Association of Cardiovascular Risk Factors and APOE Polymorphism with Mortality in the Oldest Old: A 21-Year Cohort Study.

BACKGROUND: Knowledge of environmental and genetic factors for healthy aging in elderly people is controversial. In addition to this evidence, few studies have been designed for this population.
OBJECTIVES: To investigate the relationship between the most frequent apolipoprotein E (APOE) genotypes and mortality in very elderly individuals living in a community and to evaluate survival according to cardiovascular risk factors.
METHODS: A sample of 74 elderly individuals aged ≥ 80 years, from the Veranópolis Project cohort, was selected for APOE genotyping. At baseline, anthropometric variables, glucose and lipid levels, blood pressure, and lifestyle variables (smoking, alcohol consumption, and physical activity) were collected. The Bayer Activities of Daily Living Scale was applied to their caregivers. Total study follow-up was 21 years. Two-sided p < 0.05 was considered statistically significant.
RESULTS: There was no association between APOE genotypes and mortality. However, the risk of death in elderly smokers was 2.30 times higher (hazard ratio [HR], 95% CI 1.01 to 5.24); in individuals with diabetes, it was 3.95 times higher (HR, 95% CI 1.27 to 12.30) than in individuals without diabetes. Subjects who practiced vigorous physical activity had a 51% reduction in risk of death (HR = 0.49, 95% CI 0.27 to 0.88). For an increase of 1 mmHg in systolic blood pressure, there was a 2% reduction (HR = 0.98, 95% CI 0.97 to 0.99) in risk of death.
CONCLUSION: In this sample population, APOE genotypes were not associated with mortality. However, classic cardiovascular risk factors may be important for overall mortality in the very elderly.

Introdução

O rápido crescimento da população idosa em todo o mundo desperta o interesse e a necessidade de estudos sobre os fatores para alcançar uma longevidade com qualidade de vida. Dados de mortalidade em idosos com mais de 80 anos mostram que as doenças cardiovasculares (DCV) representam metade das causas de óbito. Apesar da frequência de doenças crônicas, como as cardiovasculares ou demências, aumentarem com a idade, idosos acima dos 80 anos, em geral, são excluídos dos estudos bem controlados ou são analisados como subgrupos. Quando incluídos, surgiram resultados diferentes dos encontrados para idosos jovens (60 a 74 anos), como maior mortalidade associada à diminuição da pressão diastólica ou da pressão sistólica, e à redução do colesterol, ou ainda, um efeito protetor relacionado a um índice de massa corporal (IMC) acima de 30 kg/m2. No entanto, outros fatores de risco como tabagismo e diabetes mellitus (DM) tiveram associação semelhante mesmo em idades mais avançadas. De outra forma, um fator genético extensamente estudado, o polimorfismo da apolipoproteína E (APOE), mais especificamente o alelo ε4, mostrou-se como fator de risco para demência de Alzheimer em adultos e idosos jovens., Entretanto, resultados de uma coorte específica de idosos longevos identificaram um efeito paradoxal do alelo ε2 da APOE associado a um aumento da doença de Alzheimer (DA) por critérios neuropatólogicos post mortem. Estudos de metanálises mostraram que os portadores do alelo ε4 da APOE apresentam maior risco de DCV., No entanto, não existem estudos que indiquem se esta associação se mantém na faixa etária dos longevos. Por este panorama, o objetivo deste estudo é investigar a relação entre os genótipos mais frequentes da APOE e a mortalidade em indivíduos longevos e descrever a sobrevida conforme os genótipos e a exposição a fatores de risco cardiovascular clássicos.

Métodos

Delineamento

Estudo de coorte prospectivo

População Investigada

A coorte do Projeto Veranópolis iniciou em 1994 com dois critérios abrangentes de elegibilidade: (1) idade igual ou superior a 80 anos e (2) residência no domínio territorial do município de Veranópolis, RS, Brasil. O recrutamento dos idosos elegíveis ocorreu em 1994, 1996 e 1998. Brevemente, o primeiro recrutamento aconteceu durante o mês de julho de 1994 através de um convite informal do coordenador da pesquisa aos participantes de uma cerimônia religiosa. Espontaneamente, os presentes inscreveram-se e comunicaram aos seus próximos. Durante três semanas do mês de julho de 1994, os pesquisadores visitaram 100 idosos em suas próprias residências ou em centros comunitários. Em 1996, com uma estrutura formalizada e por divulgação em emissora de rádio local, mais 129 idosos consentiram em participar do estudo e os que já haviam participado em 1994 foram reavaliados. Em 1998, uma amostra aleatória simples dos participantes dos anos anteriores e mais 13 voluntários novos fizeram a genotipagem da APOE e os principais testes das avaliações pregressas. Assim, 242 indivíduos constituíram a coorte do Projeto Veranópolis. Número que perfez 87,4% dos idosos com 80 anos ou mais residentes no município entre os anos de 1994 e 1998.

Durante 2011 e 2012, o status vital dos idosos amostrados para a genotipagem da APOE (74 indivíduos) foi verificado, através de visitas domiciliares e, nesta oportunidade, também, aplicou-se o questionário da Escala Bayer de Atividades da Vida Diária (B-ADL) aos cuidadores dos idosos.

Em dezembro de 2012, 18 anos após o início da coorte, haviam 11 longevos vivos de um total de 242 idosos. Os resultados apresentados neste manuscrito referem-se a um período após a verificação do status vital de 2011 a 2012, ou seja, após a ocorrência do desfecho mortalidade de todos os participantes da coorte de longevos, ocorrido em 2015.

O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal do Rio Grande do Sul. Todos os participantes e/ou seus familiares assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido.

Variáveis

Utilizaram-se nesta avaliação da coorte de Veranópolis os genótipos da APOE (rs7412 e rs429358) como variável preditora, um fator genético analisado em dois momentos durante o seguimento: (1°) em 1998 e (2°) em 2011, todos os indivíduos vivos que não haviam sido amostrados em 1998, ou seja, mais 9 idosos (metodologia descrita em Alvim et al. (Ver Anexo Fluxograma)

O desfecho definido neste estudo foi mortalidade por DCV crônica incluída nos códigos I00-I99 ou por demência incluída nos códigos F00-F03 da décima revisão da Classificação Estatística Internacional de Doenças e Problemas Relacionados à Saúde (CID-10). Para a definição da causa mortis do indivíduo idoso, foram apresentadas as segundas vias das certidões de óbito a dois profissionais médicos, um geriatra e outro cardiologista, que estiveram cegados entre si e com relação aos genótipos dos falecidos. Nos casos de divergência entre os profissionais com relação à causa do óbito, foi solicitada a avaliação por um terceiro profissional. O diagnóstico final, em caso de impasse, foi definido por consenso dos três profissionais. Quando não foi possível definir a causa de morte apenas pelo documento, foram levantados dados de prontuários e entrevistas com os médicos das famílias ou com os familiares do idoso falecido.

A coorte do Projeto Veranópolis é um estudo amplo de variáveis que busca respostas para a longevidade peculiar desta população. Dentre as diversas variáveis investigadas na coorte, selecionou-se para este estudo aquelas que são descritas como fatores de risco clássicos para as DCV e, que poderiam estar associadas de forma independente ao desfecho estudado: hipertensão arterial, obesidade, DM, dislipidemia, tabagismo, abuso do álcool e inatividade física. Dados destas variáveis foram coletados na linha de base do ano de inclusão do idoso na coorte (1994, 1996 ou 1998). Os dados basais coletados em 1994 foram reavaliados em 1996. Em 1998, repetiu-se a coleta dos dados de uma amostra aleatória de idosos dos anos de 1994 e 1996 e mais 13 indivíduos incluídos na coorte. Na análise dos dados deste estudo utilizou-se as informações coletadas no ano da entrada do idoso na coorte.

Sucintamente, os métodos utilizados na mensuração dos fatores de risco cardiovasculares e as justificativas da categorização, quando aplicáveis, foram descritos a seguir. A pressão arterial (PA) foi obtida utilizando-se de um esfignomanômetro de mercúrio (Erka, Germany). Foram tomadas duas ou três medidas, conforme a variabilidade, aguardando-se o intervalo recomendado pelas diretrizes e fez-se a média ponderada. Para a análise dos dados, a PA foi utilizada como variável quantitativa e categorizada, sendo considerado o indivíduo hipertenso quando PA ≥ 140/90 mmHg ou em uso de medicamento anti-hipertensivo. Ainda, avaliou-se a pressão de pulso, resultado da subtração pressão arterial sistólica (PAS) − pressão arterial diastólica (PAD).

A obesidade foi definida pelo IMC, sendo o peso medido com os participantes minimamente vestidos, sem sapatos, utilizando-se de uma balança mecânica de contrapeso (Filizolla, São Paulo). A estatura foi determinada em pé, sem sapatos, utilizando-se de fita métrica, quando os ombros estavam em uma posição normal. Para a análise dos dados, o IMC foi utilizado como variável contínua e categórica, com definição de obesidade e excesso de peso pelos pontos de corte ≥ 30 kg/m2 (Organização Mundial da Saúde – OMS) e > 27 kg/m2 (Lipschitz), respectivamente.

Nas avaliações bioquímicas do perfil lipídico e da glicemia, foram coletadas amostras de sangue venoso, após 12h de jejum. Utilizou-se o sistema de venóclise com aparato descartável a vácuo (Vacutainer) em tubos sem anticoagulante. As dosagens plasmáticas foram realizadas através de técnica manual de reação enzimática colorimétrica com padrões de calibração e amostras em duplicata. DM foi definido como glicemia de jejum ≥ 126 mg/dL ou em uso de medicação hipoglicemiante. A dislipidemia foi avaliada através das dosagens plasmáticas de triglicerídeos (TG), colesterol total (CT), colesterol da lipoproteína de alta densidade ou high density lipoprotein (HDL-C) e do cálculo do colesterol da lipoproteína de baixa densidade ou low density lipoprotein (LDL-C), sendo utilizadas como variáveis quantitativas e categorizadas de acordo com os critérios da V Diretriz Brasileira de Dislipidemias e Prevenção da Aterosclerose e das Diretrizes da Associação Americana de Endocrinologia para Tratamento das Dislipidemias e Prevenção da Aterosclerose: TG ≥ 150 mg/dL; CT ≥ 200 mg/dL; HDL-C < 50 mg/dL para mulheres e < 40 mg/dL para homens; LDL-C ≥ 160 mg/dL. O LDL-C foi obtido através da fórmula de Friedwald, para valores de TG inferiores a 400 mg/dL.

As variáveis de estilo de vida - tabagismo, abuso de álcool e inatividade física - foram obtidas através de um questionário padronizado aplicado na linha de base. O tabagismo foi avaliado através do relato do consumo ou não de tabaco (cigarro, palheiro, cachimbo). Considerou-se dois grupos: 1) não tabagistas: indivíduos que nunca fumaram; 2) tabagistas ou ex-tabagistas. O abuso do álcool foi avaliado através do relato da quantidade de álcool ingerido por semana, sendo considerado uso abusivo valores > 210 g/semana para homens e > 105 g/semana para mulheres. A inatividade física foi avaliada através do relato das atividades diárias durante uma semana normal de trabalho e lazer. Utilizou-se dois diferentes pontos de corte: < 2.000 kcal/semana, e < 4.000 kcal/semana, por serem quantidades mínimas de atividade física para alcançar benefícios cardiovasculares importantes como atenuação do espessamento da camada íntima-média das artérias carótidas, aumento do HDL-C e redução da mortalidade em pacientes com doença arterial coronariana. O instrumento utilizado para reportar as diferentes atividades físicas constituiu-se de uma lista de 27 atividades habituais da rotina de pessoas campesinas e citadinas e mais uma pergunta aberta sobre outra atividade além das pré-selecionadas. Solicitou-se aos participantes do estudo que reportassem o tempo gasto em minutos e a frequência semanal para desenvolver tais atividades. Seguindo o mesmo caminho de outros estudos de idosos longevos, optamos pela utilização do gasto energético calculado em quilocalorias por semana (kcal/sem) que considera o peso do participante, o tempo de atividade referido, os metabolic equivalents (MET) da atividade específica e a frequência semanal das atividades: Gasto energético (kcal/sem) = MET X Peso (Kg) X Tempo da atividade (minutos) / 60 X frequência semanal. Deste modo, julgamos que essa medida reflete melhor o gasto energético do idoso longevo da comunidade estudada (rural e urbana) do que a simples mensuração dos METs, usualmente descrita nos trabalhos atuais.

A B-ADL foi aplicada, por um pesquisador treinado e cegado com relação aos genótipos dos idosos, aos seus cuidadores no período de agosto de 2011 a dezembro de 2012. O instrumento foi empregado como forma de identificar casos de demência e o resultado utilizado como variável confundidora em potencial, uma vez que está bem descrito que o alelo ε4 da APOE é um fator de risco para o desenvolvimento da DA., O escore obtido com a B-ADL varia de 1,00 a 10,00 e representa maior dificuldade nas atividades da vida diária quanto maior a pontuação. Para a análise dos dados, o escore da B-ADL foi utilizado como variável quantitativa e categorizada, utilizando o ponto de corte ≥ 3,12 para definição dos casos de demência.

Análise Estatística

As variáveis quantitativas foram descritas por média e desvio padrão ou mediana e amplitude interquartílica. Para a comparação entre os grupos utilizou-se o teste t-Student para amostras independentes (teste de normalidade de Shapiro-Wilk) e, em caso de assimetria, o teste de Mann-Whitney. As variáveis qualitativas foram descritas através de frequências absolutas e relativas. Na comparação de proporções entre os grupos, o teste qui-quadrado de Pearson ou exato de Fisher foi aplicado. Utilizaram-se o método de estimação da curva por Kaplan-Meier para avaliar o tempo de sobrevida e o teste qui-quadrado de log-rank para a comparação entre os grupos.

Para controlar fatores de confusão em relação ao óbito, utilizou-se o modelo de azares proporcional de Cox. Como medida de efeito, foi calculada a razão de densidades de incidência (hazard ratio [HR]), com seus respectivos intervalos de 95% de confiança (IC 95%). O critério para a entrada da variável no modelo multivariado foi de que apresentasse um valor p < 0,20 na análise univariada.

O nível de significância adotado foi de 5% (p < 0,05) e os dados foram analisados com o programa Statistical Package for the Social Sciences, versão 21.0.

Resultados

Neste trabalho, a amostra de 74 indivíduos da coorte de Veranópolis teve uma mediana de tempo de seguimento de 9 anos (P25 – P75: 6 – 14), com variação entre 0,6 e 21 anos. Salienta-se que não houve perdas de seguimento desta amostra. Com base no relato dos idosos, 94,6% eram descendentes de imigrantes italianos. A frequência gênica (alelos) da APOE presente na amostra foi: 4,1% ε2; 85,1% ε3 e 10,8% ε4. E a frequência genotípica: 1,4% E2E2; 5,4% E2E3; 71,6% E3E3 e 21,6% E3E4. A distribuição genotípica está em equilíbrio de Hardy-Weinberg (χ = 0,07; grau de liberdade = 1; p = 0,79). Não foram observados portadores dos genótipos E2E4 e E4E4 na amostra. Portanto, somente o genótipo E3E4 formou o grupo exposto, ou seja, portadores do alelo de risco ε4 da APOE. A Tabela 1 resume as características dos grupos de interesse. Esta tabela encontra-se completa, incluindo todas as variáveis descritas de forma quantitativa e categorizada, no Anexo 1: Tabela Completa 1.

Tabela 1

Caracterização da amostra

Variáveis	Amostra total (n = 69)	Genótipo E3E3 (n = 53)	Genótipo E3E4 (n = 16)	p*
Idade na entrada (anos)	82,6 ± 2,8	82,2 ± 2,7	84,0 ± 2,8	0,021
Sexo				0,267
Masculino	23 (33,3)	20 (37,7)	3 (18,8)
Feminino	46 (66,7)	33 (62,3)	13 (81,3)
B-ADL†	2,98 (1,44-5,55)	2,95 (1,38-5,46)	3,19 (1,54-7,44)	0,631
Tabagismo				0,717
Não fumante	56 (81,2)	42 (79,2)	14 (87,5)
Fumante/Ex-fumante	13 (18,8)	11 (20,8)	2 (12,5)
Uso abusivo de álcool				0,093
Não	17 (24,6)	13 (24,5)	4 (25,0)
Sim	18 (26,1)	17 (32,1)	1 (6,3)
Abstêmios	34 (49,3)	23 (43,4)	11 (68,8)
IMC (Kg/m2)†	26,8 ± 5,4	27,6 ± 5,5	23,7 ± 3,6	0,011
Atividade física (kcal/semana)	5133 (2386-9846)	5421 (2155-10544)	3580 (2300-6930)	0,216
PAS (mmHg)	161 ± 25,3	162 ± 23,7	158 ± 30,5	0,489
PAD (mmHg)	86,3 ± 13,2	88,6 ± 12,7	78,5 ± 12,4	0,007
Pressão de pulso (mmHg)	75,1 ± 22,7	73,9 ± 21,5	79,0 ± 26,8	0,439
Hipertensão	62 (89,9)	48 (90,6)	14 (87,5)	0,660
Glicemia jejum (mg/dL)‡	95,4 ± 20,7	96,2 ± 22,7	92,6 ± 12,2	0,539
Colesterol total (mg/dL) ‡	209 ± 48,8	203 ± 43,9	229 ± 59,5	0,066
Colesterol LDL (mg/dL) ‡	138 ± 42,1	132 ± 36,0	156 ± 55,0	0,055
Colesterol HDL (mg/dL)§	43,4 ± 11,4	44,0 ± 12,5	41,4 ± 6,6	0,284
Triglicerídeos (mg/dL)‡	102 (85,8-146)	102 (83,4-144)	107 (88,2-159)	0,806

Resultados expressos por média ± desvio padrão, mediana (percentis 25–75) ou n (%).

Teste t-student (comparação de médias), teste de Mann-Whitney (comparação de medianas), teste qui-quadrado de Pearson (variáveis categóricas) ou teste exato de Fisher (nas variáveis tabagismo e hipertensão);

variáveis analisadas em 15 indivíduos do genótipo E3E4;

variáveis analisadas em 52 indivíduos do genótipo E3E3;

variável analisada em 51 indivíduos do genótipo E3E3. B-ADL: Escala Bayer de Atividades da Vida Diária; IMC: índice de massa corporal; PAS: pressão arterial sistólica; PAD: pressão arterial diastólica; LDL: lipoproteína de baixa densidade; HDL: lipoproteína de alta densidade.

As causas de morte entre os grupos E3E3 e E3E4 estão resumidos na Tabela 2. Salienta-se que a expectativa de vida média para estes indivíduos foi de 92,3 anos (IC 95% 91,2 a 93,4). Para as comparações, na tabela, foram apresentados os níveis de significância sem ajuste e os ajustados às variáveis com p < 0,2 na análise univariada.

Tabela 2

Comparação dos desfechos entre os genótipos

Desfechos	Amostra total (n=69)	Genótipo E3E3 (n=53)	Genótipo E3E4 (n=16)	p	pajustado‡
	n (%)	n (%)	n (%)
Óbito	69 (100)	53 (100)	16 (100)	–	–
Causa do óbito				0,216*	0,302
Cardiovascular	43 (62,3)	36 (67,9)	7 (43,8)
Demência	6 (8,7)	4 (7,5)	2 (12,5)
Outras	20 (29,0)	13 (24,5)	7 (43,8)

Teste exato de Fisher;

ajustado para idade na entrada do estudo, consumo de álcool, índice de massa corporal, atividade física ≥ 4000 kcal/semana, pressão arterial diastólica, colesterol total e colesterol da lipoproteína de baixa densidade.

Para avaliar a sobrevida dos indivíduos idosos conforme os genótipos da APOE, utilizou-se a curva de sobrevivência estimada pelo método de Kaplan-Meier, representada no gráfico da Figura 1. Observamos que não houve associação entre os polimorfismos da APOE e sobrevida (logrank = 0,955) nos idosos longevos da amostra.

Figura 1

(A) Curva de sobrevida de Kaplan-Meier dos portadores dos genótipos E3E3 e E3E4. (B) Probabilidade de sobrevida para os grupos com periodicidade de 2 anos.

É pertinente analisar os fatores de risco cardiovasculares associados à mortalidade em idosos longevos, uma vez que esta faixa etária costuma apresentar resultados singulares e, ao mesmo tempo, contraditórios. Para isso, utilizou-se as estimativas de sobrevida de Kaplan-Meier com regressão de Cox para controlar confundimento. Os resultados estão apresentados na Tabela 3 (Anexo 2: Tabela Completa 3). As curvas de sobrevida dos fatores categóricos associados à mortalidade podem ser visualizadas na Figura 2.

Tabela 3

Regressão de Cox univariada e multivariada de fatores associados à mortalidade

Variáveis	Univariada	p	Multivariada*	p
	HR (IC 95%)		HR (IC 95%)
Idade (anos) †	1,19 (1,10 – 1,30)	<0,001	1,24 (1,12 – 1,39)	<0,001
Sexo masculino	1,45 (0,88 – 2,39)	0,150	1,04 (0,47 – 2,32)	0,920
Genótipo E3E4	1,35 (0,77 – 2,39)	0,299	–	–
B-ADL	0,93 (0,85 – 1,02)	0,119	0,92 (0,82 – 1,02)	0,102
Fumante/Ex-fumante	2,37 (1,29 – 4,36)	0,005	2,30 (1,01 – 5,24)	0,047
Consumo de álcool (g/semana)	1,00 (0,99 – 1,00)	0,602	–	–
IMC	0,94 (0,90 – 0,99)	0,018	0,96 (0,91 – 1,01)	0,107
Atividade física ≥ 4000 kcal/sem	0,55 (0,34 – 0,89)	0,016	0,49 (0,27 – 0,88)	0,017
PAS	0,99 (0,98 – 1,00)	0,050	0,98 (0,97 – 0,99)	0,018
PAD	0,97 (0,94 – 0,99)	0,016	1,01 (0,98 – 1,04)	0,669
Pressão pulso	0,99 (0,98 – 1,01)	0,392	–	–
Hipertensão	0,53 (0,24 – 1,19)	0,123	1,35 (0,54 – 3,38)	0,516
Diabetes mellitus	5,10 (1,70 – 15,3)	0,004	3,95 (1,27 – 12,3)	0,018
Colesterol total ≥ 200 mg/dL	0,52 (0,32 – 0,86)	0,010	0,74 (0,42 – 1,31)	0,303
LDL ≥ 160 mg/dL	0,69 (0,41 – 1,18)	0,175	1,00 (0,99 – 1,00)	0,410
HDL baixo‡	1,46 (0,86 – 2,47)	0,159	1,03 (0,57 – 1,84)	0,932
Triglicerídeos ≥ 150 mg/dL	1,23 (0,69 – 2,20)	0,489	–	–

O critério para a entrada da variável no modelo multivariado foi de que apresentasse um valor p < 0,20 na análise univariada.

Idade do idoso no momento do recrutamento da coorte (entrada no estudo).

HDL baixo refere-se a HDL-colesterol <40 mg/dL para homens e <50 mg/dL para mulheres. HR: hazard ratio; IC 95%: intervalo de 95% de confiança; B-ADL: Escala Bayer de Atividades da Vida Diária; IMC: índice de massa corporal; PAS: pressão arterial sistólica; PAD: pressão arterial diastólica; LDL: lipoproteína de baixa densidade; HDL: lipoproteína de alta densidade.

Figura 2

Curvas de sobrevida dos fatores associados à mortalidade em idosos longevos: (A) tabagismo, (B) atividade física [AT] vigorosa e (C) diabetes mellitus.

Considerando que a amostra deste estudo foi composta por idosos selecionados em dois momentos do seguimento, poderia ter ocorrido um viés de seleção. Especificamente, os nove idosos genotipados no ano de 2011 formariam um grupo de sobreviventes. Com o intuito de ponderar esse viés, refizemos as análises retirando estes indivíduos. Deste modo, obtivemos resultados bastante semelhantes, inclusive no que se refere ao nível descritivo amostral das variáveis, com exceção do tabagismo e diabetes que perderam a associação com mortalidade. Nesta nova análise, o risco de morte em indivíduos fumantes e ex-fumantes foi 2,14 (IC 95% 0,93 a 4,91) no modelo multivariado (p = 0,075).

Discussão

Polimorfismo da APOE

Estudos de revisão mostram que as frequências genéticas relacionadas ao polimorfismo da APOE são altamente variáveis, principalmente no que diz respeito ao alelo ε4. De modo geral, a frequência gênica observada no presente estudo foi semelhante à encontrada na população da Itália. Uma vez que a amostra deste trabalho continha 94,6% de descendentes de imigrantes italianos, essa similaridade era esperada e indica que o processo de amostragem foi adequado.

Curiosamente, nos nossos resultados, indivíduos com o genótipo E3E4 apresentaram uma idade média significativamente maior do que indivíduos E3E3 (Tabela 1). Acreditamos que esta diferença possa ser casual, uma vez que publicações relevantes indicam que não há diferença para mortalidade geral entre portadores dos genótipos E3E3 e E3E4 antes dos 80 anos., Dentre os demais fatores de risco para DCVs que foram investigados, o IMC e a PAD foram os que apresentaram diferenças significativas entre os genótipos avaliados. Nestes casos, indivíduos do grupo E3E3 apresentaram um IMC médio classificado como sobrepeso (OMS) ou excesso de peso (Lipschitz) e uma maior PAD. Não encontramos dados similares a estes em estudos previamente publicados de base comunitária, mas comparações semelhantes, em amostras maiores na faixa etária de adulto a idoso jovem, sugerem que não existe qualquer associação entre obesidade ou níveis de PAD e os genótipos da APOE.

Fatores de Risco Cardiovascular Clássicos

Nossos resultados indicaram que alguns fatores de risco cardiovascular estão associados à mortalidade geral mesmo em idosos longevos, faixa etária na qual a maior parte destes fatores clássicos perde o seu poder preditivo de risco. O tabagismo mostrou ser importante nesta relação. O risco de morte em indivíduos fumantes e ex-fumantes foi 2,30 (IC 95% 1,01 a 5,24) vezes maior do que o risco em não fumantes. Uma metanálise recente torna evidente que o fumo permanece como um forte fator de risco para mortalidade prematura, também em idosos com mais de 80 anos. No que se refere aos idosos diabéticos, apesar do pequeno percentual presente na nossa amostra (6%), este número foi suficiente para alcançar uma diferença significativa. Os idosos longevos diabéticos tiveram 3,95 (IC 95% 1,27 a 12,3) vezes o risco de óbito dos não diabéticos. Resultado similar foi evidenciado no estudo da coorte longeva The Adventist Health Study. Outro resultado importante do nosso estudo, a atividade física vigorosa, apresentou-se como fator protetor para o óbito. Indivíduos que despendiam mais de 4.000 kcal/semana, em atividade de trabalho e lazer, tiveram uma redução no risco de óbito em 51% (IC 95% 12% a 73%). Com relação à prática de atividades vigorosas, um estudo que combinou duas coortes australianas, Australian Longitudinal Study on Women's Health and the Health in Men Study, com mais de 18 mil participantes com média de idade superior a 70 anos, reforça nossos achados. Neste trabalho, as atividades físicas foram categorizadas de acordo com a intensidade e mostraram uma redução em 40% na mortalidade para mulheres e 22% para homens que praticavam atividade física vigorosa.

Por último, em nosso trabalho, o aumento da PAS mostrou-se como fator de proteção para mortalidade geral. Assim, para o aumento de 1 mmHg na PAS houve uma redução de 2% (IC 95% 1% a 3%) no risco de morte. Estes achados estão de acordo com os resultados da maioria dos estudos que identificaram uma relação inversa entre a pressão arterial e o risco de morte por causa cardiovascular ou qualquer outra causa, em pessoas com 80 anos de idade ou mais., No entanto, este assunto continua sendo gerador de discussões e proposições no meio científico. Os resultados conflitantes dos estudos de coorte e de alguns ensaios clínicos como os resultados do Hypertension in the Very Elderly Trial (HYVET) são difíceis, mas têm uma explicação plausível. No HYVET, foram incluídos participantes com pelo menos 160 mmHg e a meta para a PAS foi atingir níveis inferiores a 150 mmHg. Contrapondo com nosso estudo, que é de base comunitária e, portanto, não teve restrição de nível de PA, o risco dos indivíduos com PA muito baixa, provavelmente, superou o risco daqueles com PA elevada, o que poderia explicar nossos dados de proteção.

Considerações e Limitações

Algumas limitações deste estudo devem ser consideradas, sendo o pequeno tamanho amostral a principal delas. A validação externa é limitada, uma vez que a população do estudo é uma fração de uma coorte muito específica, descendentes de italianos em um único local, portanto, não representativa da população idosa brasileira. Outra limitação que pode ser considerada é a inclusão de idosos enfermos, ou seja, com restrições físicas no mesmo grupo de idosos com gasto energético semanal inferior a 4.000 kcal. Estes idosos foram considerados sedentários, apesar desta ser uma situação do momento da avaliação e de não refletir exatamente seu hábito de vida. Contudo, somente 5% da amostra encontrava-se enferma e sem possibilidades de realizar qualquer atividade física.

O aspecto mais original do nosso estudo é a população investigada, idosos com 80 anos ou mais, um grupo não incluído, frequentemente, em estudos observacionais e ensaios clínicos. Adicionalmente, informações sobre a relação entre os genótipos da APOE/fatores de risco cardiovasculares clássicos e a mortalidade nessa faixa etária, especialmente no Brasil, são escassas. Os resultados do nosso estudo acrescentam uma contribuição relevante, tanto para a prevenção quanto para o manejo, dos fatores de risco nesta população.

Conclusões

Considerando que a população está envelhecendo e o impacto dos fatores de risco tradicionais sobre os resultados pode não ser o mesmo que nas idades mais jovens, nossos resultados acrescentam uma contribuição relevante para a discussão sobre como controlar melhor os fatores de risco nessa população. Nosso estudo não evidenciou que idosos longevos portadores do alelo ε4 da APOE tivessem maior risco de morte que os portadores do genótipo de referência E3E3. De outra forma, a exposição a alguns fatores de risco relacionou-se de forma significativa à mortalidade geral na idade avançada, notavelmente, o tabagismo e o DM. Entretanto, a atividade física vigorosa e a PAS maior foram considerados como fatores de proteção.

Introduction

The rapid growth in the elderly population worldwide has brought an increased interest in and need for studies on factors related to longevity with quality of life. Mortality data about elderly individuals aged 80 and over show that cardiovascular diseases (CVD) represent half of the causes of death. Despite the high frequency of chronic diseases, such as CVD and dementia, in this age range, they are usually excluded from well controlled studies or only analyzed as subgroups. Results from studies in the very elderly (aged 80 and over) are different from those in the young elderly (aged 60 to 74), for instance, higher mortality associated with reduction in diastolic pressure or systolic pressure, and reduction in cholesterol, or a protective effect related to body mass index (BMI) above 30 kg/m2. However, other risk factors such as smoking and diabetes mellitus (DM) have been similarly associated, even at more advanced ages. Otherwise, a widely studied genetic factor, apolipoprotein E (APOE) polymorphism, more specifically the ε4 allele, appears as a risk factor for Alzheimer's disease (AD) in adults and young elderly., However, results from a specific cohort with very elderly identified a paradoxical effect of APOE ε2 allele associated with an increase in AD through post-mortem neuropathological criteria. Meta-analysis studies have shown that carriers of the APOE ε4 allele present a higher risk of early CVD., However, there are no studies to indicate whether this association is maintained in the oldest old. From this perspective, the objective of this study was to investigate the relationship between the most frequent APOE genotypes and mortality in very elderly individuals and to describe survival according to genotypes and exposure to classical cardiovascular risk factors.

Methods

Design

Prospective cohort study

Study Population

The Veranópolis Project cohort started in 1994 following two comprehensive eligibility criteria: (1) age equal to or older than 80 years and (2) residing within the territorial domain of the municipality of Veranópolis, Rio Grande do Sul, Brazil. Recruitment of eligible individuals took place in 1994, 1996, and 1998. Summarily, the first recruitment happened during the month of July 1994 through an informal invitation by the research coordinator to participants in a religious service. Those present registered spontaneously and informed their intention to participate. During three weeks in July 1994, the researchers visited 100 elderly individuals at their residences or in community centers. In 1996, recruitment occurred through broadcasting in a local radio station; another 129 consented to take part in the study, and those who had participated in 1994 were reassessed. In 1998, a simple random sample of the participants in the previous years and another 13 new volunteers underwent APOE genotyping, and the main tests from the previous assessments. Thus, the Veranópolis Project cohort comprised 242 individuals, representing 87.4% of elderly individuals aged 80 and over who resided in the municipality between 1994 and 1998.

During 2011 and 2012, vital status of the elderly individuals sampled for APOE genotyping (74 volunteers) was checked once more through home visits and, at that time, the Bayer Activities of Daily Living Scale (B-ADL) questionnaire was applied to their caregivers.

In December 2012, 18 years after the start of the cohort, 11 of the 242 members of were still living. The results presented in this manuscript refer to a period after verification of vital status from 2011 to 2012, that is, after the occurrence of the mortality outcome in all participants of the cohort of the oldest old, which occurred in 2015.

This study received approval from the Research Ethics Committee of the Federal University of Rio Grande do Sul, Brazil. All participants and/or their relatives signed an informed consent form.

Variables

The APOE genotypes (rs7412 and rs429358) were used as a predictor variable, and the genetic factor was analyzed in two different periods during follow-up, the first in 1998 and the second in 2011, including all living individuals who had not been sampled in 1998, namely, another 9 elderly individuals (methodology described in Alvim et al. (See Flowchart in Annex)

The outcome defined in this study was mortality from chronic CVD included in codes I00-I99 or from dementia included in codes F00-F03 of the International Classification of Diseases, 10th revision. To define cause of death in elderly individuals, copies of their death certificates were presented to two medical professionals, one geriatrician and one cardiologist, who were blinded to one another's assessments and to the genotypes of the deceased. In case of any divergence between the professionals concerning the cause of death, assessment was requested from a third professional. The final diagnosis, in case of an impasse, was defined by consensus between the three professionals. When cause of death could not be defined by the document alone, medical records were surveyed, and interviews were carried out with the family doctors or next of kin of the deceased.

The Veranópolis Project cohort is a broad study which seeks answers for the peculiar longevity of this population. Among the variables investigated in the cohort for this study, we selected those that are described as classical risk factors for CVD and those that could be independently associated with the outcome studied, namely, arterial hypertension, obesity, DM, dyslipidemia, smoking, alcohol abuse, and physical inactivity. Data from these variables were collected at the baseline of the year of inclusion of the elderly individual in the cohort (1994, 1996, or 1998). The baseline data collected in 1994 were re-evaluated in 1996. In 1998, data collection was repeated from a random sample from 1994 to 1996 and 13 additional individuals included in the cohort. For this study's data analysis, we used the information collected in the year of entry of the elderly individual in the cohort.

The methods used to measure cardiovascular risk factors and the justifications for the categorization, when applicable, are described succinctly below. Blood pressure (BP) was obtained using a mercury sphygmomanometer (Erka, Germany). Two or three measurements were taken according to variability, following the measurement intervals recommended by the guidelines, and the weighted average was calculated. To analyze data, BP was used as a quantitative, categorized variable, and individuals were considered hypertensive when BP ≥ 140/90 mmHg or when they were taking antihypertensive medication. Furthermore, pulse pressure, the result of subtracting diastolic blood pressure (DBP) from systolic blood pressure (SBP), was evaluated.

Obesity was defined by BMI; weight was measured with participants dressed lightly, without shoes, using mechanical scales (Filizolla, São Paulo). Height was determined standing upright, without shoes, using a measuring tape with shoulders in a normal position. To analyze the data, BMI was used as a continuous, categorical variable, with obesity and overweight being defined by the cut off points ≥ 30 kg/m2 (World Health Organization [WHO] and > 27 kg/m2 (Lipschitz), respectively.

For glycemia and lipid profile biochemical evaluations, venous blood samples were collected after 12 hours of fasting. A blood sampling system with disposable vacuum device (Vacutainer) in tubes with no anticoagulant was used. Plasmatic dosages were obtained through the manual technique of colorimetric enzymatic reaction with calibration standards and samples in duplicate. DM was defined as fasting glycemia ≥ 126 mg/dL or use of hypoglycemia medication. Dyslipidemia was evaluated through plasmatic dosages of triglycerides (TG), total cholesterol (TC), high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C), and low-density lipoprotein cholesterol (LDL-C) calculation, which were used as quantitative, categorized variables according to the following criteria from the V Brazilian Guidelines on Dyslipidemias and Prevention of Atherosclerosis and the American Association of Clinical Endocrinologists' Guidelines for Management of Dyslipidemia and Prevention of Atherosclerosis, TG ≥ 150 mg/dL; TC ≥ 200 mg/dL; HDL-C < 50 mg/dL for women and < 40 mg/dL for men; LDL-C ≥ 160 mg/dL. LDL-C was obtained using Friedewald's formula for TG values below 400 mg/dL.

The lifestyle variables smoking, alcohol abuse, and physical inactivity were obtained using a standardized questionnaire applied at baseline. Smoking was evaluated through statements on consumption or non-consumption of tobacco (cigarette, corn straw cigarette, pipe). Two groups were considered: 1) non-smokers: individuals who never smoked; 2) smokers or ex-smokers. Alcohol abuse was evaluated through statements on the amount of alcohol consumed per week, and abuse was considered at values of > 210 g/week for men and > 105 g/week for women. Physical inactivity was evaluated through statements on daily activities during a normal week of work and leisure. Two different cut-off points were used, < 2,000 kcal/week, and < 4,000 kcal/week, which are the minimum amounts of physical activity to attain major cardiovascular benefits such as attenuated thickening of the inner-middle layer of carotid arteries, increase in HDL-C and reduction of mortality in patients with coronary arterial disease. The instrument used to report different physical activities comprised a list of 27 habitual activities in the routine of people who live in the city and in the country, and one further open question about any other activity besides the pre-selected ones. Participants in the study were asked to report time spent in minutes and the weekly frequency practicing these activities. Therefore, following the same rationale for other studies on the very elderly, we chose to use energy expenditure calculated in kilocalories per week (kcal/week), considering participants' weight, the reported time duration of the activity, the metabolic equivalents (MET) for the specific activity and the weekly frequency of the activities: Energy expenditure (kcal/week) = MET X weight (kg) X time duration of activity (minutes) / 60 X weekly frequency. We thus deem that this measurement better reflects the very elderly energy expenditure in the community studied (rural and urban) than the simply measurement of MET that is usually described in current works.

B-ADL was applied by a researcher, who was trained and blinded in relation to participants' genotypes, to their caregivers in the period from August 2011 to December 2012. The instrument was employed as a way of identifying cases of dementia and the result used as a potentially confounding variable, as it has been well described that the APOE ε4 allele is a risk factor for the development of AD., The score obtained from the B-ADL ranges from 1.00 to 10.00, and higher scores represent greater difficulty in the activities. To analyze the data, the B-ADL score was used as a quantitative, categorized variable, using a cut-off point of ≥ 3.12 to define cases of dementia.

Statistical Analysis

Quantitative variables were described as average and standard deviation or median and interquartile amplitude. For comparison between groups, we used Student's t test for independent (unpaired) samples (Shapiro-Wilk normality test) and, in case of asymmetry, the Mann-Whitney test. Qualitative variables were described as absolute and relative frequencies. For comparing proportions between groups, the Pearson chi-square test or Fisher exact test were applied. We used the the Kaplan-Meier survival curve estimate method to evaluate survival time and the log-rank chi-square test for comparison between groups.

To control confounding factors in relation to death, Cox proportional hazards model was used. As a measure of effect, the hazard ratio (HR) was calculated, with respective 95% confidence intervals (CI). The criterion for entering a variable in the multivariate model was that it presented p value < 0.20 in univariate analysis.

The level of significance was p < 0.05, and the data were analyzed with Statistical Package for the Social Sciences software version 21.0.

Results

In this study, the sample of 74 individuals of the Veranópolis cohort had a median follow-up time of 9 years (P25 – P75: 6 – 14 years), ranging from 0.6 to 21 years. It is worth underscoring that there were no follow-up losses in this sample. Based on statements by the elderly individuals, 94.6% descended from Italian immigrants. The APOE gene (allele) frequency present in the sample was 4.1% ε2; 85.1% ε3, and 10.8% ε4. The genotype frequency was 1.4% E2E2; 5.4% E2E3; 71.6% E3E3, and 21.6% E3E4. The genotype distribution is in Hardy-Weinberg equilibrium (χ = 0.07; degree of freedom = 1; p = 0.79). No carriers of the E2E4 and E4E4 genotypes were found in the sample. Therefore, only the E3E4 formed the exposed group, that is, carriers of the APOE ε4 risk allele. Table 1 summarizes the characteristics of the groups of interests. The complete table, including all the described variables, can be found in a quantitative, categorized form in Additional File 1: Complete Table 1.

Table 1

Characterization of the sample at baseline

Variables	Total sample	E3E3 genotype	E3E4 genotype	p*
	(n = 69)	(n = 53)	(n = 16)
Age at entry (years)	82.6 2.8	82.2 2.7	84.0 ± 2.8	0.021
Sex				0.267
Male	23 (33.3)	20 (37.7)	3 (18.8)
Female	46 (66.7)	33 (62.3)	13 (81.3)
B-ADL†	2.98 (1.44-5.55)	2.95 (1.38-5.46)	3.19 (1.54-7.44)	0.631
Smoking				0.717
Non-smoker	56 (81.2)	42 (79.2)	14 (87.5)
Smoker/ex-smoker	13 (18.8)	11 (20.8)	2 (12.5)
Alcohol abuse				0.093
No	17 (24.6)	13 (24.5)	4 (25.0)
Yes	18 (26.1)	17 (32.1)	1 (6.3)
Teetotalers	34 (49.3)	23 (43.4)	11 (68.8)
BMI (kg/m2)†	26.8 ± 5.4	27.6 ± 5.5	23.7 ± 3.6	0.011
Physical activity (kcal/week)	5133 (2386-9846)	5421 (2155-10544)	3580 (2300-6930)	0.216
SBP (mmHg)	161 ± 25.3	162 ± 23.7	158 ± 30.5	0.489
DBP (mmHg)	86.3 ± 13.2	88.6 ± 12.7	78.5 ± 12.4	0.007
Pulse pressure (SBP-DBP)	75.1 ± 22.7	73.9 ± 21.5	79.0 ± 26.8	0.439
Hypertension	62 (89.9)	48 (90.6)	14 (87.5)	0.660
Fasting glycemia (mg/dL)‡	95.4 ± 20.7	96.2 ± 22.7	92.6 ± 12.2	0.539
Total cholesterol (mg/dL)‡	209 ± 48.8	203 ± 43.9	229 ± 59.5	0.066
LDL cholesterol (mg/dL)§	138 ± 42.1	132 ± 36.0	156 ± 55.0	0.055
HDL cholesterol (mg/dL)‡	43.4 ± 11.4	44.0 ± 12.5	41.4 ± 6.6	0.284
Triglycerides (mg/dL)‡	102 (85.8-146)	102 (83.4-144)	107 (88.2-159)	0.806

Results described as average ± standard deviation, median (25 – 75 percentiles) or n (%).

t-student test (comparison of averages), Mann-Whitney test (comparison of medians), Pearson chi-square test (categorical variables) or Fisher exact test (for the variables of smoking and hypertension);

variables analyzed in 15 individuals with the E3E4 genotype;

variables analyzed in 52 individuals with the E3E3 genotype;

variable analyzed in 51 individuals with the E3E3 genotype. B-ADL: The Bayer Activities of Daily Living Scale; BMI: body mass index; SBP: systolic blood pressure; DBP: diastolic blood pressure; LDL: low density lipoprotein; HDL: high density lipoprotein.

The causes of death between the E3E3 and E3E4 groups are summarized in Table 2. We point out that average life expectancy for individuals was 92.3 years (95% CI 91.2 to 93.4). For comparison, the table presents the levels of significance without adjustment and adjusted for variables with p < 0.2 in univariate analysis.

Table 2

Comparison of outcomes between genotypes

Outcomes	Sample total (n = 69)	Genotype E3E3 (n = 53)	Genotype E3E4 (n = 16)	p	padjusted†
	n (%)	n (%)	n (%)
Death	69 (100)	53 (100)	16 (100)	–	–
Cause of death				0.216*	0.302
Cardiovascular	43 (62.3)	36 (67.9)	7 (43.8)
Dementia	6 (8.7)	4 (7.5)	2 (12.5)
Other	20 (29.0)	13 (24.5)	7 (43.8)

Pearson chi-square test;

adjusted for age of entry in the study, alcohol consumption, body mass index, physical activity ≥ 4,000 kcal/week, diastolic blood pressure, and total and low-density lipoprotein cholesterol

To evaluate survival of the elderly according to the APOE genotypes, the Kaplan-Meier survival curve estimate method was used, represented in the graph in Figure 1. We observed that there was no association between APOE polymorphisms and survival (logrank = 0.955) in the very elderly in this sample.

Figure 1

(A) Kaplan-Meier survival curve for carriers of the E3E3 and E3E4 genotypes. (B) Survival probability for the groups with a periodicity of 2 years.

Additionally, it is pertinent to analyze cardiovascular risk factors associated with the mortality in very elderly, since this age range usually presents singular and, at the same time, contradictory results. In order to do this, Kaplan-Meier survival estimates were used with Cox regression to control confounding variables. The results are presented in Table 3 (and in Additional File 2: Complete Table 3). The survival curves for the categorical factors associated with death can be viewed in Figure 2.

Table 3

Univariate and multivariate Cox regression analysis for factors associated with mortality

Variables	Univariate	p	Multivariate*	p
	HR (95% CI)		HR (95% CI)
Age (years)†	1.19 (1.10 – 1.30)	< 0.001	1.24 (1.12 – 1.39)	< 0.001
Males	1.45 (0.88– 2.39)	0.150	1.04 (0.47 – 2.32)	0.920
E3E4 genotype	1.35 (0.77 – 2.39)	0.299	–	–
B-ADL	0.93 (0.85 – 1.02)	0.119	0.92 (0,82 – 1.02)	0.102
Smoker/ex-smoker	2.37 (1.29 – 4.36)	0.005	2.30 (1.01 – 5.24)	0.047
Alcohol consumption (g/week)	1.00 (0.99 – 1.00)	0.602	–	–
BMI	0.94 (0.90 – 0.99)	0.018	0.96 (0.91 – 1.01)	0.107
Physical activity ≥ 4,000 kcal/week	0.55 (0.34 – 0.89)	0.016	0.49 (0.27 – 0.88)	0.017
SBP	0.99 (0.98 – 1.00)	0.050	0.98 (0.97 – 0.99)	0.018
DBP	0.97 (0.94 – 0.99)	0.016	1.01 (0.98 – 1.04)	0.669
Pulse pressure	0.99 (0.98 – 1.01)	0.392	–	–
Hypertension	0.53 (0.24 – 1.19)	0.123	1.35 (0.54 – 3.38)	0.516
Diabetes mellitus	5.10 (1.70 – 15.3)	0.004	3.95 (1.27 – 12.3)	0.018
Total cholesterol ≥ 200 mg/dL	0.52 (0.32 – 0.86)	0.010	0.74 (0.42 – 1.31)	0.303
LDL ≥ 160 mg/dL	0.69 (0.41 – 1.18)	0.175	1.00 (0.99 – 1.00)	0.410
Low HDL‡	1.46 (0.86 – 2.47)	0.159	1.03 (0.57 – 1.84)	0.932
Triglycerides ≥ 150 mg/dL	1.23 (0.69 – 2.20)	0.489	–	–

The criterion for entering the variable in the multivariate model was p value < 0.20 in univariate analysis.

Age at the time of cohort recruitment (study entry).

Low HDL refers to HDL-cholesterol < 40 mg/dL for men and < 50 mg/dL for women. HR: hazard ratio; 95% CI: 95% confidence interval; B-ADL: The Bayer Activities of Daily Living Scale; BMI: body mass index; SBP: systolic blood pressure; DBP: diastolic blood pressure; LDL: low density lipoprotein; HDL: high density lipoprotein.

Figure 2

Survival curves for factors associated with mortality in the very elderly: (A) smoking, (B) vigorous physical activity [PA] and (C) diabetes mellitus.

Considering that the sample for this study comprised elderly individuals selected at two moments of follow-up, there may have been a selection bias. Specifically, the nine elderly individuals that were genotyped in 2011 would form a group of survivors. With the intention of weighing this bias, we performed new analyses without these individuals. In this manner, we obtained very similar results, including in relation to the sample descriptive level, with the exceptions of smoking and diabetes, which lost the association with mortality. In this new analysis, the risk of death in smokers and ex-smokers was 2.14 (95% CI 0.93 to 4.91) in the multivariate model (p = 0.075).

Discussion

APOE Polymorphism

Review studies have shown that genetic frequencies related to APOE polymorphism are highly variable, especially in regard to the ε4 allele. The gene frequency observed in the present study is similar to that found in the population in Italy. Since the sample for this work comprised 94.6% Italian immigrant descendants, this similarity was expected, and it indicates that the sampling process was adequate.

Curiously, in our results, individuals with the E3E4 genotype presented an average age significantly older than E3E3 individuals (Table 1). We believe this difference to be casual, since relevant publications indicate that there is no difference in mortality between carriers of the E3E3 and E3E4 genotypes before 80 years of age., Among the risk factors for CVD investigated, BMI and DBP presented significant differences between the evaluated genotypes. In those cases, individuals in the E3E3 group presented an average BMI classified as overweight (WHO) or overweight (Lipschitz) and higher DBP. We did not find similar data to these in studies previously published on the community basis, but similar comparisons in larger samples in the adult to young elderly age range suggest that there is no association between obesity or DBP levels and the APOE genotypes.

Classical Cardiovascular Risk Factors

Our results have indicated that some cardiovascular risk factors are associated with general mortality, even in the very elderly age group, in which the majority of these classical factors lose their predictive power for risk. Smoking appeared to be important in this relation. The risk of death in smokers and ex-smokers was 2.30 (95% CI 1.01-5.24) times that of non-smokers. A meta-analysis study brings evidence that smoking remains a strong risk factor for mortality in elderly individuals aged 80 and over as well. In relation to elderly individuals with diabetes, despite the low percentage (6%) present in our sample, this number was enough to attain a significant difference. Very elderly individuals with diabetes had 3.95 (95% CI 1.27-12.3) times higher risk of death in comparison with those without diabetes, showing that this risk factor remains important, even over 80 years of age. A similar result became evident in the very elderly cohort of The Adventist Health Study. Vigorous physical activity appeared as a protective factor against mortality in our study. Individuals who expended more than 4,000 Kcal/week through work and leisure activities had a 51% reduction in the risk of death (95% CI 12% to 73%). Regarding practice of vigorous activities, a study that combined two Australian cohorts, the Australian Longitudinal Study on Women's Health and the Health in Men Study, with more than 18,000 participants with average age over 70, reinforces our findings. In this study, physical activities were categorized according to intensity, and they showed a 40% reduction in mortality for women and a 22% reduction for men who practiced rigorous physical activity.

Finally, in this study, the increase in SBP appeared as a protective factor against general mortality. Thus, an increase of 1 mmHg in SBP reduced the risk of death by 2% (95% CI 1-3%). These findings are in accordance with the results from most studies that identified an inverted reaction between BP and risk of death from cardiovascular or any other causes in persons aged 80 or older., However, this subject still generates discussions and propositions in the scientific community. The conflicting results from cohort studies and some clinical trials, such as the results from the Hypertension in the Very Elderly Trial (HYVET) are difficult, but there is a plausible explanation. The HYVET included participants with at least 160 mmHg, and the target for SBP was to attain levels below 150 mmHg. In comparison, our study, which is community based and therefore had no BP restrictions, the risk for individuals with very low BP probably surpassed the risk for those with high BP, which could explain our data showing protection.

Considerations and Limitations

Some limitations in this study must be considered; the small sample size is the main one. External validation is limited, given that the study population is a fraction of a very specific cohort, namely, Italian descendants in a single location, and is not, therefore, representative of the Brazilian elderly population. Another shortcoming that could be considered was the inclusion of elderly patients who were sick, that is, with physical restrictions, in the same group of elderly individuals with weekly energy expenditure below 4,000 kcal. They were considered as sedentary, although this was the situation at the moment they were evaluated and it does not exactly reflect their lifestyle. Nevertheless, only 5% of the sample were sick and unable to practice any physical activity.

The most original aspect of our study is the study population, namely, elderly individuals aged 80 years or older, a group that is not frequently included in observational studies and clinical trials. Furthermore, information on the relationship between APOE genotypes/classic cardiovascular risk factors and mortality in this age group is lacking, especially in Brazil. The results of our study add a relevant contribution to both prevention and management of risk factors in this population.

Conclusions

Considering that the population is getting older and the impact of traditional risk factors on outcomes may not be the same as it is in younger ages, our results add a relevant contribution to the discussion on how to better control risk factors in this population. Our study did not find evidence that very elderly carriers of the APOE ε4 allele were at greater risk of death than carriers of the E3E3 reference genotype. In contrast, exposure to some risk factors was significantly related to general mortality at an advanced age; namely, smoking and DM were characterized as risk factors. However, vigorous physical activity and higher SBP were protective factors.