Assessment of the Effects of Swimming as a Postoperative Rehabilitation on Nerve Regeneration of Wistar Rats Submitted to Grafting of Autologous Nerves after Injury to the Sciatic Nerve.

Objective  To evaluate the effects of swimming on nerve regeneration after sciatic nerve injury in Wistar rats. Methods  A total of 30 Wistar rats was divided into 3 groups: Sham + Nat group animals that were not submitted to graft surgery and were submitted to swimming ( n  = 10); Graft group: animals submitted to autologous sciatic nerve graft ( n  = 10); and Graft + Nat group: animals submitted to autologous sciatic nerve graft surgery and to swimming ( n  = 10). The results were analyzed on the software (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). Results  In the first evaluation, all sciatic functional index (SFI) values were similar ( p  = 0.609). Thirty days after the surgical procedure, we observed differences between all the comparisons: Sham + Nat (-34.64 ± 13.89) versus Graft (-145.9 ± 26.06); Sham + Nat versus Graft + Nat (-89.40 ± 7.501); Graft (-145.9 ± 26.06) versus Graft + Nat (-89.40 ± 7.501). In the measurements (60 and 90 days), there was no statistical difference between the Graft and Graft + Nat groups, with significantly lower values in relation to the control group ( p  < 0.001). The number of motor neurons presented differences in the comparisons between the Sham + Nat and Graft groups (647.1 ± 16.42 versus 563.4 ± 8.07; p  < 0.05), and between the Sham + Nat and Graft + Nat groups (647.1 ± 16.42 versus 558.8 ± 14.79; p  < 0.05). There was no difference between the Graft and Graft + Nat groups. Conclusion  Animals submitted to the swimming protocol after the sciatic nerve grafting procedure did not present differences in the SFI values and motor neuron numbers when compared to the control group. Therefore, this type of protocol is not efficient for the rehabilitation of peripheral nerve lesions that require grafting. Therefore, further studies are needed.

Introduction

Peripheral nerve lesions are frequent in the clinical practice and represent a health problem capable of generating disability in the population. 1 The etiological factors most associated with injuries include: motor vehicle collision, penetrating injury, and sports-related injuries. 2

Morphologically, there is an increase in intramuscular connective tissue and muscular atrophy evidenced by the decrease in the cross-sectional area of muscle fibers. 3 These changes cause pain and tenderness along the nerve fiber, 4 which may result in limitations to the patients.

Although peripheral nerves have the capacity for regeneration, 5 recovery is critically dependent on postinjury treatment. 1 Nonsurgical treatments, such as physical exercise, may act on peripheral nerve regeneration. 4

The physical exercise performed in the aquatic environment induces physiological effects that provide benefits to the cardiovascular, skeletal, muscular, and nervous systems that increase the process of tissue repair. 6 Swimming helps in the regeneration of the sciatic nerve in rabbits, 7 fish, 8 and rats. 9 10 11 It seems to act in the removal of the degenerate myelin and in its synthesis in the regenerative phase, 7 accelerating the nervous recovery. 10 11

Immersion in aquatic environments generates physiological effects, such as the general elevation in body temperature. As the skin becomes warm, the superficial blood vessels dilate, the peripheral blood supply is increased, and the heart rate rises. Heat from the water reduces the sensitivity of sensitive nerve endings, aiding in pain relief and reduced muscle spasm. 12 13 However, some studies have shown that swimming does not promote benefits in the sensorymotor recovery of rats after sciatic nerve injury. 14 15

The effects of swimming on nerve regeneration are conflicting, as some authors have reported that forced exercise may have detrimental effects, especially in restoring muscle function. 16 17 Stress induced by physical training could prevent functional recovery after nerve injury.

Due to the scientific controversies of the benefits of swimming, studies are needed to show the effects of this physical activity on the regeneration of the sciatic nerve. In this context, the present study aims to evaluate the effects of swimming on nerve regeneration after sciatic nerve injury in Wistar rats.

Materials and Methods

Casuistry

A total of 30 male Wistar rats from the Experimental Models Development Center, aged between 7 and 8 weeks, weighing on average 250 g, were used. The animals were kept under controlled lighting conditions (light/dark cycle of 12 hours), controlled temperature (21 ± 2°C) and free access to water and feed. All of the animals were kept in a vivarium until euthanasia.

The present work followed the norms of the current legislation for animal experimentation, in accordance with national standards and with the international legislation (Guidelines of the Brazilian College of Animal Experimentation [COBEA, in the Portuguese acronym], and the National Institutes of Health [NIH] Guide for Care and Use of Laboratory Animals). The present work was approved by the Ethical Commission on the Use of Animals (CEUA, in the Portuguese acronym), under the number 5060051217.

Definition of Study Groups

The animals were randomly divided into three groups:

SHAM + SWIMMING (Sham + Swim) – Animals that underwent the surgical procedure, without graft removal, and were submitted to swimming ( n  = 10);

GRAFT (Graft) – Animals that underwent autologous sciatic nerve graft surgery ( n  = 10);

GRAFT + SWIMMING (Graft + Swim) – Animals submitted to autologous sciatic nerve graft surgery and to swimming ( n  = 10).

Surgical Procedure

In the Sham + Swim group, the right sciatic nerve was exposed for 10 minutes, and the muscle layer sutured with 4-0 monofilament nylon (Monofilamento preto NY44CT30, Tecnofil, Goiânia, GO, Brazil). In the other groups, the sciatic nerve was cut and an 8 mm segment was resected, leaving a distal stump ∼ 3 mm before the nerve branch, as described by Fernandes et al. 18 The nerve segment, now considered nerve graft, was inverted and sutured with 2 points of monofilamentyarn 10-0 (Microcirurgia preto N-10005, Techsuture, Bauru, SP, Brazil). 19 The skin and muscle were sutured with nylon 4-0 monofilament yarn (Monofilamento preto NY44CT30, Tecnofil, Goiânia, GO, Brasil) and the operation was finished.

Postoperative

After the surgery, the rats were kept in cages, submitted to the standard diet of the vivarium, water ad libitum, and to a light/dark cycle of 12 hours. Immediate treatment was given with the administration of tramadol hydrochloride (5mg/kg, intraperitoneal). Treatment with paracetamol and ketoprofen was then orally administered at the recommended dose for rats: 1.5 mg/ml and 5 mg/kg, respectively, every 24 hours for ≥ 5 days if there were signs of pain.

Gait Evaluation

The gait evaluation was performed before the surgical procedure (time 0) and after 30, 60, and 90 days. The animals were evaluated using the CatWalk XT system (Noldus Information Technology Inc., Leesburg, VA, EUA), which analyzes footprints through a transparent walkway coupled to a computer system. These footprints were used to calculate the sciatic functional index (SFI). 19

Swimming Protocol

The rats of the Sham + Swim and Graft + Swim groups were placed in a pool with a height of 55 cm and filled with 150 liters of water at a temperature of 30 ± 2°C, and were induced to swim. Before the surgical procedure, the animals underwent a period of progressive adaptation during 5 days, starting the training with 20 minutes until reaching 1 hour of swimming. The swimming exercise was started on the 14 th day after the surgery, lasting for 2 weeks, when the animals swam 30 minutes 5 times a week. After this step, the animals performed the swimming activity for 9 weeks following the 30-minute schedule 3 times a week. 9

Surgery for Neural Tracing

Neuronal tracing was performed with the neuronal retrograde tracer Fluoro-Gold (Fluorochrome, LLC, Denver, CO, USA), in a concentration of 3%, in the same procedure, by exposing the proximal stump, distal to the second nerve suture for 90 minutes, for later counting of neurons in the anterior horn of the spinal cord. 20

Transcardiac Perfusion and Spinal Cord Extraction

Transcardiac perfusion was performed 48 hours after the neuronal tracing, through the opening of the rib cage and the exposure of the heart. The left ventricle was punctured with a needle and the infused solutions were drained through a section of the right atrium. During the infusion, the solutions used were 0.2M phosphate buffer, 4% paraformaldehyde, and 10% sucrose, at physiological pH. 20

Immediately after the perfusion, a laminectomy was performed, and a segment of the spinal cord was removed using a Surgical microscope (MCT MU-M 19, DFVasconcelos, São Paulo, SP, Brasil). The roots of L3 and S1 were identified at the origin and sectioned transversely in order to keep the L4, L5 and L6 segments intact. The segments of the spinal cord were cryoprotected in 20% sucrose and sectioned in a cryostat at a thickness of 40 μm. The slices were mounted on glass slides and analyzed by fluorescence microscopy. 18

Histological Analysis of the Bone Marrow Segment

For the histological analysis, a quantitative study of neurons marked by the neuronal retrograde tracer Fluoro-Gold in the anterior horn of the spinal cord was performed. Using the 25, 50, 100 and 400 fold magnifications of the ZEISS Axiolab fluorescence microscope (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany) all of the sections were examined and the traced motor neurons were counted. All of the analyzes were performed by the same examiner. The histological analysis was performed randomly in the marrow of five animals from each group. Among these, only cells strongly positive for Fluoro-Gold were considered, and the criterion of Abercrombie correction (1946) apud Fernandes et al. 20 Was used.

Statistical Analysis

The results were evaluated in the software GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). The Shapiro-Wilk test was used to determine the normality of the data distribution. The parametric variables among the three groups were determined by the analysis of variance (ANOVA), with correction by the Bonferroni post-test. P-values p  ≤ 0.05 were considered statistically significant differences.

Results

Sciatic Functional Index

In the first evaluation, all SFI values were similar between the Sham + Swim (−17.78), Graft (−20.64) and Graft + Swim (−14.184) groups, with  = 0.6099.

The Sham + Swim group obtained the indices at the limits of normality in all of the measurements, with their values remaining negative and close to zero. After the surgical procedure, the SFI values in the experimental groups (Graft and Graft + Swim) were significantly lower than those of the Sham + Swim group ( p  < 0.001, Table 1 ; Fig. 1 ). In the Graft and Graft + Swim groups, as expected, the 1 measurement after the grafting surgery showed a sharp fall in the SFI30 values (−145.9 ± 26.06 and −89.40 ± 7.501, respectively).

Table 1

Sciatic functional index analysis between groups Sham + Swimming, Graft, and Graft + Swimming at times of 0, 30, 60, and 90 days

Time	Group	Average	SD	Median	Minimum	Maximum	n	p-value
0	Sham + Swimming	−17.78	17.27	−24.27	−25.74	24.82	8	0.6099
	Graft	−20.64	9.679	−18.82	−35.16	−8.360	9
	Graft + Swimming	−14.18	13.46	−17.83	−25.57	−25.57	9
30	Sham + Swimming	−34.64	13.89	−32.41	−50.20	−13.79	7	p  < 0.0001*
	Graft	−145.9	26.06	−143.3	−190.2	−100.4	10
	Graft + Swimming	−89.40	7.501	−89.03	−100.2	−74.30	9
60	Sham + Swimming	−26.97	13.28	−20.28	−50.12	−13.32	7	p  < 0.0001 #
	Graft	−77.52	11.34	−80.24	−91.15	−58.36	10
	Graft + Swimming	−84.69	21.65	−91.44	−102.6	−27.64	10
90	Sham + Swimming	−19.11	11.33	−21.26	−36.82	−2.870	8	p  < 0.0001 #
	Graft	−72.14	19.50	−73.37	−107.5	−41.16	10
	Graft + Swimming	−84,27	5,782	−83,74	−92,28	−75,10	8

Abbreviation: SD, standard deviation.

Note: n  = sample number. Analysis of variance (ANOVA) with correction by the Bonferroni post-test. Statistically significant differences were considered with p-values ≤0.05. *; differences between all comparisons (Sham + Swimming versus Graft, Sham + Swimming versus Graft + Swimming, Graft versus Graft + Swimming); # ; differences between groups: Sham + Swimming versus Graft, Sham + Swimming versus Graft + Swimming.

Fig. 1

Sciatic functional index analysis between Sham + Swimming, Graft, and Graft + Swimming groups at 0, 30, 60, and 90 days.

In the postoperative follow-up (60 and 90 days), the 2 grafted groups had a progressive functional improvement, although still lower in the Sham + Swim group ( p  < 0.0001), with no differences between the Graft and Graft + Swim groups. In the SFI60, the Graft and Graft + Swim groups showed improvement in the SFI values (−77.52 ± 11.34 and −84.69 ± 21.65), respectively, and these presented a similar value in the SFI90 (−72.14 ± 19.50 and −84.27 ± 5.78), respectively.

Histology of the Medulla (Counting of Motoneurons)

According to the number of motoneurons, we can observe that there was a difference in the comparisons between the Sham + Swim and Graft groups (647.1 ± 16.42 versus 563.4 ± 8.07; p  < 0.05), and between the Sham + Swim and Graft + Swim groups (647.1 ± 16.42 versus 558.8 ± 14.79; p  < 0.05), but there was no difference between the Graft and Graft + Swim groups ( Fig. 2 ).

Fig. 2

Motoneuron count values after correction by the Abercrombie factor. Thirty animals were divided into the following groups: Sham + Swimming ( n  = 10), Graft ( n  = 10) and Graft + Swimming ( n  = 10) at 0, 30, 60, and 90 days. Analysis of variance (ANOVA) with correction by the Bonferroni post-test. * Differences were found between comparisons (Sham + Swimming versus Graft, Sham + Swimming versus Graft + Swimming); differences with p-values < 0.05 were considered statistically significant.

Discussion

Swimming is a rehabilitation exercise to treat nerve damage. However, the level of resistance and the duration of effective exercise are still unclear. 11

Swimming was applied to the rats 14 days after the surgical procedure, since the functional reinnervation of the muscles starts ∼ 2 or 3 weeks after crushing of the sciatic nerve in rats. Excessive muscle work before this time may be detrimental to recovery. 16 21 22

Studies that evaluate end-to-end neurorrhaphy without graft generally use rehabilitation protocols during 4 weeks of the postoperative period 21 23 24 or a shorter period. 25 Because the grafting application has a worse prognosis and a slower clinical recovery, we adopted an increase from the period of exposure of the animals to swimming.

In our study, the IFC values close to-100 in the group Graft at 60 days showed complete nerve function impairment, suggesting the absence of innervation in this period. In the other evaluations, the values of Graft and Graft + Swim groups became less negative, that indicated a gradual return of function. 15 The Graft and Graft + Swim groups had a less negative SFI at 90 days after the postoperative period, but this group distanced itself of the values presented by the control group.

Ilha et al 21 observed an early improvement of the SFI values in animals submitted to physical exercise after sciatic nerve crush surgery when compared to sedentary rats.

Teodori et al 9 evaluated the morphological aspects and the functional characteristics of sciatic nerves of rats and reported that animals submitted to swimming immediately after nerve injury by crushing and animals submitted to swimming after 14 days of injury had fewer axons and a greater diameter of the axons and nerve fibers than control animals, suggesting that the exercise can be initiated immediately after the injury or in the late phase of the nerve injury.

The number of motoneurons traced with Fluoro-Gold can be used to measure the reconnection of the peripheral nerves in the spinal cord. 27 When we evaluated the number of motoneurons, the values of the anterior horn of the marrow in the Graft and Graft+ Swim groups did not show any statistical difference, remaining below those of the control group.

It has been reported that animals submitted to swimming showed accelerated nervous regeneration compared with control animals with crushing-type nerve damage and increased nerve fiber diameter. 8

Similar to the studies made by Teodori et al. 9 and Oliveira et al. 15 , the protocol adopted here established a phase of adaptation of the animals to the swimming activity, which starts with 20 minutes on the first day and increases 10 minutes every day until reaching 60 minutes on the fifth day. This adaptation period allows animals to become familiar with swimming, avoiding both physical accommodation and stress. On the other hand, there are some differences between the protocol used in the present study and the other data present in the literature.

The surgical method used here was autologous sciatic nerve graft, while other studies used sciatic nerve crushing 9 16 and sciatic nerve transection. 11 The time of the beginning of the applied intervention was on the 14 th day after the surgical procedure, and this period was similar to the study by Teodori et al, 9 and superior to other protocols that started the activity after the 1 st day 9 15 and the 7 th day 11 of the surgical method. Besides, the duration of the swimming intervention was superior to studies that applied activity during 2, 9 3, 15 and 4 weeks. 11 These variables may have affected the effectiveness of the swimming activity in sciatic nerve regeneration.

Thus, the comparison between the results obtained and the findings of the literature is a complex measure, since there is no homogeneity regarding the methodology applied, the surgical technique, the starting time of the protocol, the intensity, the frequency, and the methods of measurement.

Conclusions

Our study demonstrated that the animals submitted to the swimming protocol after the sciatic nerve grafting procedure did not present differences in the SFI values and in the numbers of motoneurons when compared with the control group. We conclude that the type of protocol described is not efficient for the rehabilitation of peripheral nerve lesions that require grafting. Further studies are needed to evaluate methods that accelerate and improve functional outcomes following the sciatic nerve grafting procedure.

Study conducted with animals. Approval number: CEUA 5060051217.

Introdução

As lesões dos nervos periféricos são frequentes na prática clínica e representam um problema de saúde capaz de gerar incapacidade na população. 1 Os fatores etiológicos mais associados às lesões incluem: acidente automobilístico, lesão penetrante, e lesões relacionadas ao esporte. 2

Morfologicamente, ocorre um aumento no tecido conjuntivo intramuscular e atrofia muscular evidenciada pela diminuição na área da secção transversal das fibras musculares. 3 Tais alterações causam dor e sensibilidade ao longo da fibra nervosa, 4 que podem resultar em limitações aos pacientes.

Apesar dos nervos periféricos possuírem a capacidade de regeneração, 5 a recuperação é criticamente dependente do tratamento pós-lesão. 1 Tratamentos não cirúrgicos, como o exercício físico, podem atuar na regeneração nervosa periférica. 4

O exercício físico executado no ambiente aquático induz efeitos fisiológicos que proporcionam benefícios aos sistemas cardiovascular, esquelético, muscular e nervoso que aumentam o processo de reparação tecidual. 6 A natação auxilia na regeneração do nervo ciático em coelhos, 7 peixes 8 e ratos. 9 10 11 Esta parece atuar na remoção da mielina degenerada e na sua síntese na fase regenerativa, 7 acelerando a recuperação nervosa. 10 11

A imersão em ambientes aquáticos gera efeitos fisiológicos, como a elevação geral na temperatura corporal. À medida que a pele se torna aquecida, os vasos sanguíneos superficiais dilatam, o suprimento sanguíneo periférico é aumentado, e a frequência cardíaca eleva. O calor advindo da água reduz a sensibilidade das terminações nervosas sensitivas, auxiliando no alivio da dor e na redução do espasmo muscular. 12 13 Embora haja estudos que tenham mostrado que a natação não promove benefícios na recuperação sensorimotora de ratos após a lesão do nervo ciático. 14 15

Os efeitos da natação na regeneração nervosa são conflitantes, pois alguns autores relataram que os exercícios forçados podem ter efeitos prejudiciais, especialmente no restabelecimento da função muscular. 16 17 O estresse induzido pelo treinamento físico poderia impedir a recuperação funcional após lesão nervosa.

Devido às controvérsias científicas dos benefícios da natação, são necessários estudos que mostrem os efeitos desta atividade física na regeneração do nervo ciático. Neste contexto, o presente estudo tem como objetivo avaliar os efeitos da natação na regeneração nervosa após lesão do nervo ciático em ratos da linhagem Wistar.

Casuística

Foram utilizados 30 ratos machos da linhagem Wistar provenientes do Centro de Desenvolvimento de Modelos Experimentais, com idade de entre 7 e 8 semanas, pesando em média 250 g. Os animais foram mantidos em condições controladas de iluminação (ciclo claro/escuro de 12 horas), temperatura controlada (21 ± 2°C) e livre acesso à água e ração. Todos os animais foram mantidos em biotério até o momento da eutanásia.

O presente trabalho seguiu as normas da legislação vigente para experimentação animal, de acordo com as com as normas nacionais e a legislação internacional (Diretrizes do Colégio Brasileiro de Experimentação Animal, COBEA; Guia dos Institutos Nacionais da Saúde [NIH, na sigla em inglês] para Cuidados e Uso de animais de laboratório). O presente trabalho foi aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA), sob o número 5060051217).

Definição dos grupos de estudos

Os animais foram divididos aleatoriamente em três grupos:

SHAM + NATAÇÃO (Sham + Nat) – Animais que foram submetidos ao procedimento cirúrgico, sem retirada de enxerto, e foram submetidos à natação ( n  = 10);

ENXERTO (Enxerto) – Animais que foram submetidos à cirurgia de enxerto autólogo de nervo ciático ( n  = 10);

ENXERTO + NATAÇÃO (Enx + Nat) – Animais submetidos à cirurgia de enxerto autólogo de nervo ciático e à natação ( n  = 10).

Procedimento cirúrgico

No grupo Sham + Nat, o nervo ciático direito foi exposto por 10 minutos, e a camada muscular foi suturada com nylon monofilamentar 4-0 (Monofilamento preto NY44CT30, Tecnofil, Goiânia, GO, Brasil). Nos outros grupos, o nervo ciático foi cortado e um segmento de 8 mm foi ressecado, deixando um coto distal ∼ 3 mm antes da ramificação nervosa, como descrito por Fernandes et al. 18 O segmento do nervo, agora considerado enxerto de nervo, foi invertido e suturado com 2 pontos de fio monofilamentar 10-0 (Microcirurgia preto N-10005, Techsuture, Bauru, SP, Brasil). 19 A pele e o músculo foram suturados com fio monofilamentar de nylon 4-0 (Monofilamento preto NY44CT30, Tecnofil, Goiânia, GO, Brasil), e a operação foi encerrada.

Pós-operatório

Após a cirurgia, os ratos foram mantidos em gaiolas, submetidos à dieta padrão do biotério, água ad libitum , e a um ciclo claro/escuro de 12 horas. O tratamento imediato foi realizado com a administração de cloridrato de tramadol (5mg/kg, intraperitoneal). Em seguida, foi disponibilizado o tratamento com paracetamol e cetoprofeno por via oral adotando a dose preconizada para ratos de 1,5 mg/ml e 5mg/kg, respectivamente, a cada 24 horas, durante ≥ 5 dias, se houvesse sinais de dor.

Avaliação da marcha

A avaliação da marcha foi realizada antes do procedimento cirúrgico (tempo 0) e após 30, 60 e 90 dias. Os animais foram avaliados através do sistema CatWalk XT (Noldus Information Technology Inc., Leesburg, VA, EUA), que analisa pegadas através de uma passarela transparente acoplada a um sistema de computador. Estas pegadas foram utilizadas para calcular o índice funcional do ciático (IFC). 19

Protocolo da natação

Os ratos dos grupos Sham + Nat e Enx + Nat foram colocados em uma piscina de 55 cm de altura, a mesma foi preenchida com 150 litros de água a uma temperatura de 30 ± 2°C, e os ratos foram induzidos a nadar. Antes do procedimento cirúrgico, os animais passaram por um período de adaptação progressiva durante 5 dias, iniciando o treinamento com 20 minutos até atingir 1 hora de natação. O exercício de natação foi iniciado no 14° dia após a cirurgia, com duração de 2 semanas, no qual os animais nadaram 30 minutos por 5 vezes na semana. Após esta etapa, os animais executaram a atividade de natação por 9 semanas seguindo o cronograma de 30 minutos por 3 vezes na semana. 9

Cirurgia para marcação neuronal

A marcação neuronal foi realizada com o marcador neuronal retrógrado Fluoro-Gold (Fluorochrome, LLC, Denver, CO, USA), em uma concentração de 3%, no mesmo procedimento, através da exposição do coto proximal, distal à 2ª sutura do nervo durante 90 minutos, para posterior contagem dos neurônios no corno anterior da medula. 20

Perfusão transcardíaca e extração da medula espinhal

A perfusão transcardíaca foi realizada 48 horas após a marcação neuronal, através de abertura da caixa torácica e exposição do coração. O ventrículo esquerdo foi puncionado com agulha e as soluções infundidas foram drenadas através de uma secção do átrio direito. Durante a perfusão, foram utilizadas as soluções tampões fosfato 0,2M, paraformaldeído 4% e sacarose 10%, em pH fisiológico. 20

Imediatamente após a perfusão, foi realizada a laminectomia e um segmento da medula espinhal foi removido, usando um microscópio cirúrgico (MCT MU-M 19, DFVasconcelos, São Paulo, SP, Brasil). As raízes de L3 e S1 foram identificadas na origem e seccionadas transversalmente de modo a manter os segmentos L4, L5 e L6 intactos. Os segmentos da medula espinhal foram crioprotegidos em sacarose 20% e seccionados em criostato em uma espessura 40 µm. As fatias foram montadas em lâminas de vidro e analisadas por microscopia de fluorescência. 18

Análise histológica do segmento de medula

Para a análise histológica, foi feito um estudo quantitativo de neurônios marcados pelo marcador neuronal retrógrado Fluoro-Gold no corno anterior da medula. Utilizando os aumentos de 25, 50, 100 e 400 vezes do microscópio de fluorescência ZEISS Axiolab (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Alemanha), todas as secções foram examinadas e os motoneurônios marcados foram computados. Todas as análises foram realizadas pelo mesmo examinador. A análise histológica foi realizada aleatoriamente na medula de cinco animais de cada grupo. Nesta, foram consideradas apenas as células fortemente positivas para Fluoro-Gold, sendo utilizado o critério de correção de Abercrombie (1946) apud Fernandes et al. 20

Análise Estatística

Os resultados foram avaliados no programa GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, San Diego, CA, EUA). O teste de Shapiro-Wilk foi usado para determinar a normalidade da distribuição de dados. As variáveis paramétricas entre os três grupos foram determinadas pelo teste de análise de variância (ANOVA) com correção pelo pós-teste de Bonferroni. Foram consideradas diferenças estatisticamente significativas os valores de p  ≤ 0,05.

Índice Funcional do Ciático

Na primeira avaliação, todos os valores do IFC foram semelhantes entre os grupos Sham + Nat (−17,78), Enxerto (−20,64) e Enx + Nat (−14,184), com p  = 0,6099.

O grupo Sham + Nat obteve os índices nos limites da normalidade em todas as mensurações, permanecendo seus valores negativos e próximos do zero. Após o procedimento cirúrgico, os valores de IFC nos grupos experimentais (Enx e Enx + Nat) foram significativamente menores do que os do grupo Sham + Nat ( p  < 0,001; Tabela 1 ; Figura 1 ). Nos grupos Enx e Enx + Nat, como o esperado, a 1ª mensuração após a cirurgia de enxerto exibiu uma queda brusca nos valores do IFC30 (−145,9 ± 26,06 e −89,40 ± 7,501, respectivamente).

Tabela 1

Análise do índice funcional do ciático entre os grupos Sham + Natação, Enxerto e Enxerto + Natação nos tempos de 0, 30, 60 e 90 dias

Tempo	Grupo	Média	DP	Mediana	Mínimo	Máximo	n	valor-p
0	Sham + Natação	−17,78	17,27	−24,27	−25,74	24,82	8	0,6099
	Enxerto	−20,64	9,679	−18,82	−35,16	−8,360	9
	Enxerto + Natação	−14,18	13,46	−17,83	−25,57	−25,57	9
30	Sham + Natação	−34,64	13,89	−32,41	−50,20	−13,79	7	p <  0,0001*
	Enxerto	−145,9	26,06	−143,3	−190,2	−100,4	10
	Enxerto + Natação	−89,40	7,501	−89,03	−100,2	−74,30	9
60	Sham + Natação	−26,97	13,28	−20,28	−50,12	−13,32	7	p <  0,0001 #
	Enxerto	−77,52	11,34	−80,24	−91,15	−58,36	10
	Enxerto + Natação	−84,69	21,65	−91,44	−102,6	−27,64	10
90	Sham + Natação	−19,11	11,33	−21,26	−36,82	−2,870	8	p  < 0,0001 #
	Enxerto	−72,14	19,50	−73,37	−107,5	−41,16	10
	Enxerto + Natação	−84,27	5,782	−83,74	−92,28	−75,10	8

Abreviação: DP, desvio padrão.

Nota: n  = número amostral. Teste de análise da variância (ANOVA) com correção pelo pós-teste de Bonferroni. Foram consideradas diferenças estatisticamente significativas valores–p ≤ 0,05. *; diferenças entre todas as comparações (Sham + Natação versus Enxerto, Sham + Natação versus Enxerto + Natação, Enxerto versus Enxerto + Natação); # ; diferenças entre os grupos: Sham + Natação versus Enxerto, Sham + Natação versus Enxerto + Natação.

Fig. 1

Análise do índice funcional do ciático entre os grupos Sham + Natação, Enxerto e Enxerto + Natação nos tempos de 0, 30, 60 e 90 dias.

No seguimento pós-operatório (60 e 90 dias), os 2 grupos enxertados tiveram uma melhora funcional progressiva, embora ainda inferiores à do grupo Sham + Nat ( p  < 0,0001), sem diferenças entre os grupos Enx e Enx + Nat. No IFC60, os grupos Enx e Enx + Nat apresentaram melhora nos valores de IFC (−77,52 ± 11,34 e −84,69 ± 21,65, respectivamente), e estes apresentaram valores semelhantes no IFC90 (−72,14 ± 19,50 e −84,27 ± 5,78, respectivamente).

Histologia da medula (contagem de motoneurônios)

De acordo com o número de motoneurônios, podemos observar que houve diferença nas comparações entre os grupos Sham + Nat e Enxerto (647,1 ± 16,42 versus 563,4 ± 8,07; p  < 0,05) e entre os grupos Sham + Nat e Enx + Nat (647,1 ± 16,42 versus 558,8 ± 14,79; p  < 0,05), não havendo diferença entre os grupos Enxerto e Enx + Nat ( Figura 2 ).

Fig. 2

Valores da contagem de motoneurônios após correção pelo fator Abercrombie. Foram avaliados 30 animais divididos nos seguintes grupos: Sham + Natação ( n  = 10), Enxerto ( n  = 10), e Enxerto + Natação ( n  = 10), nos tempos de 0, 30, 60 e 90 dias. Teste de análise da variância (ANOVA) com correção pelo pós-teste de Bonferroni. * Foram encontradas diferenças entre as comparações (Sham + Natação versus Enxerto, Sham + Natação versus Enxerto + Natação), foram consideradas diferenças estatisticamente significativas valores-p ≤ 0,05.

Discussão

A natação é um exercício de reabilitação para tratar a lesão nervosa. Porém, o nível eficaz de resistência e de duração do exercício ainda não é claro. 11

A natação foi aplicada nos ratos 14 dias após o procedimento cirúrgico, pois a reinervação funcional dos músculos inicia ∼ 2 ou 3 semanas após o esmagamento do nervo ciático em ratos. O excesso de trabalho do músculo antes deste período pode ser prejudicial à recuperação. 16 21 22

Os estudos que avaliam a neurorrafia término-terminal sem enxerto geralmente utilizam protocolos de reabilitação durante 4 semanas do pós-operatório 21 23 24 ou um período menor. 25 Pela aplicação do enxerto demonstrar pior prognóstico e uma recuperação clínica mais lenta, nós adotamos um aumento do período de exposição dos animais à natação.

No presente estudo, não foi observada nenhuma diferença clínica medida através do IFC. Os valores obtidos, entre 0 e −20, no período pré-operatório, refletiam uma função normal. 26 Em nosso estudo, os valores de IFC próximos a -100 no grupo enxerto aos 60 dias apresentaram comprometimento completo da função nervosa, sugerindo ausência de inervação nesse período. Nas demais avaliações, os valores dos grupos Enxerto e Enxerto + Natação se tornaram menos negativos, indicando retorno gradual da função. 15 O grupo Enxerto e Enx + Nat apresentaram um IFC menos negativo em 90 dias após o pós-operatório, mas este se distanciou dos valores apresentados pelo grupo controle.

Ilha et al 21 observaram uma melhora precoce dos valores do IFC em animais submetidos ao exercício físico pós-cirurgia de esmagamento do nervo ciático quando comparados aos ratos sedentários.

Teodori et al 9 avaliaram os aspectos morfológicos e as características funcionais dos nervos ciáticos de ratos e relataram que os animais submetidos à natação imediatamente após a lesão do nervo por esmagamento e animais submetidos à natação após 14 dias da lesão apresentaram menor número de axônios e maior diâmetro dos axônios e das fibras nervosas que animais controles, sugerindo que o exercício pode ser iniciado imediatamente após a lesão ou na fase tardia da lesão nervosa.

O número de motoneurônios marcados com Fluoro-Gold pode ser utilizado para aferir a reconexão dos nervos periféricos na medula espinhal. 27 Quando avaliamos o número de motoneurônios, os valores do corno anterior da medula nos grupos Enxerto e Enx + Nat não mostraram nenhuma diferença estatística, permanecendo abaixo dos do grupo controle.

Tem sido relatado que animais submetidos à natação apresentaram regeneração nervosa acelerada em comparação a animais de controle com lesão nervosa do tipo esmagamento e o aumento do diâmetro das fibras nervosas. 8

À semelhança dos estudos de Teodori et al. 9 e Oliveira et al. 15 , o protocolo adotado aqui estabeleceu uma fase de adaptação dos animais à atividade de natação, que começa 20 minutos no primeiro dia e aumenta 10 minutos todos os dias até atingir 60 minutos no quinto dia. Esse período de adaptação permite que os animais se familiarizem com a natação, evitando tanto a acomodação física quanto o estresse. Por outro lado, existem algumas diferenças entre o protocolo utilizado no presente estudo e os demais dados presentes na literatura.

O método cirúrgico aqui adotado foi do tipo enxerto autólogo do nervo ciático, enquanto outros estudos utilizaram o esmagamento do nervo ciático 9 16 e a transecção do nervo ciático. 11 O momento do início da intervenção aplicada foi no 14° dia após o procedimento cirúrgico, e este período foi semelhante ao do estudo de Teodori et al 9 e superior a outros protocolos que iniciaram a atividade após o 1° dia 9 15 e o 7° dia 11 do método cirúrgico. Além disso, a duração da intervenção da natação foi superior aos estudos que aplicaram a atividade durante 2, 9 3, 15 e 4 semanas. 11 Estas variáveis podem ter afetado a eficácia da atividade da natação na regeneração do nervo ciático.

Dessa forma, a comparação entre os resultados obtidos e os achados da literatura é uma medida complexa, pois não existe homogeneidade quanto à metodologia aplicada, à técnica cirúrgica, ao tempo de início do protocolo, à intensidade, à frequência, e aos métodos de aferição.

Conclusões

Nosso estudo demonstrou que os animais submetidos ao protocolo de natação após o procedimento de enxerto do nervo ciático não apresentaram diferenças nos valores de IFC e nos números de motoneurônios quando comparados ao grupo controle. Concluímos que este tipo de protocolo descrito não é eficiente para reabilitação de lesões nervosas periféricas que necessitam de enxerto. Novos estudos são necessários para avaliar métodos que acelerem e melhorem os resultados funcionais após o procedimento de enxerto do nervo ciático.

Estudo realizado com animais. Segue aprovação (CEUA n° 5060051217).