[Clinical study of anti-human T cell porcine immunoglobulin with recombinant human tumor necrosis factor-α receptor II: IgG Fc in the treatment of 35 cases of grade III/IV acute graft-versus-host disease after allo-HSCT].

Objective: To evaluate the efficacy and safety of anti-human T lymphocyte porcine immunoglobulin (P-ATG) with recombinant human tumor necrosis factor-α receptor Ⅱ:IgG Fc fusion protein (rhTNFR∶Fc, Etanercept) on grade Ⅲ/Ⅳ acute graft-versus-host disease (aGVHD) after allogenic hematopoietic stem cell transplantation (allo-HSCT) .
Methods: Thirty-five patients with Grade Ⅲ/Ⅳ aGVHD who received P-ATG with etanercept therapy after allo-HSCT were retrospectively analyzed. P-ATGs (5 mg·kg(-1)·d(-1)) were administrated for 3 to 5 days, and then 5mg/kg was sequentially administrated, QOD to BIW. Etanercepts were administrated 25 mg, twice a week (12.5 mg, BIW for pediatric patients) .
Results: Among the 35 patients with grade Ⅲ/Ⅳ aGVHD, 21 were males and 14 females, with a median age of 10 (3-54) years. A total of 19 cases of acute myeloid leukemia, 13 of acute lymphoblastic leukemia, 1 of severe aplastic anemia, 1 of myelodysplastic syndrome, and 1 of mixed phenotypic acute leukemia were noted. The overall response (OR) rate of P-ATG with etanercept was 85.7% (30/35) , with complete response (CR) and partial response (PR) rates of 34.3% (12/35) and 51.4% (18/35) , respectively, on day 28. The OR rate of grade Ⅲ aGVHD group was higher than of grade IV aGVHD group [100% (19/19) vs. 68.8% (11/16) , P=0.004]. On day 56, the OR rate became 77.2% (27/35) , with CR and PR rates of 62.9% (22/35) and 14.3% (5/35) , respectively. The OR rate of grade Ⅲ aGVHD group was also higher than of grade Ⅳ aGVHD group [89.5% (17/19) vs. 62.5% (10/16) , P=0.009]. Thirty-five patients had no adverse effects such as fever, chills, and rash during the P-ATG infusion, and no obvious liver and kidney function damage was observed after treatment. The main treatment-related complication was infection. The reactivation rates of CMV and EBV were 77.1% (27/35) and 22.9% (8/35) , respectively, and the bacterial infection rate was 48.6% (17/35) . With a median follow-up time of 13 (1-55) months after HSCT, the 1-year and 2-year OS rates were (68.1±8.0) % and (64.3±8.4) % , respectively. The 1-year OS rate of grade Ⅲ aGVHD group was superior to grade Ⅳ aGVHD group [ (84.2±8.4) % vs. (47.6±13.1) % , χ(2)=3.38, P=0.05].
Conclusion: This study demonstrated that P-ATG with etanercept was effective and safe in treating grade Ⅲ-Ⅳ aGVHD after allo-HSCT.

急性移植物抗宿主病（aGVHD）是影响异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）患者长期生存最重要的并发症，发生率为30％～50％，Ⅲ/Ⅳ度aGVHD发生率为5％～36％[1]–[5]。受累靶器官广泛且组织损伤程度重，约35～50％的患者对大剂量糖皮质激素一线治疗耐药，Ⅲ/Ⅳ度aGVHD尚缺乏指南性的二线方案[6]。虽然各种新开发的细胞因子类抗体、靶向药物、细胞治疗等提高了重度aGVHD治疗的反应率，但长期随访的生存率低于30％[7]–[9]。我们采用抗人T细胞猪免疫球蛋白（P-ATG）联合重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白（商品名益赛普）治疗35例Ⅲ/Ⅳ度aGVHD患者，获得了较好的疗效。

病例与方法

1. 病例：回顾性分析我院2015年11月12日至2020年4月30日期间接受P-ATG联合益赛普治疗的35例allo-HSCT后Ⅲ/Ⅳ度aGVHD患者。其中男21例，女14例，<16岁26例，≥16岁9例，中位年龄10（3～54）岁。原发疾病：急性髓系白血病（AML）19例，急性淋巴细胞白血病（ALL）13例，重型再生障碍性贫血（SAA）、骨髓增生异常综合征（MDS）、混合表型急性白血病（MPAL）各1例。急性白血病患者移植前疾病状态：第1次完全缓解（CR1）22例，CR2 7例，疾病进展4例。移植详细资料见表1。

表1

35例Ⅲ/Ⅳ度急性移植物抗宿主病（GVHD）患者的基本特征

病例特征	例数
供者类型
同胞全相合	1
单倍型	34
供受者性别
性别相合	17
性别不合	18
供、患者血型
相合	18
主要不合	8
次要不合	6
主次均不合	3
预处理方案
TBI/Cy为主	11
Bu/Cy为主	23
半量Bu+FAC	1
急性GVHD预防
CsA+MMF+短疗程MTX	34
CsA+MMF	1
预处理ATG类型
兔抗人胸腺细胞免疫球蛋白	27
抗人T细胞兔免疫球蛋白	7
抗人T细胞猪免疫球蛋白	1

注：TBI：全身照射；Cy：环磷酰胺；Bu：白消安；FAC：氟达拉滨+抗胸腺细胞球蛋白（ATG）+环磷酰胺；CsA：环孢素A：MMF：霉酚酸酯；MTX：甲氨蝶呤

2. 移植类型及预处理方案：35例患者中34例（97％）为单倍型造血干细胞移植，1例为同胞全相合造血干细胞移植。SAA单倍型移植预处理方案：半量白消安+氟达拉滨+环磷酰胺+抗胸腺细胞球蛋白（ATG）。白血病预处理方案：阿糖胞苷+全身照射（TBI）+环磷酰胺+ATG+司莫司汀（Me-CCNU）或阿糖胞苷+白消安+环磷酰胺+ATG+司莫司汀，进展期病例加用氟达拉滨/地西他滨/克拉曲滨/伊达吡星。ATG总量：兔抗人胸腺细胞免疫球蛋白（即复宁）7.5～10 mg/kg，抗人T细胞兔免疫球蛋白（ATG-F）20 mg/kg，P-ATG 120 mg/kg，均于−5～−2 d分次给药。

3. 移植物：移植物均为G-CSF动员的骨髓联合外周血造血干细胞（骨髓回输后第1天输注外周血干细胞）。单倍型移植患者于骨髓回输后第2天加用第三方细胞（非血缘脐血有核细胞数1×107/kg或单倍体相合骨髓1 ml/kg）输注及诱导免疫耐受。

4. 诊断标准：aGVHD的诊断及分度依据Glucksberg1994标准[10]。纤维结肠镜病理诊断依据Freiburg标准[11]。慢性GVHD诊断依据参照NIH标准[12]。

5. aGVHD治疗方案：所有病例确诊aGVHD后，在常规应用环孢素A或他克莫司、霉酚酸酯（MMF）基础上，予甲泼尼龙2 mg·kg−1·d−1。治疗3～7 d仍持续进展或无改善，加用益赛普25 mg每周2次（儿童剂量减半）和（或）巴利昔单抗（20 mg，第1、4、8、15天，儿童剂量减半）；Ⅲ/Ⅳ度患者给予P-ATG（5 mg·kg−1·d−1×3～5 d，序贯5 mg/kg隔日1次～每周2次）联合益赛普（25 mg每周2次，儿童剂量减半）治疗。抗aGVHD治疗期间，予两性霉素B 0.1～0.2 mg·kg−1·d−1预防真菌感染（如出现肌酐升高，则更换为泊沙康唑或伏立康唑）。予阿昔洛韦预防病毒感染，积极予抑酸、护胃、静脉营养等支持治疗。

6. 疗效判定标准及定义：P-ATG治疗28 d、56 d、进行疗效评估。完全缓解（CR）：受累器官无GVHD临床征象；部分缓解（PR）：至少1个受累器官aGVHD得到改善，其他受累器官无恶化；未缓解（NR）：受累靶器官aGVHD无变化或任一靶器官aGVHD进展。CR、PR定义为有效[13]。

7. 随访：随访资料来自门诊/住院病历及电话随访。随访截止日期为2020年4月30日。总生存（OS）时间定义为造血干细胞回输至随访截止或死亡时间。

8. 统计学处理：采用SPSS19软件进行统计学分析。非计量资料用百分数和率表示。组间总有效率比较采用Mann-Whitney和Kruskal-Wallis检验。生存分析采用Kaplan-Meier法，组间生存率比较采用Log-rank检验。使用Graphpad Prism5.0绘图。

结果

1. aGVHD的发生情况：35例患者aGVHD的中位确诊时间为移植后21（6～110）d，Ⅲ/Ⅳ度aGVHD中位确诊时间为移植后28（17～132）d。Ⅲ度aGVHD 19例，Ⅳ度aGVHD 16例。单个器官受累10例（肠道9例，肝脏1例），2个器官受累15例（皮肤+肝脏1例，皮肤+肠道10例，肝脏+肠道4例），3个器官（皮肤+肝脏+肠道）受累10例。33例（94.3％）患者累及肠道，18例接受纤维结肠镜检查及病理活检，均符合aGVHD诊断，其中1例合并巨细胞病毒（CMV）感染。

2. P-ATG和益赛普剂量：P-ATG联合益赛普应用前，3例患者接受巴利昔单抗20 mg×2～7次治疗，6例患者接受益赛普（25 mg×1～5次）治疗，23例患者接受巴利昔单抗（20 mg×2～7次）联合益赛普（20 mg×2～7次）治疗，因aGVHD持续加重而纳入本研究。P-ATG联合益赛普治疗开始的中位时间为移植后29（17～250）d，P-ATG中位总剂量为70（25～300）mg/kg，益赛普中位总剂量为125（25～825）mg。

3. 疗效：①联合治疗28 d疗效：CR 12例（34.3％），PR 18例（51.4％），总有效率为85.7％（30/35）。Ⅲ度aGVHD组19例，CR10例，PR 9例；Ⅳ度aGVHD组16例，CR 2例，PR 9例，NR 5例。Ⅲ度aGVHD组总有效率高于Ⅳ度aGVHD组［100％（19/19）对68.8％（11/16），P＝0.004］。单器官受累、2个器官受累、3个器官受累组的总有效率分别为90％、86.7％、80％（P＝0.527）。②联合治疗56 d疗效：CR 22例（62.9％），PR 5例（14.3％），总有效率为77.2％（27/35）。Ⅲ度aGVHD组19例，其中CR16例，PR 1例，NR 2例；Ⅳ度aGVHD组16例，其中CR 6例，PR 4例，NR 6例。Ⅲ度aGVHD组总有效率高于Ⅳ度aGVHD组［89.5％（17/19）对62.5％（10/16），P＝0.009］。

4. 生存分析：随访截止日期为2020年4月30日，中位随访时间13（1～55）个月，移植后12个月OS率为（68.1±8.0）％，24个月OS率为（64.3±8.4）％。Ⅲ度aGVHD组移植后1年OS率高于Ⅳ度aGVHD组［（84.2±8.4）％对（47.6±13.1）％，χ2＝3.38，P＝0.05］。移植后1年cGVHD发生率为（66.8±10.1）％（广泛型7例，局限型10例）。

5. 治疗相关并发症：CMV、EB病毒（EBV）再激活发生率分别为77.1％（27/35）、22.9％（8/35）。CMV肠炎2例，均以更昔洛韦/膦甲酸钠、巨细胞免疫球蛋白、阿昔洛韦治愈。单纯疱疹病毒感染3例。出血性膀胱炎20例，1例儿童患者膀胱造瘘术后死于GVHD进展，19例经减量免疫抑制剂、碱化、水化、膀胱冲洗治愈。肺感染12例，急性胰腺炎2例，急性胆囊炎3例，肠梗阻5例。13例（37.1％）例死亡，死亡原因包括：aGVHD进展4例（其中3例合并血栓性微血管病），感染5例，脑出血1例，胆囊穿刺术后出血1例，心脏性猝死1例，白血病复发1例。

讨论

aGVHD的发生机制主要是患者组织抗原激活的以供者T细胞活化为核心的异源免疫反应，预防和治疗上以体内或体外耗竭T细胞为主[14]。ATG用于治疗aGVHD始于1974年[15]。Martin等[16]对1990年至2011年共计67篇糖皮质激素耐药aGVHD的文献进行分析，结果显示马ATG是应用频率最高的药物。此后多项研究显示，ATG治疗糖皮质激素耐药aGVHD的总有效率为30％～60％，导致死亡的最主要原因是GVHD进展和感染[17]–[20]。2001年Hsu等[21]研究显示，50％的移植中心应用马ATG（总剂量25～180 mg/kg），24％的中心应用兔ATG（4～50 mg/kg），多采用大剂量短期应用方案。Murata等[22]报道了兔ATG（即复宁）治疗99例糖皮质激素耐药aGVHD患者，有效率（CR+PR）为60％，CR+PR组、NR组移植后1年OS率分别为42％、5％。多因素分析显示不同剂量兔ATG组有效率差异无统计学意义，但高剂量与高非复发死亡率相关。不同动物来源ATG均可产生确切的淋巴细胞功能的抑制，但也显著增加了病毒、细菌及真菌感染发生率。于是，开始探索低剂量ATG单药或联合其他细胞因子抗体的应用并取得一定疗效。Tagliabue等[23]应用小剂量ATG治疗儿童Ⅲ/Ⅳ度aGVHD，6例患儿中5例获得CR，1例获得PR。刘静等[24]报道应用小剂量即复宁治疗Ⅱ～Ⅳ度aGVHD，6例患者中3例获得CR，1例获得PR。叶昌雄等[25]应用即复宁（总量4～7.5 mg/kg）联合抗CD25单抗治疗10例Ⅲ/Ⅳ度aGVHD，8例获得CR，2例获得PR，5例患者移植后存活超过2年。

P-ATG是国产多克隆抗淋巴细胞免疫球蛋白，治疗SAA的总有效率与兔ATG无明显差别，且不良反应及感染风险较低[26]–[27]。张湘兰[28]研究发现，SAA患者应用P-ATG联合免疫抑制剂治疗后，血清IL-2、IL-6、TNFα、INFγ、TGFβ1、IL-17水平均较治疗前显著下降。张晓辉等[29]研究显示，P-ATG在人体内维持有效血药浓度至少60 d。兔ATG在人体内有效血药浓度至少维持90 d[30]。杨楠等发现在SAA免疫抑制治疗（IST）中，兔ATG较P-ATG对淋巴细胞的清除程度更深、抑制时间更持久[31]。基于上述原因我们认为，与兔ATG相比，小剂量P-ATG治疗aGVHD可能具有更高的有效率和较低的机会性感染发生风险。考虑aGVHD靶器官组织及功能损害阶段以肿瘤坏死因子介导为主，我们采用小剂量P-ATG联合益赛普治疗35例Ⅲ/Ⅳ度aGVHD，治疗28 d的CR率为34.3％，但治疗进行至56 d时CR率达到62.9％，Ⅲ度aGVHD组总有效率及OS率均优于Ⅳ度aGVHD组。

重度aGVHD的低反应率及组织修复缓慢，原因可能包括：糖皮质激素耐药或抵抗，钙调磷酸酶抑制剂（CNI）不耐受或中断，机会性感染，消化道出血、梗阻和极度营养缺乏等。为减低感染风险，我们采取了以下措施：①判定糖皮质激素耐药后快速减停（每3～5 d减量0.2 mg·kg−1·d−1；②低剂量两性霉素B（0.1～0.2 mg·kg−1·d−1）预防真菌感染，既能减少与CNI的相互作用，又有效降低了真菌感染风险。低剂量两性霉素B预防真菌可以追溯到20世纪90年代，Perfect等[32]报道预防性低剂量两性霉素B（0.1 mg·kg−1·d−1）可有效减少口咽部酵母菌定植、降低真菌感染发生率。后续研究显示，在HSCT患者真菌预防中，0.2 mg·kg−1·d−1两性霉素B和氟康唑具有同样效果，但两性霉素B不良反应较为显著[33]–[34]。而脂质体两性霉素B具有较低的肾毒性，2020年Mendoza-Palomar等[35]将低剂量脂质体二性霉素B（1 mg·kg−1·d−1）用于儿童HSCT，真菌突破感染率为7.7％，不良反应均为1级。③通过监测血浆sCD25、TNFα、IL-6、IL-10等细胞因子水平，对P-ATG和益赛普序贯治疗进行调整。经过上述多项措施，本组患者移植后24个月OS率为（64.3±8.4）％，移植后1年广泛型cGVHD发生率为（41.2±13.7）％，或许得益于ATG相对持久的免疫抑制效应。

本研究结果初步显示，P-ATG联合重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白治疗allo-HSCT后Ⅲ/Ⅳ度aGVHD有较好的疗效和安全性。