SARS-CoV-2 diagnostic testing alternatives for Latin America.

In the past four months SARS-CoV-2 has reached most countries in the world. Public health strategies based on widespread testing and proper isolation of positive cases have shown to be helpful to reduce local transmission of SARS-CoV-2. Confirmatory tests, that identify viral RNA, and screening serological tests that identify viral antigens or host antibodies against viral proteins are part of the tools that nations can use to fight infectious disease epidemics. Understanding how each test works can provide insights about their test characteristics and how they can be used for different clinical and public health goals. Testing is a key strategy to reduce viral transmission, not only for this epidemic, but also for others to come.

Remark

Introduction

In the past four months SARS-CoV-2 has reached most countries in the world. Countries have struggled to slow down its transmission with a common goal to avoid saturation of health care systems and reduce the economic impact of quarantines and other isolation measures. COVID-19 diagnostic testing is an important component of strategies to reduce transmission of SARS-CoV-2 . The world learned from experiences in Singapore, Taiwan, Hong Kong, and South Korea, where screening tests for the general population occurred, that widespread testing help reduce local transmission of SARS-CoV-2. Identification of positive cases can lead to proper timely isolation, adequate monitoring and quarantine of case contacts, and to the implementation of strategies to reduce transmission in health care centers/institutions were cases concentrate (e.g., closure and decontamination of high-risk areas) .

Confirmatory tests

SARS-CoV-2 infection confirmatory diagnosis is based on polymerase chain reaction (PCR) testing that amplifies and identify viral RNA sequences. In some cases PCR may not be able to detect viral RNA due to early onset of symptoms, issues with sampling and handling of samples, quality of the kit, or test performance . In these cases chest computed tomography has been suggested as a complementary diagnostic tool , . In January 2020, the WHO designed and started distributing a quantitative reverse-transcriptase-based PCR (RT-PCR) test for detecting SARS-CoV2 . To date, different RT-PCR assays, along with other SARS-CoV-2 diagnostic assays, are available , with other tests kits being developed.

RT-PCR testing usually takes 4 to 6 hours to complete, it is complex and requires a high level of laboratory expertise. In addition, RT-PCR is expensive (compared to serological testing) and requires high-level personnel training to obtain and process patient samples, usually lower respiratory tract samples with higher and more prolonged levels of viral RNA, which are more difficult to obtain . Because of these complexities, RT-PCR testing is usually centralized in specialized laboratories. However, testing centralization slows down the identification of cases, as it requires special handling and shipping of clinical samples from regions to the laboratories in major cities. For example, evidence shows that centralized PCR testing in Colombia, at the Instituto Nacional de Salud, during the first weeks of transmission of SARS-CoV-2 in the country lead to important delays (up to 11 days) to obtain confirmatory diagnoses . This slowed down reaction times to conduct public health measures across regions.

Alternatively, new developments in rapid and automated point-of-care RT-PCR assays (although more costly due to equipment and reagent kits costs) can provide tests results in minutes. For example, the Xpert® Xpress SARS-CoV-2 test (Cepheid) targets multiple regions of the viral genome and can provide results in 45 minutes using the GenXpert benchtop system. Also, the recent developed Abbott ID NowTM COVID-19 test uses isothermal nucleic acid amplification technology and provides positive results in just 5 minutes . Tests are run in the ID NOW, a small, lightweight and portable platform that can be used in wide range of healthcare settings. To date, the Abbott ID NowTM COVID-19 test is only available in the United States (50,000 tests are being produced every day), but is expected that it will soon be available in other countries.

Antigen testing

Monoclonal antibodies against SARS-CoV-2 antigens, such as the nucleocapsid (N) protein and the S1 or S2 domains of the spike (S) protein, can also be used to detect viral infection . Antigen testing is performed in lateral flow immunoassays using nasopharyngeal or oropharyngeal swab samples . An advantage of antigen testing is that they are available in rapid test kits that are easy to use and can provide results in 20-60 minutes. However, given that they do not replicate viral RNA sequences, there is concern about their sensitivity (sensitivity is the ability of a test to identify correctly those with the infection, compared to a gold standard, such as RT-PCR) (Appendix 1) . Also, the development on monoclonal antibodies requires more time than that to develop other tests (e.g., antibody testing), and although promising, accurate tests to identify SARS-CoV-2 antigens are not yet available , .

Appendix 1

Characteristics of a test: In this example the serological tests is compared to PCR, the gold standard.

		PCR
		Positive	Negative
Serological immunoassay	Positive	a	b
	Negative	c	d

Sensitivity: Is the ability of the test to identify correctly those who have the disease/infected. The sensitivity varies by disease stage: for example, it may take several days after infection to develop antibodies against viral proteins, therefore individuals in early stages of disease may test negative in serological tests (false negative). = a/(a+c)

Specificity: Is the ability of the test to identify correctly those who do not have the disease/not infected. The specificity is affected by the presence, in blood samples, of antibodies against proteins from other viruses that cross-react in serological immunoassays for SARS-CoV-2. = d/(b+d)

Positive predictive value: Is the proportion of patients with the disease/infected among those with a positive result in the test. The positive predictive value is affected by the prevalence of disease/infection in the population. = a/(a+b)

Negative predictive value: Is the proportion of patients without disease/not infected among those with a negative result in the test. The negative predictive value is affected by the prevalence of disease/infection in the population. = d/(c+d)

Antibody serological immunoassays

Serological immunoassays are a low-cost alternative that can be widely used at the community level, and that can provide results in 15 to 20 minutes. Serological immunoassays (including rapid lateral flow immunoassay, automated chemiluminescence immunoassay and manual ELISA) use immobilized recombinant viral proteins/domains of viral proteins to which human antibodies bind if present in the blood. A positive test indicates that the person has antibodies against the virus, offering an indirect measure of past/current viral infection . Because blood samples (including blood from finger pinprick) can be used in these tests, it requires less intensive training to obtain and process samples, and to interpret results. To date, multiple serological test strips, for Immunoglobulin M (IgM) and G (IgG), are available in the market (many more are in the development/certification process), and are being approved for use in different countries , , .

Serological immunoassays are considered screening rather than confirmatory tests. Because they measure antibodies in patients’ blood, plasma or serum, their sensitivity can vary greatly across disease stages. It is known that antibody response can take several days , for example IgM against SARS-CoV-2 can be first detected, on average, from 5 to 10 days, after the onset of symptoms, and IgG around 10 days after onset of symptoms (Figure 1) . This causes the sensitivity of serological tests to be lower in initial stages of the disease, with a number of those infected with the virus testing negative (false negatives). However, the sensitivity increases as the body produces antibodies against the virus, leading to a reduction in false negatives.

Figure 1

Testing windows for SARS-CoV-2 and antibodies

In addition, some individuals exposed to other coronaviruses, but not to SARS-CoV-2, may test positive for SARS-CoV-2 in serological immunoassays (false positives). This occurs because patients’ antibodies against viral proteins from other coronavirus can also bind to SARS-CoV-2 proteins used in these tests.

Testing sensitivity and specificity of serological immunoassays vary across available kits. For example, a study shows that the overall testing sensitivity of the COVID-19 IgM/IgG Rapid Test , which simultaneously tests for both IgM/IgG, was 88.66% and the specificity 90.63%, when using blood samples from 397 PCR confirmed cases and 128 negative patients . Recent developed rapid lateral flow immunoassay kits also claim to have high sensitivity (97.2%-100%) and specificity (98-100%) for IgG, but lower sensitivity (85-91.8%) and high specificity (96%-100%) for IgM - , although this evidence is not supported by published studies. A recent study conducted in the United States shows evidence of the sensitivity and specificity of different commercial kits . Detailed information on available serological immunoassays for SARS-CoV-2 is available elsewhere , , .

Despite the described limitations of serological immunoassays, adding serological tests to the diagnostic toolbox, along and not instead of RT-PCR, is paramount to confront the epidemic, especially considering the complexity of PCR procedures and the common shortages of supplies of key reagents to run these tests . Serological testing can help screen presumptive cases for isolation purposes, but it can also help those with immunity to the virus to leave their homes, get back to work and take care/help others in need. Serologic immunoassays are also useful for ongoing surveillance and studies on vaccine effectiveness . Individuals who are immune to the virus, with detectable antibodies against SARS-CoV-2, could also provide plasma to treat patients, as some studies demonstrate this type of treatment may improve health outcomes in patients with severe respiratory symptoms , .

In conclusion, multiple available protocols and kits provide solutions to diagnose SARS-CoV-2 infection. Testing is a key strategy to reduce viral transmission, not only for this pandemic, but also for others to come. Countries can be prepared to fight epidemics if they design or acquire appropriate tools to rapidly identify cases of infection, to then conduct appropriate clinical and public health actions that can minimize the burden that high-transmissible and deadly pathogens pose on human populations.

Contribución del estudio

Introducción

En los últimos cuatro meses, la infección por SARS-CoV-2 se ha presentado en la mayoría de países del mundo. Los gobiernos han intentado frenar su transmisión con el objetivo común de evitar la saturación de los sistemas de salud y reducir el impacto económico de las cuarentenas y otras medidas de aislamiento. En este sentido, las pruebas de diagnóstico para el virus se presentan como un importante componente de las estrategias para reducir su transmisión . El mundo ha reconocido que las estrategias de Singapur, Taiwán, Hong Kong y Corea del Sur, de realizar tempranamente pruebas diagnósticas en la población general puede ayudar a controlar la transmisión. La identificación temprana de casos positivos puede conducir a un aislamiento oportuno y adecuado, a realizar cuarentenas y monitoreo de los contactos de casos confirmados, y a la implementación de estrategias para reducir la transmisión en los centros de salud donde los casos se concentran (por ejemplo, cierre y descontaminación de áreas de alto riesgo) .

Pruebas confirmatorias

El diagnóstico confirmatorio de infección por SARS-CoV-2 se basa en pruebas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) que amplifican e identifican secuencias de ARN virales. En algunos casos, la PCR puede no detectar ARN viral debido a la aparición temprana de síntomas, problemas con el muestreo y manejo de muestras, la calidad del kit o el rendimiento general de la prueba . En estos casos, la tomografía computarizada de tórax se ha sugerido como una herramienta de diagnóstico complementaria ,. En enero de 2020, la OMS diseñó y comenzó a distribuir una prueba cuantitativa de PCR basada en transcriptasa inversa (RT-PCR) para detectar la infección por SARS-CoV2 . A la fecha, están disponibles diferentes protocolos de RT-PCR, así como otras pruebas de diagnóstico para SARS-CoV-2 ,.

Aunque las pruebas de RT-PCR son rápidas, generalmente el proceso dura de 4 a 6 horas, estas tienen un alto grado de complejidad y se requiere un alto nivel de entrenamiento en laboratorio. Además, la RT-PCR es costosa (en comparación con las pruebas serológicas) y requiere capacitación de personal de alto nivel para obtener y procesar muestras de pacientes, generalmente muestras del tracto respiratorio inferior con niveles más altos y prolongados de ARN viral, que son más difíciles de obtener . Debido a esto, las pruebas de RT-PCR generalmente se encuentran centralizadas en laboratorios especializados. Sin embargo, la centralización de las pruebas reduce la velocidad de identificación de casos, debido al tiempo que toma el envío de muestras clínicas desde las regiones a los laboratorios de las grandes ciudades. Por ejemplo, en Colombia, la centralización de estas pruebas en el Instituto Nacional de Salud en Bogotá durante las primeras semanas de transmisión del SARS-CoV-2 en el país produjo retrasos importantes (hasta de 11 días) en la identificación de casos . Esto generó demoras en los tiempos de reacción y de implementación de medidas de salud pública en las regiones.

Como alternativa, existen nuevos desarrollos de pruebas automatizadas de RT-PCR para los puntos de atención de salud, que aunque más costosos debido a la necesidad de equipos y reactivos, pueden proporcionar resultados en minutos. Por ejemplo, la prueba Xpert® Xpress SARS-CoV-2 (Cepheid) , la cual se puede usar con el equipo GenXpert, identifica múltiples regiones del genoma viral y puede proporcionar resultados en 45 minutos. Adicionalmente, el reciente desarrollo de Abbott, el ID NowTM COVID-19, utiliza tecnología de amplificación de ácido nucleico isotérmico y proporciona resultados en 5 minutos . Este desarrollo se puede usar con el equipo ID NOW, una plataforma pequeña, ligera y portátil que se puede utilizar en puntos de atención de salud. Hasta la fecha, la prueba Abbott ID NowTM COVID-19 solo está disponible en los Estados Unidos (se producen alrededor de 50,000 por día), pero se espera que pronto esté disponible en otros países.

Inmunoensayos para detección de antígenos

Los anticuerpos monoclonales contra antígenos del SARS-CoV-2, por ejemplo la proteína de nucleocápside (N) y los dominios S1 o S2 de la proteína espiga (S), se pueden usar para detectar infección viral . La prueba de antígeno se realiza en inmunoensayos de flujo lateral utilizando muestras de material nasofaríngeo u orofaríngeo . Una de las ventajas de las pruebas de antígeno es que están disponibles en kits rápidos que son fáciles de usar y pueden proporcionar resultados en 20-60 minutos. Sin embargo, dado que no replican secuencias de ARN virales, existe preocupación por una posible baja sensibilidad de la prueba (la sensibilidad es la capacidad de una prueba para identificar correctamente a aquellos con la infección, comparada contra una prueba reina o “gold standard”, como el RT-PCR) (Anexo 1) . Adicionalmente, el desarrollo de anticuerpos monoclonales requiere más tiempo que otras pruebas (por ejemplo, pruebas de detección de anticuerpos) y, aunque prometedoras, aún no se dispone de pruebas validadas para identificar antígenos de SARS-CoV-2 ,.

Anexo 1

Características de una prueba diagnóstica: en este ejemplo, las pruebas serológicas se comparan con PCR, la prueba reina (gold standard).

		PCR
		Positivo	Negativo
Inmunoensayo serológico	Positivo	a	b
	Negativo	c	d

Sensibilidad: es la capacidad de la prueba para identificar correctamente a aquellos que tienen la enfermedad / infectados. La sensibilidad varía según la etapa de la enfermedad: por ejemplo, puede tardar varios días, después de la infección, el desarrollar anticuerpos contra el virus, por lo tanto, en las primeras etapas de la enfermedad los individuos pueden tener resultados negativos en las pruebas serológicas (falsos negativos). = a/(a+c)

Especificidad: es la capacidad de la prueba para identificar correctamente a aquellos que no tienen la enfermedad / no están infectados. La especificidad se ve afectada por la presencia, en muestras de sangre, de anticuerpos contra proteínas de otros virus que reaccionan de forma cruzada en inmunoensayos serológicos para SARS-CoV-2. = d/(b+d)

Valor predictivo positivo: es la proporción de pacientes con la enfermedad / infectados entre aquellos con un resultado positivo en la prueba. El valor predictivo positivo se ve afectado por la prevalencia de enfermedad / infección en la población. = a/(a+b)

Valor predictivo negativo: es la proporción de pacientes sin enfermedad / no infectados entre aquellos con un resultado negativo en la prueba. El valor predictivo negativo se ve afectado por la prevalencia de enfermedad / infección en la población. = d/(c+d)

Inmunoensayos para detección de anticuerpos

Los inmunoensayos serológicos son una alternativa de bajo costo que puede ser ampliamente utilizada a nivel poblacional y que puede proporcionar resultados en 15 a 20 minutos. Estos inmunoensayos (incluyendo los de flujo lateral rápido, inmunoensayo de quimioluminiscencia automatizado y ELISA manual) utilizan proteínas virales recombinantes / dominios de proteínas virales a las que se unen los anticuerpos humanos, en el caso que estén presentes en la sangre. Una prueba positiva indica que la persona tiene anticuerpos contra el virus, lo que ofrece una medida indirecta de infección previa o activa en la persona . Debido a que solo se necesita una pequeña muestra de sangre en estas pruebas y se cuenta con dispositivos de fácil identificación de resultados, no es necesario un alto nivel de entrenamiento para obtener y procesar las muestras, ni tampoco para interpretar los resultados. A la fecha, varios dispositivos serológicos, para inmunoglobulina M (IgM) y G (IgG), están disponibles en el mercado (muchos más están en proceso de desarrollo / certificación) y están siendo aprobadas para su uso en diferentes países ,,.

Los inmunoensayos serológicos se consideran pruebas de tamizaje, más que en pruebas confirmatorias. Debido a que identifican anticuerpos en sangre, plasma o suero de personas, su sensibilidad puede variar según los estadios de la enfermedad. Se conoce que la producción de anticuerpos puede tomar varios días , por ejemplo, la IgM contra SARS-CoV-2 puede detectarse, en promedio de 5 a 10 días después del inicio de los síntomas, y la IgG alrededor de 10 días después del inicio de los síntomas (Figura 1) . Esto hace que la sensibilidad de las pruebas serológicas sea menor en las etapas iniciales de la enfermedad, y que algunas personas infectadas con el virus puedan tener un resultado negativo (falsos negativos). Sin embargo, la sensibilidad de la prueba aumenta a medida que el cuerpo produce anticuerpos contra el virus, lo que lleva a una reducción de los falsos negativos.

Figura 1

Tiempos de detección de anticuerpos y ARN viral de SARS-CoV-2:

Adicionalmente, las personas que han tenido infecciones previas con otros coronavirus, pero no con SARS-CoV-2, pueden tener un resultado positivo en pruebas serológicas diseñadas para SARS-CoV-2 (falsos positivos). Esto ocurre porque los anticuerpos producidos por la persona contra proteínas virales de los otros coronavirus también pueden unirse a las proteínas del SARS-CoV-2 utilizadas en las pruebas para este virus.

La sensibilidad y especificidad de los inmunoensayos serológicos varían según los kits disponibles en el mercado. Por ejemplo, un estudio muestra que la sensibilidad de la prueba rápida COVID-19 IgM / IgG , que identifica simultáneamente IgM / IgG, es del 88,66% y la especificidad del 90,63%, estimadas en un estudio con 397 casos confirmados por PCR y 128 pacientes si infección . Los kits de inmunoensayo de flujo lateral rápido desarrollados recientemente también muestran tener alta sensibilidad (97.2%-100%) y especificidad (98-100%) para IgG, pero menor sensibilidad (85-91.8%) y alta especificidad (96% -100%) para IgM ,; sin embargo esta información no está respaldada por estudios publicados. Un estudio realizado en Estados Unidos ofrece evidencia de la sensibilidad y especificidad de diferentes kits comerciales. La información detallada sobre los inmunoensayos serológicos para SARS-CoV-2 puede encontrarse en diferentes repositorios disponibles en internet , ,.

A pesar de las limitaciones descritas para los inmunoensayos serológicos, incluir estas pruebas en el arsenal para enfrentar la epidemia, junto con y no en lugar de RT-PCR, es clave y oportuno, especialmente teniendo en cuenta la complejidad de los procedimientos y las limitaciones en el suministro de reactivos para las pruebas de PCR . Las pruebas serológicas pueden ayudar a identificar posibles casos de infección para facilitar el aislamiento focalizado preventivo, así como identificar personas con anticuerpos que pueden volver a trabajar o a cuidar / ayudar a otros que necesitan cuidados especiales. Los inmunoensayos serológicos también pueden ser útiles para la vigilancia continua y para hacer estudios sobre la efectividad de vacunas . Las personas que son inmunes al virus, que tienen anticuerpos contra el SARS-CoV-2, también podrían proporcionar plasma para tratar a pacientes con sintomatología severa, un tratamiento que puede mejorar los resultados de salud en estos pacientes ,.

En conclusión, los protocolos y pruebas diagnósticas proporcionan soluciones para diagnosticar la infección con SARS-CoV-2. Las pruebas diagnósticas son una estrategia clave para reducir la transmisión del virus, no solo en esta pandemia, sino también en las siguientes que puedan originarse. Los países pueden estar mejor preparados para combatir nuevas epidemias si diseñan / obtienen las herramientas adecuadas para la rápida identificación de casos de infección, y para la implementación de acciones de salud pública que puedan minimizar el impacto de estos agentes, altamente transmisibles y letales, en las poblaciones humanas.

1. Why was this study conducted?

To provide a summary of available diagnostic tests for SARS-CoV-2 for a better understanding and use of these tests.

2. What were the most relevant results of the study?

We describe the different tests that identify viral RNA, viral antigen, and host antibodies against viral antigens; what these tests are useful for and their characteristics.

3. What do these results contribute?

This is a summary of diagnostic tests for SARS-CoV-2 that can be used to get a better understanding of the different tests and protocols available for SARS-CoV-2.

1) ¿Porqué se realizó este estudio?

Para proporcionar una descripción de las pruebas de diagnóstico disponibles para SARS-CoV-2 que permita comprender como funcionan y para qué son útiles estas pruebas

2) ¿Cuáles fueron los resultados más relevantes de este estudio?

Se describen las diferentes pruebas que identifican el ARN viral, antígenos virales y anticuer pos del huésped contra los antígenos virales; para qué son útiles estas pruebas y sus caracter ísticas

3) ¿Cuál es la contribución de estos resultados?

Este es un resumen acerca de las pruebas de diagnóstico para SARS-CoV-2 que se puede utilizar para comprender mejor las diferentes pruebas y protocolos disponibles para SARS-CoV-2.