单克隆细胞株中PD-L1的DNA表达情况，结果显示与普通THP-1细胞相比，病毒感染后的THP-1单克隆细胞株的PD-L1的DNA表达明显升高（1.84±0.15对0.00±0.00），差异有统计学意义（P<0.05）。

6. PD-L1过表达对CLL-1 CAR-T细胞裂解功能的影响：以THP-1和THP1-PDL1细胞为靶细胞，分别与效应细胞CLL-1 CAR-T、Vector T细胞共培养（效靶比为10∶1），结果发现CLL-1 CAR-T细胞可以有效杀伤THP-1细胞，当THP-1细胞过表达PD-L1后，CLL-1 CAR-T细胞对THP1-PDL1单克隆细胞株的裂解能力明显下降［（15.70±9.90）％对（51.95±2.52）％］，差异有统计学意义（P<0.05）；Vector T细胞组THP1-PDL1细胞被裂解程度低于THP-1细胞，但差异无统计学意义（P>0.05）（图5）

图5

PD-L1对CLL-1 CAR-T、Vector T细胞裂解靶细胞能力的影响（实验重复3次。与THP-1细胞比较，aP<0.05）

7. PD-L1过表达对CAR-T细胞释放细胞因子的影响：为进一步评估当AML细胞与CAR-T细胞共培养被杀伤时，PD-L1过表达于AML细胞，对CAR-T细胞活化释放IL-2、IL-6、IFN-γ、IL-10等一系列细胞因子的影响，使用流式微球技术检测效靶比为10∶1时共培养时释放的细胞因子。结果表明，与THP1-PDL1单克隆细胞株共培养的CLL-1 CAR-T细胞组释放的IFN-γ、IL-6、IL-10较THP-1组明显减少，差异有统计学意义（P值均<0.05）。前者IL-2水平较后者低，但差异无统计学意义（P>0.05）。同时，作为对照的Vector T细胞有类似趋势（表1）。

表1

CLL-1 CAR-T细胞活化后释放细胞因子水平（pg/ml，±s，n＝3）

组别	CLL-1CAR-T细胞				VectorT细胞
	IFN-γ	IL-10	IL-6	IL-2	IFN-γ	IL-10	IL-6	IL-2
THP-1	1708.16±26.76	124.12±3.02	124.92±4.26	40.33±28.99	1466.59±490.50	20.06±5.27	52.45±1.81	0.13±0.06
THP1-PDL1	115.66±3.13	5.69±0.13	17.37±0.72	3.26±0.00	150.11±0.81	8.64±0.60	12.66±1.97	0.08±0.03
P值	0.00	0.00	0.05	0.09	0.01	0.02	0.00	0.25

8. PD-L1过表达对CAR-T细胞增殖的影响：为进一步评估PD-L1过表达对CAR-T细胞增殖能力的影响，通过CFSE对CLL-1 CAR-T细胞染色，然后进行流式细胞术检测，发现与PD-L1过表达的THP1-PDL1单克隆细胞株共培养的CLL-1 CAR-T细胞组的增殖能力低于THP-1组（图6）。

图6

PD-L1过表达对CLL-1 CAR-T细胞增殖的影响

讨论

机体免疫在肿瘤的发生发展中有重要作用。T细胞有效激活需要协同刺激信号，主要是由共同刺激分子提供，即抗原呈递细胞表面的B7家族与T细胞表面CD28家族共受体分子相互作用。共刺激分子主要分激活性分子和抑制性分子两类，主要隶属于3个家族：B7家族、细胞因子家族和TNF家族[11]。其中B7家族中的PD-L1是近年发现的分子，正常情况下PD-L1主要表达于抗原呈递细胞（如树突状细胞）、B细胞等细胞膜表面，当T细胞活化后分泌IFN-γ，可以上调细胞表面PD-L1的表达。其与T细胞表面的受体PD-1结合发挥作用。其中PD-1是CD28家族成员之一，是一种免疫共抑制分子，诱生性表达于活化的T淋巴细胞表面，与配体PD-L1或PD-L2作用，会抑制T细胞增殖、活化[12]，参与免疫自稳。

研究发现，许多实体肿瘤细胞如黑色素瘤、卵巢癌等表面存在PD-L1高表达的情况，且其高表达能够增强肿瘤的转移能力，与预后呈负相关[13]。但当肿瘤细胞在离体环境中时，其表面的PD-L1表达强度是较低的，这提示PD-L1的表达强度与肿瘤微环境关系密切，本实验中我们的检测结果显示K562、THP-1细胞株的PD-L1同样存在低表达；此外，肿瘤微环境中的其他细胞如肿瘤相关巨噬细胞（Tumour associated macrophages, TAM）、髓源性抑制细胞（Myeloid derived suppressor cells, MDSC）表面也会高表达PD-L1，当活化的T细胞进入肿瘤微环境后，便与上述细胞表面的PD-L1结合，导致T细胞的活化、增殖等受到抑制，丧失对肿瘤细胞有效杀伤，导致肿瘤免疫逃逸[14]–[17]。与实体肿瘤类似，PD-L1同样也存在于白血病细胞表面。有学者对79例AML患者进行了检测，发现18％的患者高表达PD-L1，且可通过IFN-γ和TLR（Toll-like receptors）配体途径诱导AML细胞进一步增加PD-L1表达，其可协助AML细胞逃脱细胞毒性T细胞的杀伤[9]。并且研究发现复发患者PD-L1的表达高于非复发患者，尤其是既往接受过免疫治疗者[18]。此外，AML患者肿瘤微环境中同样存在表达PD-L1的MDSC等免疫抑制细胞，这同样导致进入微环境的T细胞出现免疫耗竭，使得白血病细胞逃避T细胞杀伤[19]。

CAR-T细胞虽然经过基因修饰，理论上与T细胞类似，伴随活化亦会出现PD-1诱生性表达，这样当CAR-T细胞与表达PD-L1的AML等细胞接触后可能会出现被免疫耗竭。鉴于PD-L1表达的不稳定，本实验构建了THP1-PDL1单克隆细胞株，在此基础上进一步探讨了PD-L1过表达对CLL-1 CAR-T细胞抗THP-1细胞作用的影响。

实验结果表明，THP1-PDL1单克隆细胞株构建成功；CLL-1 CAR-T细胞能有效杀伤CLL-1阳性的THP-1细胞，当PD-L1过表达后，CLL-1 CAR-T细胞裂解THP-1细胞的能力明显下降，其分泌IL-6、IFN-γ等炎性细胞因子的能力也减弱，CLL-1 CAR-T细胞的增殖能力也呈现出减弱的趋势。这提示我们PD-L1的过表达影响了CAR-T细胞抗白血病效应，PD-1/PD-L1信号通路是一种调控CAR-T细胞功能的手段。

综上所述，本实验结果表明PD-L1影响了CLL-1CAR-T细胞抗AML作用，PD1/PD-L1通路是调控CAR-T细胞功能的一条重要途径。但这需要进一步进行相关的体内实验及临床研究进行验证。