Comparison of senescence progression in mesenchymal cells from human umbilical cord walls measured by immunofluorescence and flow cytometry of p16 and p21.

OBJECTIVE: To follow the expansion of mesenchymal stem cells from umbilical cords by two classic senescence markers, p16 (INK4A) and p21 (CDKN1A), using practical, fast, and less expensive methods than the gold standard Western blotting technique, to evaluate its applicability in the laboratory.
METHODS: Mesenchymal stem cells from umbilical cords were isolated from Wharton's jelly and, after quality control, morphological and immunophenotypic characterization by flow cytometry, were expanded in culture until coming close to cell cycle arrest (replicative senescence).
RESULTS: A comparison was made between young cells, at passage 5, and pre-senescent cells, at passage 10, evaluating the protein expression of the classic cell senescence markers p16 and p21, comparing the results obtained by Western blotting with those obtained by flow cytometry and indirect immunofluorescence.
CONCLUSION: Follow-up of cell cultures, through indirect p16 immunofluorescence, allows the identification of mesenchymal stem cells from umbilical cord cultures at risk of reaching replicative senescence.

INTRODUCTION

Mesenchymal stem cells (MSC), initially described in 1968, are clonogenic cells capable of self-renewal and differentiation into other types of cells.( This differentiation into adipocytes and into the osteogenic and chondrogenic lineages can be reproduced in vitro. The MSC can also be expanded in cultures and tested in regenerative medicine protocols, potentially becoming useful for cell therapy.(

A rich source of MSC is the umbilical cord because the connective tissue that involves umbilical vessels, called Wharton’s jelly, contains cells considered an alternative to the use of MSC from bone marrow and other tissues. This is due to its easy isolation, its greater potential to expand when in a culture,( and its greater accessibility, with few ethical restrictions. Additionally, as very young (neonatal) cells, they are considered to have undergone less environmental interference from infections and health-damaging products or suffered the consequence of aging.(

With the advancement of the body’s age, the MSCs, just as any other adult cells, can become senescent. In senescence, the cellular cycle is arrested, interrupting cell division; however, the cells remain alive, but are dysfunctional.(

The term “replicative senescence” was coined by Hayflick, in 1960, when he showed that human diploid fibroblasts had a limited capacity to proliferate in vitro, since there was reduction in the length of telomeres and arrested cell division. However, the cells still remained alive and secreted metabolites.( Later, it was shown that mitotically normal cells can also enter senescence by the action of stressors,( such as damage to DNA, which accompanied by the increase in poorly folded proteins and oxidative stress( caused an irreversible loss of the proliferative ability.( It is agreed that this state of senescence protects the organism, impeding the cell from an abnormal growth, thus avoiding appearance of cells with tumorigenic potential.( Therefore, induction of senescence results directly from signaling systems activated during the cellular cycle. To regulate this induction there are control proteins that activate and others that inhibit their targets with opposing results. Within the group of positive control proteins are the cyclin-dependent kinases (CDK), which trigger signaling cascades that lead to the arrest in cell proliferation. Because of this action, they are known as tumor suppressors. This is the case of p16 (P16INK4 gene or CDKN2, cyclin-dependent kinase inhibitor 2A) and p21 (CDKN1A, cyclin-dependent kinase inhibitor 1A) proteins. Even though characterization of senescence is still based on the presence or absence of a group of robust markers,( accumulation of p16 is considered a key marker of cellular senescence. Furthermore, p21 is also a tumor suppressor protein and its expression can be utilized as a marker of young cells with a high proliferative capacity, contrasting with p16, which is increasingly expressed in later passages.(

The evaluation of cellular senescence markers is commonly done by Western blotting (WB), considered the gold standard for evaluation of protein expression. However, it is a laborious technique requiring several steps and needs a large number of cells. For this reason, measuring senescence usually implies in ending the culture to obtain the necessary quantity of cells. Therefore, we decided to evaluate if other reliable methods present sensitivity to measure cell senescence, carrying out a comparative analysis with WB. An assessment of senescence in cell cultures was done using indirect immunofluorescence (IFI) and flow cytometry, techniques that are faster and use a smaller number of cells. Additionally, these techniques offer the possibility of storing remaining cells or even of maintaining ongoing experiments. Finally, the possibility of cell storage and even of further cell expansion is important when the goal is the use in cell therapy. Our hypothesis was that one of these techniques could be used instead of WB, allowing evaluation of senescence during the experiments, without, however, interrupting the cell culture.

OBJECTIVE

To compare the measurements of p16 and p21 proteins by immunofluorescence and/or flow cytometry with Western blotting, at p5 and p10 passages, that is, at two timepoints of the mesenchymal stem cell culture, to monitor the progression of senescence in stages prior to the cell cycle arrest and to determine the feasibility of the two alternative techniques.

METHODS

Obtaining the cord

Human umbilical cords (n=4) were harvested after obtaining Informed Consent, according to ethical criteria established by the National Health Council. The protocol was approved under CAAE: 17079113.4.0000.0071 and #353.781. Healthy samples were those that followed the evaluation criteria of the Public Umbilical Cord Blood Bank of the Hospital Israelita Albert Einstein (HIAE): pregnant women aged over 18 years, with gestations equal to or greater than 35 weeks, in whom water did not break more than 18 hours before, who attended to at least two appointments during pregnancy, with no infection or fever at birth, and delivery by cesarean section. Before delivery and after maternal blood collections, serology was performed to confirm absence of hepatitis A, B, and C, HIV I and II, HTLV I and II, cytomegalovirus, toxoplasmosis, Chagas’ disease, and syphilis, besides hemoglobin electrophoresis Agência Nacional de Vigilância Sanitária/Resolução da Diretoria Colegiada (ANVISA/RDC 153/2004). Samples were harvested as of 2013 and the study was concluded in June 2018.

Cell isolation and culture

After blood removal, cords were processed at our laboratory within four hours of harvesting, according to the protocol published by Paladino et al.,( Cells from the umbilical cord wall were sown onto 25 or 75cm2 culture flasks (Corning, St. Louis, MO) containing Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM-LG) supplemented with 20% fetal bovine serum (FBS), 1% antibiotic-antifungal (penicillin 100 units/mL, streptomycin 100μg/mL, amphotericin 250ng/mL, and L-glutamine 2mM/mL) solution and maintained in a humidified incubator, with 5% carbon dioxide, at 37oC. The cells were stored in liquid nitrogen at passage 3. All reagents were acquired from Gibco® (New Grand Island, USA) except where specified. We used two aliquots to obtain cells at passage 5 (p5) and a third sample from the same cord for expansion until passage 10 (p10). After thawing, samples were cultured in the same medium, but adding only 10% of SFB. A total of 4,000 cells/cm2 were sown and culture medium was changed every 48 hours. Cell passaging was done at 70% confluence, utilizing a 1% collagenase solution for five minutes. Cells were characterized as MSC at passage 4 as per criteria established by the International Society for Cellular Therapy (ISCT)( and maintained in culture until passage 10. Human Embryonic Kidney 293 (HEK-293) cells were used as positive control and MCF7 (Mammary Gland, Breast; Derived from Metastatic Site: Pleural Effusion) cells as negative control for p16 analysis, both obtained from the Rio de Janeiro Cell Bank (Rio de Janeiro, Brazil). The same cells worked respectively as negative and positive controls for p21.

Sterility, mycoplasma detection, and microbiological testing of cell cultures

After 48 hours, 750µl of supernatant were collected for microbiological analysis to confirm absence of microorganisms in the cell culture. This analysis was performed by the Clinical Laboratory of the Hospital Israelita Albert Einstein using the Ziehl-Neelsen stain for high-resistance bacteria, direct observation for fungi, in addition to bacterioscopic analysis. Mycoplasma detection was done by Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) using anti-Mycoplasma antibodies. After checking for absence of microorganisms, samples were either frozen or maintained in culture for future assays.

Immunophenotypic characterization of mesenchymal stem cells at passage 3 and/or 4

According to ISCT, MSC must exhibit a specific profile of cell surface markers, positive for CD105, CD73, CD44, CD29, CD166, and CD90, and negative for hematopoietic markers (CD14, CD34, CD45, CD117, CD133), endothelial markers (CD31, CD106, CD133 ) and cell surface HLA-DR molecules.( There are three minimum requirements for the classification of a MSC population. The first is its isolation through selective adherence, in culture, to the plastic surface; the second is a set of positive and negative markers analyzed by flow cytometry; and the third is the capacity of the cells to differentiate into osteocytes, adipocytes, and chondrocytes. The characterization of the cells in this study was carried out by Paladino et al.(

Western blotting

Lysate proteins were quantified by the Pierce method (BCA protein Assay Kit, Thermo Fisher, USA) and separated by electrophoresis in a 12% polyacrylamide gel for 1 hour 20 minutes, at 100 V, in neutral pH buffer containing SDS (sodium dodecyl sulfate) at 1% (Invitrogen, USA). After the run, the proteins were transferred to Amersham nitrocellulose (GE Healthcare Life Sciences, USA) membranes using a 20% methanol buffer (Merck KGaA, Darmstadt, Germany) for 1 hour, at 100V. The membranes were then incubated in 5% bovine serum albumin (BSA, Cell Signaling, USA) blocking solution for 1 hour followed by the primary p21 (1:1000 – Ab109520, Abcam, USA) or p16 (1:1000 – Ab108349, Abcam, USA) antibodies in BSA solution, overnight. Subsequently, membranes were washed three times for five minutes with TBS-T (Tris-HCl, 24.23g, NaCl 80.06g, and 0.1% Tween® 20) solution and then, incubated with the secondary antibody conjugated to horseradish peroxidase (HRP) (1:2000, Cell Signaling, USA) diluted in TBS-T + 2% Molico milk (Nestlé, Brazil), for 1 hour, in a dark environment, under gentle shaking. After another three washes, membranes received ECL Prime Western Blotting System developer solution (GE Healthcare Life Sciences, USA). The chemiluminescent solution was analyzed in a Chemidoc reader (Bio-Rad, Hercules, USA) revealing the presence of the specific protein band. Analysis was done by the ImageLab program (Biorad, Hercules, USA). Each test was done in duplicate.

Indirect immunofluorescence

Cells in culture were transferred to circular glass cover slips fitted into 24-well plates, sown at a concentration of 4,000/cm2 and cultured until reaching 50% to 70% confluence. Culture medium was then removed, cells were washed with phosphate buffered saline (PBS) four times and fixed with 4% paraformaldehyde, for 10 minutes. Next, cells were washed with PBS and cell membranes permeabilized with a Triton-X 100 (non-ionic detergent, Sigma-Aldrich, USA) solution at 0.01%, diluted in PBS, for 15 minutes. Following four washes with PBS, at 5-minute intervals, nonspecific bonds were blocked with BSA at 1%, for 30 minutes. After repeating PBS washes, cells were incubated for 24 hours with the primary p16 (1:100 - Ab108349, rabbit anti-human, Abcam, USA) or p21 (1:100 - Ab109520, rabbit anti-human, Abcam, USA) antibodies, in a dark and humid environment at 4°C. After 24 hours, cells were washed three times with PBS at 5-minute intervals, and then, incubated with the secondary antibody. We used the secondary antibody diluted in 1% BSA to detect p16 (1:400, rabbit anti-human IgG (H+L), F(ab’)2 Fragment, Alexa Fluor® 555 Conjugate, Cell Signaling, USA) or p21, (rabbit anti-human IgG (H+L), F(ab’)2 Fragment, AlexaFluor® 488 Conjugate, Cell Signaling, USA), for 30 minutes, maintaining the membrane in room temperature under gentle shaking and protected from light. Next, cells were washed with PBS, in 5-minute intervals; the last wash was done with distilled water and immediately after, cover slips were recovered from their wells. Cover slips were maintained protected from light at room temperature until completely dry, for staining with a DAPI (VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI, Vector Laboratories, EUA) reagent. Slides were analyzed on a confocal fluorescence microscope (Zeiss confocal LSM 880, Germany), and cell count was carried out on ten fields, in triplicate, regardless of the number of cells in each field. Mean fluorescence intensity was calculated correcting by the number of cells counted. Fluorescence was measured using the ZEN lite program (Zeiss, Germany).

Flow cytometry

Cultured cells were recovered, washed with PBS 1X containing 1% BSA and centrifuged at 400g, for five minutes. To stain for p16 we utilized 2x105 cells/tube fixed with 4% paraformaldehyde, for 10 minutes, at room temperature. The test was done in triplicate, as in the case of IFI. After permeabilization in PBS 1X + 0.1% Tween® 20 (Merck KGaA, Darmstadt, Germany) for 20 minutes, at 4°C, cells were washed with PBS containing 0.1% Tween® 20, at room temperature. The cell suspension was then centrifuged at 400g for five minutes. To avoid nonspecific binding, we added BSA 5% + 0.1% Tween® 20, for 15 minutes, at 4°C. Cells were washed once again and centrifuged for intracellular staining with rabbit anti-human CDKN2A/p16INK4A (1:100, clone: EPR1473, Abcam, USA) monoclonal antibody. After incubation for 30 minutes at 4°C, washing and centrifugation were repeated twice. Cells were then incubated with an abbit anti-human polyclonal secondary antibody conjugated with PE (1:100, clone: Poly4064, Biolegend, USA), washed and suspended in PBS + 1% BSA for analysis in a BD FACSARIA (Becton Dickinson, San Jose, CA) flow cytometer. A protocol similar to the one used for p21 was used to stain for p16, except for fixing cells in 80% methanol at 4°C, followed by incubation for 20 minutes at 4°C and rabbit anti-human p21 monoclonal antibody (1:100, clone: EPR 362, Abcam, USA) for the intracellular staining. Results were analyzed with FlowJo software (Treestar, Ashland, Oregon), considering mean fluorescence intensity (MFI) values after counting 2x105 cells/tube.

Experimental design

Figure 1 shows the experimental design used in this study. It is important to point out that the comparison between the different methods was enabled by the concomitant use of the same cell cultures in the three methods of choice. Thus, when dealing with primary cultures, and not with established lineages, this experimental design sought to enable the detection of low albeit normal, levels of proliferation of cells in a culture eventually harboring more senescent cells, and therefore, with decreased proliferation rates. The complete experiment was repeated with four different cells, and the results are only qualitatively described.

Figure 1

Experimental design

MSC: mesenchymal stem cells; WB: Western blotting; IFI: indirect immunofluorescence; FC: flow cytometry; p: passage.

RESULTS

Western blotting showed the heterogeneity of individual progression to replicative senescence

As expected, using the WB technique, p16 and p21 levels showed the progression towards replicative senescence. Measurement of p16 and p21 by WB displayed an increase in p16 and a decrease in p21 at passage 10 compared to passage 5 (Figures 2 and 3, respectively), consistent with the expression previously observed in senescent mesenchymal cells from other sources( and with the heterogeneous profile observed in the different cords studied.( Each MSC culture showed typical morphologic changes, with a distinct pattern of population doubling (Supplementary figure 1A), but with the predicted increase in cytoplasm (Supplementary figure 1B).

Figure 2

Western blotting of p16 in mesenchymal stem cells (n=4) at passage 5 and passage 10. (A) intensity of the p16 band normalized by the beta-actin band for each sample. The vertical bar indicates variation in measurements. (B) image of p16 bands at passage 5. (C) image of beta-actin bands at passage 5. (D) image of p16 bands at passage 10. (E) image of beta-actin bands at passage 10

p: passage; MSC: mesenchymal stem cell.

Figure 3

Western blotting of p16 in mesenchymal stem cells (n=4) at passage 5 and passage 10. (A) intensity of the p21 band normalized by the beta-actin band for each sample. The vertical bar indicates the variation in measurements. (B) image of p21 bands at passage 5. (C) image of beta-actin bands at passage 5. (D) image of p21 bands at passage 10. (E) image of beta-actin bands at passage 10

P: passage; MSC: mesenchymal stem cell.

Supplementary figure 1. (A) Optical microscopy image of mesenchymal stem cells isolated from cord 81. Optical microscopy image of mesenchymal stem cell 81 in (B) passage 5 and (C) passage 10, showing cells with increased volume and greater refringence, indicating the progression to replicative senescence

MSC: mesenchymal stem cell; p: passage.

Monitoring of p16, but not of p21 by immunofluorescence shows a pattern comparable to Western blotting

As a semiquantitative method, IFI permits follow-up of cultures, but no quantitative measurements, such as those obtained by WB. Nevertheless, expression of p16 at passage 10 was increased in all the samples analyzed by IFI, with a profile comparable to the variation observed with WB (Figures 4A and 4B).

Figure 4A

Mean fluorescence intensity of p16 in mesenchymal stem cells (n=4) at passage 5 and passage 10, analyzed by indirect immunofluorescence. The vertical bar indicates the variation in measurements

p: passage; MFI: mean fluorescence intensity; MSC: mesenchymal stem cell.

Figure 4B

Fluorescence intensity of p16 (in red) in the mesenchymal stem cells (n=4) at passage 5 and passage 10, analyzed by indirect immunofluorescence. Nuclei stained with DAPI (in blue). (A) negative control using secondary antibody; (B) mesenchymal stem cell 80 at p5; (C) mesenchymal stem cell 80 at p10; (D) mesenchymal stem cell 81 at p5; (E) mesenchymal stem cell 81 at p10; (F) mesenchymal stem cell 83 at p5, (G) mesenchymal stem cell 83 at p10; (H) mesenchymal stem cell 84 at p5; (I) mesenchymal stem cell 84 at p10

On the other hand, IFI of p21 has not proven to be a reliable marker in comparison to WB. Only two of the four cells showed the same behavior, with greater expression of p21 at passage 5 relative to passage 10 (Supplementary figures 2 and 3).

Supplementary figure 2. Mean fluorescence intensity of p21 in the mesenchymal stem cells (n=4) at passage 5 and passage 10, analyzed by indirect immunofluorecence. The vertical bar indicates variation in measurements

p: passage; MFI: mean fluorescence intensity; MSC: mesenchymal stem cell.

Supplementary figure 3. Fluorescence intensity of p21 (in green) in mesenchymal stem cells (n=4) at passage 5 and passage 10, analyzed by indirect immunofluorescence. Nuclei stained with DAPI (in blue). (A) negative control using secondary antibody; (B) mesenchymal stem cell 80 at p5; (C) mesenchymal stem cell 80 at p10; (D) mesenchymal stem cell 81 at p5; (E) mesenchymal stem cell 81 at p10; (F) mesenchymal stem cell 83 at p5; (G) mesenchymal stem cell 83 at p10; (H) mesenchymal stem cell 84 at p5; (I) mesenchymal stem cell 84 at p10

Monitoring p21, but not p16, by flow cytometry is comparable to Western blotting

When we compared flow cytometry with WB, it was possible to observe that expression of p21 by flow cytometry and WB presented a similar behavior (Figure 5). On the other hand, the expression of p16 did not show the expected results (Supplementary figure 4). Additionally, since the quantity of cells necessary for analysis by flow cytometry was greater than for IFI, a fourth sample, which exhibited a very low proliferation rate at passage 10 could not be analyzed.

Figure 5

Mean fluorescence intensity of p21 in the mesenchymal stem cells (n=4) at passage 5 and passage 10, analyzed by flow cytometry. The vertical bar indicates the variation in measurements

p: passage; MFI: mean fluorescence intensity; MSC: mesenchymal stem cell.

Supplementary figure 4. Mean fluorescence intensity of p16 in mesenchymal stem cells (n=4) at passage 5 and passage 10, analyzed by flow cytometry. The vertical band indicates variation in measurements

p: passage; MFI: mean fluorescence intensity; MSC: mesenchymal stem cell.

DISCUSSION

To make a proper comparison of the two techniques, IFI and flow cytometry, with WB cells from the same culture of each of the cords were used, and comparisons were done simultaneously. Although still a preliminary study, results indicated that monitoring p16 levels on IFI slides cultured in parallel with each sample are an interesting approach to monitoring MSC cultures. These cultures are long lasting, with a significant number of passages needed to achieve the necessary expansion in cell numbers, and the concomitant analysis of the evolution of the culture helps to identify those MSC with a higher risk of entering replicative senescence.

We also analyzed p21, but the results show that even when using flow cytometry, with a data profile comparable to the gold standard WB, the need for more cells extracted directly from the culture, and not from a cover slip cultured in parallel (as in the case of IFI), makes the practice more difficult. Furthermore, it has already been described, in other cells, that p21 levels decrease gradually while p16 levels increase.( This is probably due to the fact that the functional control of p21 occurs primarily through phosphorylation and intracellular compartmentalization during the different phases of the cell cycle. Several weeks after human fibroblast cultures reach senescence, the p21 level continues to diminish gradually as the p16 level increases.( These findings, and the fact that p21 is not induced in senescent p53-deficient cells that have a prolonged replicative life,( suggest that p53 initiates the inhibition of this cellular replication, at least in part, by inducing p21. The subsequent increase in p16 then acts to maintain the arrest in cell growth, leading to senescence. Thus, even though p21 is a marker of cellular aging, monitoring it ends up being more complex and out of the scope of our study. In contrast, the observation of p21 levels by flow cytometry, using antibodies that also measure the degree of protein phosphorylation, may render monitoring of progression to cellular senescence with p21 useful for research.

There are clear limitations to our study, since only four samples were tested of a single tissue type and it would be important to compare them to other MSC, for example, from bone marrow and adipose tissue, to validate this very practical strategy of assessing the progression of senescence in cultures. Traditionally, cells have their validation in terms of quality, cell markers, and proliferative capacity made at low passages (passages 4 or 5), and, in the final phases before therapeutic application, only microbiological and cytogenetic controls are carried out. The degree of senescence, that is, the cell capacity for proliferation is not evaluated before their use. Thus, we believe that it is possible to follow the intracellular increase of p16 during cell expansion with the purpose of cell therapy. This follow-up can be useful to improve the evaluation of the effectiveness of donor cells, which, together with the factors inherent to recipients, such as age, and type and severity of the underlying disease impact the success of therapy with MSC.

CONCLUSION

Follow-up of cell cultures using indirect immunofluorescence of p16, allows identifying mesenchymal stem cell cultures at risk of reaching replicative senescence.

INTRODUÇÃO

As células-tronco mesenquimais (CTM), descritas inicialmente em 1968, são células clonogênicas, capazes de autorrenovação e de diferenciação em outros tipos de células.( Essa diferenciação em adipócitos e nas linhagens osteogênica e condrogênica pode ser reproduzida in vitro. As CTM também podem ser expandidas em cultura e testadas em protocolos de medicina regenerativa, tornando-se potencialmente úteis para terapia celular.(

Uma fonte rica em CTM é o cordão umbilical, pois o tecido conjuntivo que envolve os vasos umbilicais, chamado de geleia de Wharton, contém células consideradas uma alternativa ao uso de CTM de medula óssea e de outros tecidos, por sua facilidade de isolamento, seu maior potencial de expansão em cultura( e sua maior acessibilidade, com poucas restrições éticas. Além disso, por serem células de idade muito jovem (neonatal), considera-se terem sofrido menor interferência ambiental de infecções e produtos danosos à saúde, ou ação pelo envelhecimento.(

Com o avanço da idade do organismo, as CTMs, como quaisquer outras células adultas, podem entrar em senescência. Na senescência, ocorre a parada do ciclo celular, interrompendo a divisão celular; entretanto as células continuam vivas, mas disfuncionais.(

O termo “senescência replicativa” foi cunhado em 1960 por Hayflick quando mostrou que fibroblastos diploides humanos tinham capacidade limitada para proliferar in vitro, pois ocorriam a redução do comprimento dos telômeros e a parada da divisão celular. Entretanto as células mantinham-se ainda vivas e secretando metabólitos.( Depois, foi mostrado que células mitoticamente normais também podem entrar em senescência pela ação de estressores,( como danos ao DNA que, acompanhados do aumento de proteínas mal dobradas e do estresse oxidativo,( acarretam uma perda irreversível da capacidade proliferativa.( É consenso que esse estado de senescência protege o organismo, impedindo a célula de ter um crescimento anormal e evitando o aparecimento de células com potencial tumorigênico.( Assim, a indução da senescência decorre diretamente de sistemas de sinalização ativados durante o ciclo celular. Para regular essa indução, existem proteínas controladoras positivas que ativam, e outras negativas que inibem seus alvos e contrapõem suas ações. Dentro do grupo de proteínas positivas, estão as cinases dependentes de ciclina (CDK), que desencadeiam cascatas de sinalização, as quais levam à parada de proliferação celular. Por essa ação, são conhecidas como supressoras de tumores. É o caso das proteínas p16 (gene P16INK4 ou CDKN2 - cyclin-dependent kinase inhibitor 2A) e p21 (CDKN1A - cyclin-dependent kinase inhibitor 1A). Apesar da caracterização da senescência ainda se basear na presença ou na ausência de um grupo de marcadores robustos,( o acúmulo de p16 tem sido considerado um marcador-chave da senescência celular. A p21 também é uma proteína supressora de tumor, sendo que seu nível de expressão pode ser utilizado como marcador de células jovens, com alta capacidade proliferativa, contrastando com p16, expressa em nível elevado em passagens tardias.(

A avaliação de marcadores de senescência celular é comumente realizada pela técnica de Western blotting (WB), considerada padrão-ouro para avaliação de expressão proteica. Entretanto é uma técnica trabalhosa, por demandar várias etapas, e que necessita de um número grande de células. Por esse motivo, usualmente, analisar um ensaio de senescência implica no término da cultura para a obtenção da quantidade necessária de células. Assim, propusemos-nos testar outros métodos sensíveis e com resultados confiáveis no quesito de avaliação da senescência celular, efetuando uma análise comparativa com os resultados obtidos por WB. Foi feita uma avaliação da senescência das culturas celulares por imunofluorescência (IFI) indireta e citometria de fluxo, técnicas mais rápidas e que utilizam número menor de células. Além disso, essas técnicas oferecem a possibilidade de armazenamento das células restantes ou mesmo a continuação dos experimentos. Finalmente, a possibilidade de armazenar mais células e mesmo de continuar sua expansão é importante quando a meta é usá-las em terapia celular. Nossa hipótese foi a de que uma dessas técnicas poderia ser empregada ao invés de WB, permitindo a avaliação de senescência durante os experimentos sem, todavia, interromper a cultura.

OBJETIVO

Comparar medidas das proteínas p16 e p21 por imunofluorescência e/ou citometria de fluxo com Western blotting nas passagens p5 e p10, ou seja, em dois momentos da cultura de células-tronco mesenquimais, para monitorar a progressão da senescência em uma fase anterior à parada do ciclo celular, e determinar a viabilidade das duas técnicas alternativas.

MÉTODOS

Obtenção do cordão

Cordões umbilicais humanos (n=4) foram coletados, após a obtenção do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido, conforme critérios éticos estabelecidos pelo Conselho Nacional de Saúde. O protocolo aprovado recebeu o CAAE: 17079113.4.0000.0071 e parecer 353.781. Foram consideradas amostras saudáveis as que obedeceram aos critérios de avaliação do Banco Público de Sangue de Cordão Umbilical do Hospital Israelita Albert Einstein (HIAE): gestantes com idade acima de 18 anos; com tempo de gravidez igual ou superior a 35 semanas; cuja bolsa não poderia ter se rompido há mais de 18 horas; que realizaram no mínimo duas consultas durante a gravidez; sem infecção ou febre no momento do parto; e parto por cesárea. Antes do parto, após a coleta do sangue da mãe, foram realizados exames sorológicos, para confirmar a ausência de vírus da hepatite A, B e C, HIV I e II, HTLV I e II, citomegalovírus, toxoplasmose, doença de Chagas e sífilis, além da eletroforese de hemoglobina (Agência Nacional de Vigilância Sanitária/Resolução da Diretoria Colegiada - ANVISA/RDC 153/2004). As amostras foram coletadas a partir de 2013 e o estudo finalizado em junho de 2018.

Isolamento e cultivo das células

Após a retirada do sangue, os cordões foram processados em nosso laboratório em até 4 horas após a coleta, de acordo com o protocolo publicado por Paladino et al.( As células da parede de cordão umbilical foram semeadas em frascos de cultura 25 ou 75cm2 (Corning, St. Louis, MO) contendo Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM-LG) suplementado com 20% soro fetal bovino (SFB), 1% antibiótico-antimicótico (penicilina 100 unidades/mL, estreptomicina 100μg/mL, anfotericina 250ng/mL e L-glutamina 2mM/mL) e mantidas em incubadora umidificada, com 5% de dióxido de carbono, a 37oC. As células foram armazenadas em nitrogênio líquido na passagem 3. Todos os reagentes, quando não explicitado, foram adquiridos de Gibco® (New Grand Island, EUA). Para obtenção das células na passagem 5 (p5) foram utilizadas duas amostras, e, para a expansão até a passagem 10 (p10), foi utilizada uma terceira amostra, obtida do mesmo cordão. Após o descongelamento, a cultura de todas as amostras passou a ser feita com o mesmo meio, mas com apenas 10% de SFB adicionado. Foram semeadas 4.000 células/cm2. O meio de cultura foi trocado a cada 48 horas. A passagem das células foi feita na confluência de 70%, utilizando solução de colagenase a 1% por 5 minutos. Na passagem 4, as células foram caracterizadas como CTM segundo os critérios estabelecidos pela International Society for Cellular Therapy (ISCT),( e o cultivo foi mantido até a passagem 10. Para o controle positivo na análise de p16, foi utilizada a linhagem HEK-293 (Human Embryonic Kidney 293), e, para o controle negativo, foi utilizada a linhagem MCF7 (Mammary Gland, Breast; Derived from Metastatic Site: Pleural Effusion), ambas obtidas do Banco de Células do Rio de Janeiro (Rio de Janeiro, Brasil). As mesmas células funcionaram como controles negativo e positivo para p21, respectivamente.

Esterilidade e detecção de micoplasma e exame microbiológico na cultura

Para a confirmação da ausência de microrganismos na cultura celular, após 48 horas, 750µl do sobrenadante foram coletados para análise microbiológica. A análise foi efetuada pelo Laboratório Clínico do Hospital Israelita Albert Einstein utilizando os métodos de Ziehl-Neelsen para bactérias de alta resistência, observação direta para fungos, além da análise bacterioscópica. A detecção de Mycoplasma foi feita por Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) usando anticorpos anti-Mycoplasma. Depois de certificada a ausência de microrganismos, as amostras foram congeladas ou mantidas em cultura para desenvolver os experimentos.

Caracterização imunofenotípica de células-tronco mesenquimais na passagem 3 e/ou 4

Segundo a ISCT, as CTM devem exibir perfil específico de expressão na superfície celular, que é positivo para CD105, CD73, CD44, CD29, CD166 e CD90, e negativo para marcadores hematopoiéticos (CD14, CD34, CD45, CD117, CD133), marcadores endoteliais (CD31, CD106, CD133 ) e molécula de superfície HLA-DR.( São três as exigências mínimas para classificar uma população de CTM. A primeira é sua separação com base em sua aderência seletiva, em cultura, à superfície do plástico; a segunda é de um conjunto de marcadores positivos e negativos analisados por citometria de fluxo; e a terceira é a capacidade de as células se diferenciarem em osteócitos, adipócitos e condrócitos. Essa caracterização foi feita nas células desse estudo por Paladino et al.(

As proteínas do lisado foram quantificadas pelo método de Pierce (BCA protein Assay Kit, Thermo Fisher, EUA) e separadas por eletroforese em gel de poliacrilamida 12%, por 1 hora 20 minutos, a 100V, em tampão de pH neutro contendo SDS (dodecil sulfato de sódio) a 1% (Invitrogen, EUA). Após a corrida, as proteínas contidas no gel foram transferidas para membranas de nitrocelulose Amersham (GE Healthcare Life Sciences, EUA) em tampão 20% metanol (Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha) por 1 hora, a 100V. As membranas foram incubadas em solução de bloqueio 5% albumina sérica bovina (BSA, Cell Signaling, EUA) por 1 hora e, em seguida, incubadas com o anticorpo primário p21 (1:1000 – Ab109520, Abcam, EUA) ou p16 (1:1000 – Ab108349, Abcam, EUA) em solução de BSA, por uma noite. Em seguida, a membrana foi lavada três vezes por 5 minutos com a solução de TBS-T (Tris-HCl, 24,23g, 80,06g NaCl e 0,1% Tween® 20) e, em seguida, incubada com o anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano (HRP) (1:2000, Cell Signaling, EUA) diluído em TBS-T + leite Molico 2% (Nestlé, Brasil), por 1 hora, em ambiente escuro, sob agitação lenta. Após nova lavagem por três vezes, a membrana recebeu a solução reveladora ECL Prime Western Blotting System (GE Healthcare Life Sciences, EUA). O produto quimioluminescente foi analisado no leitor Chemidoc (Bio-Rad, Hercules, EUA), revelando presença da banda proteica específica. A mensuração foi feita pelo programa Image Lab (Biorad, Hercules, EUA). Cada teste foi feito em duplicata.

Imunofluorescência indireta

Células em cultura foram transferidas para lamínulas circulares de vidro contidas em placas de 24 poços, semeadas na concentração de 4.000/cm2 e cultivadas até atingirem a confluência de 50% a 70%. Em seguida, foi retirado o meio de cultura, e as células foram lavadas com tampão fosfato-salina (PBS), por quatro vezes e fixadas com paraformaldeído 4%, por 10 minutos. Em seguida, as células foram lavadas com PBS e as membranas celulares, permeabilizadas com a solução de Triton-X 100 (detergente não iônico, Sigma-Aldrich, EUA) a 0,01%, diluído em PBS, por 15 minutos. Após lavagem com PBS, quatro vezes, em intervalos de 5 minutos, foi feito, nas células, o bloqueio de ligações inespecíficas com BSA a 1%, por 30 minutos. Após repetir a lavagem com PBS, as células foram incubadas por 24 horas com os anticorpos primários p16 (1:100 – Ab108349, rabbit anti-human Abcam, USA) ou p21 (1:100 –Ab109520, rabbit anti-human, Abcam, USA), mantidas em ambiente escurecido e úmido a 4°C. Após 24 horas, as células foram lavadas com PBS em intervalos de 5 minutos por três vezes e, em seguida, incubadas com o anticorpo secundário. Para a detecção do p16, utilizamos o anticorpo secundário diluído em BSA 1% (1:400, rabbit anti-human IgG (H+L), F(ab’)2 Fragment, Alexa Fluor® 555 Conjugate, Cell Signaling, EUA) e para p21 (rabbit anti-human IgG (H+L), F(ab’)2 Fragment, Alexa Fluor® 488 Conjugate, Cell Signaling, EUA), por 30 minutos, mantendo a membrana sob agitação leve, em temperatura ambiente e protegida da luz. Logo depois, as células foram lavadas com PBS, em intervalos de 5 minutos; a última lavagem das células fixadas foi feita com água destilada, e, imediatamente, as lamínulas dos poços foram recuperadas. As lamínulas foram mantidas protegidas da luz e em temperatura ambiente, até secarem por completo para receber a solução do reagente DAPI (VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI, Vector Laboratories, USA). As lâminas foram analisadas em um microscópio confocal de fluorescência (Zeiss confocal LSM 880, Alemanha), sendo feita a contagem das células em dez campos, em triplicata, independentemente do número de células. Calculou-se a média de intensidade de fluorescência (MIF) corrigida pelo número de células contadas. A fluorescência foi mensurada usando o programa ZEN lite (Zeiss, Alemanha).

Citometria de fluxo

Células em cultura foram recuperadas, lavadas com PBS 1X contendo BSA 1% e centrifugadas a 400g, por 5 minutos. Para a marcação da proteína p16, utilizamos 2x105 células/tubo, fixada com paraformaldeído a 4%, por 10 minutos, em temperatura ambiente. O teste foi realizado em triplicata, como no caso da IFI. Após a permeabilização celular incubando as células em PBS 1X + 0,1% Tween® 20 (Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha) por 20 minutos, a 4°C, foi feita lavagem adicionando novamente PBS contendo 0,1% Tween® 20, em temperatura ambiente. A suspensão de células foi, então, centrifugada a 400g, por 5 minutos. Para evitar ligações inespecíficas, adicionamos BSA 5% + 0,1% Tween® 20, por 15 minutos, a 4°C. As células foram lavadas novamente e centrifugadas para a marcação intracelular com o anticorpo monoclonal rabbit anti-human CDKN2A/p16INK4A (1:100, clone: EPR1473, Abcam, EUA). Após incubação por 30 minutos a 4°C, foram feitas a lavagem e a centrifugação, por duas vezes. Utilizamos o anticorpo secundário policlonal rabbit anti-human conjugado com PE (1:100, clone: Poly4064, Biolegend, USA), e as células foram incubadas, com lavagem e suspensão em PBS + 1% BSA para leitura no citômetro de fluxo BD FACSARIA (Becton Dickinson, San Jose, CA). Para a proteína p21, utilizamos o protocolo similar à marcação da proteína p16. A diferença residiu na fixação das células em metanol a 80%, a 4°C, seguida de incubação por 20 minutos a 4°C. Para essa marcação intracelular, utilizamos o anticorpo monoclonal rabbit anti-human p21 (1:100, clone: EPR 362, Abcam, EUA). Para análise dos resultados, foi utilizado o programa FlowJo (Treestar, Ashland, Oregon), sendo considerados os valores da MIF após contagem de 2x105 células/tubo.

Desenho experimental

A figura 1 mostra o desenho experimental empregado nesse estudo. É importante salientar que a comparação dos diversos métodos foi possibilitada pelo emprego concomitante das mesmas culturas celulares nos três métodos de escolha. Assim, em se tratando de culturas primárias, e não de linhagens já estabelecidas, esse desenho experimental visou possibilitar diferenciar uma taxa de proliferação baixa, mas normal, das células de uma possível cultura com células mais senescentes e, assim, com taxa de proliferação diminuída. O experimento completo foi repetido com quatro células diferentes, e os resultados estão descritos apenas qualitativamente.

Figura 1

Desenho experimental

CTM: células-tronco mesenquimais; WB: Western blotting; IFI: imunofluorescência indireta; CF: citometria de fluxo; p: passagem.

RESULTADOS

Western blotting mostrou a heterogeneidade da progressão individual para senescência replicativa

Como esperado, usando a técnica de WB, as proteínas p16 e p21 mostraram a progressão para a senescência replicativa. A mensuração das proteínas p16 e p21 por WB mostrou aumento de p16 e a diminuição de p21 na passagem 10 comparada à passagem 5 (Figuras 2 e 3, respectivamente), condizente com a expressão já observada em células mesenquimais senescentes de outras origens( e com o perfil heterogêneo nos diferentes cordões estudados.( Cada cultura de CTM apresenta alterações morfológicas típicas, com padrão de dobramento populacional distinto (Figura suplementar 1A), mas com o aumento citoplasmático (Figura suplementar 1B) previsto.

Figura 2

Western blotting da proteína p16 nas células-tronco mesenquimais (n=4) em passagem 5 e passagem 10. (A) intensidade da banda de p16 normalizada pela intensidade da banda de beta-actina para cada amostra. A barra vertical indica a variação nas medidas. (B) imagem das bandas de p16 na passagem 5. (C) imagem das bandas de beta-actina na passagem 5. (D) imagem das bandas de p16 na passagem 10. (E) imagem das bandas de beta-actina na passagem 10

p: passagem; CTM: célula-tronco mesenquimal.

Figura 3

Western blotting da proteína p21 nas células-tronco mesenquimais (n=4) em passagem 5 e passagem 10. (A) intensidade da banda de p21 normalizada pela intensidade da banda de beta-actina para cada amostra. A barra vertical indica a variação nas medidas. (B) imagem das bandas de p21 na passagem 5. (C) imagem das bandas de beta-actina na passagem 5. (D) imagem das bandas de p21 na passagem 10. (E) imagem das bandas de beta-actina na passagem 10

P: passagem; CTM: célula-tronco mesenquimal.

Figura suplementar 1. (A) Imagem por microscopia ótica de células isoladas de cordão de célula-tronco mesenquimal 81. Imagem por microscopia ótica de célula-tronco mesenquimal 81 em (B) passagem 5 e (C) passagem 10, mostrando células com volume aumentado e maior refringência, indicando a progressão para a senescência replicativa

CTM: célula-tronco mesenquimal; p: passagem.

Monitoramento por imunofluorescência de p16, mas não de p21, mostra padrão comparável ao Western blotting

A IFI, sendo um método semiquantitativo, foi adequado para acompanhamento de culturas, e não para medidas quantitativas, como as obtidas por WB. No entanto, a expressão da proteína p16 em passagem 10 analisada pela IFI estava aumentada em todas as amostras, com perfil de variação comparável ao obtido com WB (Figuras 4A e 4B).

Figura 4A

Intensidade média de fluorescência da proteína p16 nas células-tronco mesenquimais (n=4) em passagem 5 e passagem 10, analisadas por imunofluorescência indireta. A barra vertical indica a variação nas medidas

p: passagem; MIF: média de intensidade de fluorescência; CTM: célula-tronco mesenquimal.

Figura 4B

Intensidade de fluorescência da proteína p16 (em vermelho) nas células-tronco mesenquimais (n=4) em passagem 5 e passagem 10, analisadas por imunofluorescência indireta. Marcação dos núcleos com DAPI (em azul). (A) controle negativo usando anticorpo secundário; (B) célula-tronco mesenquimal 80 em p5; (C) célula-tronco mesenquimal 80 em p10; (D) célula-tronco mesenquimal 81 em p5; (E) célula-tronco mesenquimal 81 em p10; (F) célula-tronco mesenquimal 83 em p5, (G) célula-tronco mesenquimal 83 em p10; (H) célula-tronco mesenquimal 84 em p5; (I) célula-tronco mesenquimal 84 em p10

Por outro lado, a IFI da proteína p21 não demonstrou ser marcador fidedigno em comparação ao WB. Apenas duas das quatro células mostraram o mesmo comportamento, com a expressão da p21 maior na passagem 5 em relação à passagem 10 (Figura suplementar 2 e 3).

Figura suplementar 2. Intensidade média de fluorescência da proteína p21 nas células-tronco mesenquimais (n=4) em passagem 5 e passagem 10, analisadas por imunofluorescência indireta. A barra vertical indica a variação nas medidas

p: passagem; MIF: média de intensidade de fluorescência; CTM: célula-tronco mesenquimal.

Figura suplementar 3. Intensidade de fluorescência da proteína p21 (em verde) nas células-tronco mesenquimais (n=4) em passagem 5 e passagem 10, analisadas por imunofluorescência indireta. Marcação dos núcleos com DAPI (em azul). (A) controle negativo usando anticorpo secundário; (B) célula-tronco mesenquimal 80 em p5; (C) célula-tronco mesenquimal 80 em p10; (D) célula-tronco mesenquimal 81 em p5; (E) célula-tronco mesenquimal 81 em p10; (F) célula-tronco mesenquimal 83 em p5; (G) célula-tronco mesenquimal 83 em p10; (H) célula-tronco mesenquimal 84 em p5; (I) célula-tronco mesenquimal 84 em p10

Monitoramento por citometria de fluxo de p21, mas não de p16, é comparável ao Western blotting

Comparando a técnica de citometria de fluxo com WB, foi possível observar que a expressão da proteína p21 por citometria de fluxo apresentou comportamento semelhante (Figura 5) à análise feita por WB. Por outro lado, a expressão de p16 não mostrou os resultados esperados (Figura suplementar 4). Além disso, como a quantidade de células necessárias para a análise por citometria de fluxo foi maior do que para IFI, uma quarta amostra, que apresentou taxa de proliferação na passagem 10 já muito baixa, não permitiu que essa análise fosse feita.

Figura 5

Intensidade média de fluorescência da proteína p21 nas células-tronco mesenquimais (n=4) em passagem 5 e passagem 10, analisadas por citometria de fluxo. A barra vertical indica a variação nas medidas

p: passagem; MIF: média de intensidade de fluorescência; CTM: célula-tronco mesenquimal.

Figura suplementar 4. Intensidade média de fluorescência da proteína p16 nas células-tronco mesenquimais (n=4) em passagem 5 e passagem 10, analisadas por citometria de fluxo. A barra vertical indica a variação nas medidas

p: passagem; MIF: média de intensidade de fluorescência; CTM: célula-tronco mesenquimal.

DISCUSSÃO

Para efetuarmos uma comparação adequada das duas técnicas, IFI e citometria de fluxo, com WB, foram utilizadas células da mesma cultura de cada um dos cordões, e as comparações foram efetuadas simultaneamente. Apesar de ser ainda um estudo preliminar, os resultados indicaram que fazer o acompanhamento dos níveis de p16 em lâminas de IFI cultivadas em paralelo com cada amostra é uma abordagem interessante de seguimento de culturas de CTM. Essas culturas são de longa duração, com número significativo de passagens para alcançar a expansão necessária no número de células, e a análise em paralelo da evolução da cultura permite identificar aquelas CTM com maior risco de entrar em senescência replicativa.

Analisamos também a proteína p21, mas os resultados mostram que, mesmo na citometria de fluxo, o perfil dos dados seja comparável ao padrão-ouro WB, a necessidade de maior número de células extraídas diretamente da cultura, e não de uma lamínula cultivada em paralelo (no caso da IFI), torna a prática mais dificultada. Além disso, já foi descrito, em outras células, que os níveis de p21 diminuem gradualmente, à medida que os níveis de p16 aumentam.( Isso provavelmente decorre do fato do controle funcional dessa proteína se dar primordialmente pelo nível de fosforilação e pela compartimentalização intracelular nas diversas fases do ciclo celular. Várias semanas após as culturas de fibroblastos humanos atingirem a senescência, os níveis de p21 diminuem gradualmente, conforme os níveis de p16 aumentam.( Esses achados, e o fato de que o p21 não é induzido em células senescentes, deficientes em p53, e que têm tempo de vida replicativa prolongado,( sugerem que o p53 inicia a inibição dessa replicação celular, pelo menos em parte, induzindo p21. O aumento subsequente em p16, então, age para manter a parada do crescimento celular, levando à senescência. Assim, mesmo sendo o p21 um marcador de envelhecimento celular, seu monitoramento termina por ser mais complexo e fora do escopo desse nosso estudo. Por outro lado, a observação dos níveis de p21 por citometria de fluxo, empregando também anticorpos que medem o grau de fosforilação da proteína, pode tornar o monitoramento da progressão da senescência celular com p21 de utilidade para o pesquisador.

Há limitações claras em nosso estudo, pois foram testadas apenas quatro amostras de um único tipo de tecido e seria importante compará-las com outras CTM, por exemplo, de medula óssea e de tecido adiposo, para validar essa estratégia muito prática de avaliar a progressão da senescência nas culturas. Tradicionalmente, as células têm sua validação em termos de qualidade, marcadores celulares e capacidade proliferativa feita em passagens baixas (passagens 4 ou 5), e, nas fases finais prévias à aplicação terapêutica, são feitos apenas os controles microbiológico e citogenético. O grau de senescência, ou seja, a capacidade de proliferação das células não é avaliada antes da aplicação terapêutica. Assim, acreditamos ser possível fazer o seguimento do aumento intracelular de p16 nas etapas de expansão das culturas com vistas à terapia celular. Esse seguimento pode ser útil para avaliar melhor a efetividade das células do doador, que, ao lado dos fatores inerentes aos receptores, como a idade e o tipo e gravidade da doença de base, impactam no sucesso da terapia com CTM.

CONCLUSÃO

O seguimento de culturas celulares, por meio da imunofluorescência indireta de p16, permite identificar as culturas de células-tronco mesenquimais em risco de atingirem a senescência replicativa.