Comparative Analysis of the Effect of Two Therapeutic Ultrasound Protocols for Regeneration of a Critical Bone Defect.

Objective  To compare the effect of two therapeutic ultrasound protocols, with different times of exposure in the regeneration of critical bone defect. Methods  Forty-five male rats were distributed among three experimental groups: therapeutic ultrasound group 5 minutes (TUG 5); therapeutic ultrasound group 10 minutes (TUG 10); and control group (CG). In all groups, a critical bone defect of 8.5 mm diameter was made in the calvaria region. The protocol was initiated on the 1 st postoperative day in TUGs 5 and 10, with therapeutic ultrasound at the frequency of 1.0 MHz, pulsed mode, five times a week, at periods of 15, 30, and 60 days. Results  Among the experimental groups, the highest volume of neoformation of osteoid matrix took place in the TUG 10 group followed by TUG 5, when compared with the CG group, in which the neoformation was restricted to the border region. The use of ultrasound promoted an increase in the thickness of the conjunctive matrix, proliferation of capillaries, alignment of the collagen fibers, reduction of edema and inflammatory process, being more significant in the 10-minutes time period. Conclusion  Therapeutic ultrasound stimulated the repair of a critical bone defect, and the longer exposure time promoted greater osteogenic stimulation.

Introduction

Bone tissue is characterized by its strength and hardness properties resulting from the combination of its organic and inorganic components. Despite these properties, this tissue can undergo extensive lesions, called critical bone defects, which compromise the structural integrity and physiology of bone repair. 1 2

Critical bone defects are caused by clinical conditions such as trauma and surgical procedures involving bone resection, which compromise the physiological process of bone regeneration, resulting in repair with formation of fibrous connective tissue. 3 4 This tissue compromises the structure, function, and aesthetics, 5 and it can lead to reduced quality of life of the individual, impacting the performance of their activities of daily life and work, with possible psychological and economic consequences. In this context, the physiotherapist, included in the multidisciplinary team, participates in the rehabilitation of individuals with this clinical condition.

During the rehabilitation process, therapeutic resources that emit vibrating mechanical waves may be employed to assist, repair, and stimulate osteogenesis. 6 Among these resources, therapeutic ultrasound is included, and it has been used in clinical physical therapy practice for many years, 7 consisting in an equipment that emits high-frequency waves of acoustic pressure, which, when interacting with biological tissues, promote micromechanical alterations. These changes generate biochemical events capable of accelerating fracture healing, stimulate repair of injured tissues such as bone and muscle tissue, inhibit inflammatory responses, and participate in the pain modulation process. 7 8 9 10

The tissue response and efficacy of this therapy are closely related to the selected parameters before starting treatment. Thus, it is of fundamental importance to properly choose the frequency, intensity, current emission mode, application time and coupling medium indicated for each lesion. 7 8 The literature provides a variety of parameters, especially regarding the time of exposure to the ultrasonic wave, employed in the healing process of bone fractures.

Albertin 11 made a bone defect of 2.0 cm in rabbit radius and stimulated the region with ultrasonic wave for 5, 10, 20, and 40 minutes over a period of 15 days, noting that the longer times promoted greater stimulation to bone consolidation when compared with the time of 5 minutes. However, Pereira and others, 2 after inducing rat tibial fracture and stimulating the region with ultrasound for 10 minutes over a 13-day period, found that the protocol used did not promote a statistically significant difference between the group in which the therapy was performed and the control group, despite the increase of alkaline phosphatase and the diameter of the newly formed bone tissue.

Azuma et al 12 performed femoral fractures in rats and analyzed the effect of ultrasound for 20 minutes daily, at 8 and 24 days, concluding that ultrasound accelerated healing regardless of the treatment period, with improved torsional strength and increased new bone formation.

Given the diversity of protocols involved in bone injury rehabilitation, this study aims to compare the effect of two therapeutic ultrasound protocols with different exposure times for critical bone defect regeneration.

Materials and Methods

This experiment was approved by the Animal Use Ethics Committee, under protocol number 101/2016, and is in accordance with the precepts of the law n° 11,794, from October 08, 2008, and of the decree n° 6,899, July 15, 2009, and with the rules issued by the National Council for the Control of Animal Experimentation (CONCEA, in the Portuguese acronym).

The surgical procedures were performed in the central bioterium (animal facility) of our university, where the animals were allocated during the experiment.

Forty-five rats ( Rattus norvegicus ) of the Wistar albinus lineage were used. They were young adults, male, and weighed 350 to 400 grams.

The surgical technique was preceded in all animals by general anesthesia and sedation with intramuscular injection of ketamine hydrochloride (100 mg/kg) and xylazine hydrochloride (40 mg/kg), respectively, followed by trichotomy and asepsis in the calvaria region. Soon after, each animal was placed in prone position to perform the surgical procedure.

The methodology of the surgical procedure was similar to the work performed by Almeida et al, 4 Miguel et al, 13 Câmara-Pereira et al, 14 Ribeiro et al, 15 and Daltro et al 16 to produce an 8.5-mm diameter critical bone defect in the calvaria region ( Figure 1 ).

Fig. 1

Stage of the surgical procedure. Removal of subcutaneous tissue, muscles, and the marking of defect ( A ); bone fragment removal ( B ). Source: Author elaboration.

After making the critical bone defect, the animals were divided into 3 groups, with biological points of 15, 30, and 60 days, to compose the following categories: therapeutic ultrasound group 5 minutes ( TUG 5 ), with application of mechanical waves emitted by the therapeutic ultrasound for 5 minutes on bone defect filled with blood clot; therapeutic ultrasound group 10 minutes (TUG 10), with application of mechanical waves emitted by the therapeutic ultrasound for 10 minutes on bone defect filled with blood clot; control group ( CG ), without application of mechanical waves emitted by therapeutic ultrasound. For the acquisition of macroscopic images, a Nikon D 3100 digital camera (Nikon Corp., Minatom, Tokyo, Japan) was used.

Therapeutic Ultrasound Application Protocol

Protocols were started on the 1 st postoperative day. All animals in TUG 5 and TUG 10 were anesthetized and sedated to allow the implementation of the therapeutics, followed, when necessary, by trichotomy in the calvaria region. Subsequently, each animal was individually positioned, in prone position, on the procedure table, and water-soluble gel was applied to the calvaria region and the upper part of the water bag ( Figure 2 ).

Fig. 2

Use of therapeutic ultrasound. Source: Author elaboration.

A low-intensity therapeutic ultrasound equipment was used, Sonopulse III model (Ibramed, Amparo, SP, Brazil), which had been previously calibrated by the manufacturer, with a 1 MHz frequency, pulsed mode, 0.2 W/cm 2 intensity, 50% duty cycle, pulse repetition frequency of 16 Hz and a 7 cm 2 effective radiating area (ERA) size. During the therapeutic ultrasound application, slow, circular and continuous movements with the transducer were performed for 5 or 10 minutes, depending on the experimental group. The protocol was performed 5 times a week, with a 48-hour break, at 15, 30, and 60-day biological points, which are equivalent, respectively, to 11, 22, and 44 ultrasound applications.

The protocols were established after adaptation of those used by Albertin, 11 Barreto, 17 and Skau et al, 18 and a pilot test was conducted, as it was not found, in the available literature, a report of a therapeutic ultrasound therapy protocol with national equipment for regeneration of critical bone defect. After the therapeutic protocols were conducted, the animals were kept in a warm place to recover from anesthetic narcosis and then placed in individual cages.

After the biological points of 15, 30, and 60 days, the animals were euthanized, the calvarias were removed and fixed in 10% buffered formalin and kept in plastic collectors for 72 hours. Then, the samples were cleaved at the lateral and inferior regions, followed by division into 2 portions, with approximately ⅔ anterior and ⅓ posterior.

The anterior portion was decalcified in a 7% ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) solution, for 7 days, with acid exchange every 24 hours. The calvaria were processed, embedded in paraffin, and serially cut into a microtome of 5.0 µm. Routine hematoxylin and eosin (H&E) staining technique was used; to identify collagen proteins, we used picrosirius red (PSR), and to identify the bone matrix, the Masson-Goldner trichrome kit was used. In the histological analysis, the Leica DM6 B digital vertical microscope (Leica Camera AG, Wetzlar, Germany) and the LAS V4.12 software (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany) were used.

Results

Therapeutic Ultrasound Group 5

At 15 days, there was nonspecific reactive osteoid matrix formation ( Figure 3A ), which increased at 30 days ( Figure 3B ) and stabilized at 60 days ( Figure 3C ), although restricted to bone edge regions, without restoration of the original bone volume. Active osteoblasts were present at all biological points. The extent of the defect was filled by loose connective tissue matrix, which was thinner in the central region of the defect at 15 days, and evolved for continuous thickening after 30 days; however, at 60 days, it was reduced ( Figure 3C ). In all biological points, the presence of collagen fibers was observed, which, at 30 days, presented in parallel ( Figure 3B ) and diffuse proliferation of capillaries. At 15 days, the edema was moderate, and there was diffuse mononuclear inflammatory infiltrate, which decreased at 30 days and became inconspicuous at 60 days.

Fig. 3

Therapeutic ultrasound group 5 - Photomicrograph of critical bone defect with presence of osteoid matrix neoformation (*). ( A ) At 15 days, presence of active osteoblasts and several capillary spaces (hematoxylin and eosin – H&E). ( B ) Alignment of collagen fibers at 30 days (picrosirius red). ( C ) Reduction of loose connective tissue thickening at 60 days (H&E). Fonte: Author elaboration.

Therapeutic Ultrasound Group 10

At 15 days, the osteoid matrix neoformation was restricted to the bone border ( Figure 4A ), and it evolved, from 30 days on ( Figure 4B ), to formation in centripetal direction ( Figure 4C ), without restoration of the original bone volume. The osteoblasts remained present and active at all biological points, and the defect area was filled with loose connective tissue, which presented thickness increase in its whole extension. At all biological points, collagen fibers were organized in parallel ( Figure 4B ), blood vessels proliferated, with angiogenesis stabilization at 60 days. Edema and mononuclear inflammatory infiltrate were reduced and became absent at 60 days.

Fig. 4

Therapeutic ultrasound group 10 - Photomicrograph of critical bone defect with presence of osteoid matrix neoformation (*). ( A ) Presence of active osteoblasts and various capillary spaces at 15 days (hematoxylin and eosin H&E). ( B ) 30 days parallel collagen fiber organization (picrosirius red). ( C ) Neoformation of osteoid matrix in centripetal direction at 60 days (H&E). Fonte: Author elaboration.

Control Group

Reactive osteoid matrix neoformation was restricted to the bone edge at all biological points ( Figures 5 A , B and C ), without restoration of the original bone volume. Only at 15 days, there were active osteoblasts. Defect filling at all biological points occurred with loose connective tissue, which was thin at 15 days and even thinner at 60 days ( Figure 5C ), with a thickness smaller than the bone edge. Few capillaries were found, and, at 30 and 60 days, stabilization of angiogenesis, mild edema and diffuse mononuclear inflammatory infiltrate that later became absent.

Fig. 5

Control group - Photomicrograph of critical bone defect with presence of osteoid matrix neoformation (*). ( A ) Active osteoblasts and few capillary spaces at 15 days (hematoxylin and eosin – H&E). ( B ) Defect filling with thin loose connective tissue at 30 days (picrosirius red). ( C ) Osteoid matrix neoformation restricted to bone borders at 60 days (H&E). Fonte: Author elaboration.

Discussion

The absence of standardization of therapeutic ultrasound protocols to assist tissue regeneration may compromise the desired therapeutic outcome. Thus, it is necessary that the parameters to be used in the rehabilitation must be carefully chosen and unified. 8 Among the various parameters is the time variable, poorly studied in the available scientific articles; thus, the need to define the treatment time to be used in each lesion is imperative. 8 Therefore, the experiment aimed to compare the effect of two protocols of different therapeutic ultrasound treatment times on critical bone defect regeneration.

Early ultrasound wave therapy increased tissue repair, as the effect of ultrasound is mainly related to the time interval between the beginning of the lesion and the beginning of treatment. Thus, the earlier the therapy is started, the faster is the tissue recovery. 2 19 20 21

In the present study, the results obtained in the initial phase of the repair showed that the 5 and 10 minutes time were not sufficient to stimulate the increase of neoformation in the critical bone defect. 10 The evolution presented in the other biological points of TUG 5 may have been motivated by the prolongation of bone tissue stimulation, which is capable of promoting remodeling regions, 10 as it was considered sufficient time to promote bone healing. 18 However, some authors 11 22 23 state that the ideal time to promote osteogenic stimulation and tissue organization starts after 10 minutes, suggesting that ultrasound has a dose-dependent effect considering the stimulation time.

The increase found in late TUG 10 biological points may have occurred as a result of the prolongation of stimulation in the mechanotransduction pathway, which enhances osteogenic stimulation and generates an increase in bone neoformation rate. 24 However, in the CG, the neoformation limitation was maintained 24 due to the absence of additional stimulus.

The cellular pattern found in the experimental groups in which ultrasound therapy was performed demonstrated that ultrasonic waves are capable of inducing and promoting the activation and differentiation of mesenchymal and osteoprogenitor cells. 19 24 Although this mechanism of osteogenesis induction is not elucidated through this therapeutic resource, 24 ultrasound is known to stimulate mesenchymal cells to differentiate into osteoblasts, which, in turn, have their cellular activity stimulated. In addition, ultrasound accelerates osteoblast differentiation and promotes increased bone mineralization. 25 26

The repair tissue that filled the defect in TUG 5 and TUG 10 was stimulated by ultrasonic waves that, in addition to promoting mesenchymal cell synthesis, stimulate collagen and fibroblasts, especially when used in the initial repair phase, 10 19 20 24 as we proceeded in this experiment. After 2 minutes of ultrasonic wave emission, fibroblast growth is stimulated, 27 and collagen fiber alignment happens after 3 minutes. 8

In this study, ultrasound showed promise in stimulating angiogenesis both at 5 and 10 minutes of therapy, when vascularization takes place from the initial repair phase, 10 and became evident in the late phase, which favors the bone repair process. 25

There are two hypotheses to justify the angiogenesis promoted by ultrasound: the stimulus to increase interleukin-8 (IL-8) secretion and the production of vascular endothelial growth factor (VEGF). Ultrasonic waves are supposed to regulate IL-8 secretion by osteoblasts, as it is a cytokine responsible for inducing endothelial cell proliferation and migration, which leads to angiogenesis. The second hypothesis suggests that ultrasound stimulates the production of VEGF also by osteoblasts, a fundamental factor for angiogenesis, which acts in the regulation of mitosis and recruitment of endothelial cells. 28

The ultrasonic waves promoted the reduction of the inflammatory process after the times of 5 and 10 minutes of therapy, as they favored the acceleration of the inflammatory phase, resulting from the increase and release of mononuclear cells, as well as the histamine release, which promotes a rapid resolution of the inflammatory process. 20 29 Due to this mechanism, ultrasound is able to eliminate the inflammatory process from the early stage of repair. 23

Despite having osteogenic effect and allowing its use in situations in which repair is critical, the therapeutic ultrasound did not show efficacy regarding the restoration of the original bone tissue volume and morphology in any of the protocols. Thus, in order to enhance the effects of ultrasonic waves, it is suggested a possible association of this therapeutic resource with a tridimensional scaffold, which will serve as a structural and mechanical support, enhance cell growth, and induce cell differentiation. 16 30

Conclusion

Therapeutic ultrasound stimulated the repair of the critical bone defect, and longer exposure promoted greater osteogenic stimulation.

Introdução

O tecido ósseo se caracteriza por possuir propriedades de resistência e dureza decorrentes da combinação dos seus componentes orgânicos e inorgânicos. Apesar de tais propriedades, esse tecido pode sofrer lesões extensas, denominadas defeitos ósseos críticos, que comprometem a integridade estrutural e a fisiologia do reparo ósseo. 1 2

Os defeitos ósseos críticos são causados por condições clínicas como, por exemplo, traumas e procedimentos cirúrgicos em que há ressecção óssea que comprometem o processo fisiológico da regeneração óssea, cujo resultado é o reparo com formação de tecido conjuntivo fibroso. 3 4 Esse tecido compromete a estrutura, a função e a estética, 5 pode ocasionar redução da qualidade de vida do indivíduo, impactar o desempenho das suas atividades de vida diária e laboral, com possíveis consequências psicológicas e econômicas. Nesse contexto, o fisioterapeuta, inserido na equipe multiprofissional, participa da reabilitação de indivíduos que apresentam esse quadro clínico.

Durante o processo de reabilitação, podem ser empregados recursos terapêuticos que emitem ondas mecânicas vibratórias, a fim de auxiliar o reparo e estimular a osteogênese. 6 Entre esses recursos, inclui-se o ultrassom terapêutico, utilizado há anos na prática clínica fisioterapêutica, 7 equipamento esse que emite ondas de alta frequência de pressão acústica que, ao interagir com os tecidos biológicos, promovem alterações micromecânicas. Essas alterações geram eventos bioquímicos capazes de acelerar a consolidação de fraturas, estimular o reparo de tecidos lesionados, como o tecido ósseo e o muscular, inibir respostas inflamatórias e participar do processo de modulação da dor. 7 8 9 10

A resposta tecidual e a eficácia dessa terapia têm estreita relação com os parâmetros selecionados antes de iniciar-se o tratamento. Assim, é de fundamental importância elegerem-se adequadamente a frequência, a intensidade, o modo de emissão da corrente, o tempo de aplicação e o meio acoplador indicados para cada lesão. 7 8 A literatura disponibiliza uma diversidade de parâmetros, principalmente quanto ao tempo de exposição à onda ultrassônica, empregados no processo de cicatrização de fraturas ósseas.

Albertin 11 confeccionou defeito ósseo de 2,0 cm no rádio de coelhos e estimulou a região com onda ultrassônica por 5, 10, 20, e 40 minutos, no período de 15 dias, tendo observado que os tempos mais longos promoveram maior estímulo à consolidação óssea quando comparados com o tempo de 5 minutos. Entretanto, Pereira e outros, 2 após induzir fratura na tíbia de ratos e estimular a região com ultrassom por 10 minutos, no período de 13 dias, constatou que o protocolo utilizado não promoveu diferença estatística significativa entre o grupo no qual se realizou a terapia e o grupo controle, apesar do aumento da fosfatase alcalina e do diâmetro do tecido ósseo neoformado.

Azuma et al. 12 realizaram fratura no fêmur de ratos e analisaram o efeito do ultrassom por 20 minutos diários, nos períodos de 8 e 24 dias, tendo concluído que o ultrassom acelerou a cicatrização independentemente do período de tratamento, com melhora na força de torção e aumento da neoformação óssea.

Diante da diversidade de protocolos envolvidos na reabilitação de lesões ósseas, este estudo tem como objetivo comparar o efeito de dois protocolos de ultrassom terapêutico com diferentes tempos de exposição para regeneração de defeito ósseo crítico.

Material e Métodos

Este experimento foi aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais, sob protocolo n° 101/2016, e encontra-se de acordo com os preceitos da lei n° 11.794, de 08 de outubro de 2008, do Decreto n° 6.899, de 15 de julho de 2009, e com as normas editadas pelo Conselho Nacional de Controle da Experimentação Animal (CONCEA).

Os procedimentos cirúrgicos foram realizados no Biotério Central da nossa universidade, onde os animais ficaram alocados durante a realização do experimento.

Foram utilizados 45 ratos, Rattus norvegicus, da linhagem Wistar albinus , jovens adultos, machos, com peso de 350 a 400 gramas.

A realização da técnica cirúrgica foi precedida, em todos os animais, pela anestesia geral e pela sedação com injeção intramuscular de cloridrato de cetamina (100 mg/kg) e de cloridrato de xilazina (40 mg/kg), respectivamente, a que se seguiu a tricotomia e a assepsia na região da calvária. Logo em seguida, cada animal foi posicionado em decúbito ventral para realização do procedimento cirúrgico.

A metodologia do procedimento cirúrgico foi semelhante à dos trabalhos realizados por Almeida et al., 4 Miguel et al., 13 Câmara-Pereira et al., 14 Ribeiro et al., 15 e Daltro et al. 16 para confecção de defeito ósseo crítico, de 8,5 mm de diâmetro, na região da calvária ( Figura 1 ).

Fig. 1

Etapa do procedimento cirúrgico. Remoção do tecido subcutâneo, dos músculos e marcação do defeito ( A ); remoção do fragmento ósseo ( B ). Fonte: Elaboração da autora.

Após a confecção do defeito ósseo crítico, os animais foram distribuídos em 3 grupos, com pontos biológicos de 15, 30, e 60 dias, para compor as seguintes categorias: grupo ultrassom terapêutico 5 minutos ( GUS 5 ), com aplicação de ondas mecânicas emitidas pelo ultrassom terapêutico por 5 minutos sobre defeito ósseo preenchido por coágulo sanguíneo; grupo ultrassom terapêutico 10 minutos ( GUS 10 ), com aplicação de ondas mecânicas emitidas pelo ultrassom terapêutico por 10 minutos sobre defeito ósseo preenchido por coágulo sanguíneo; grupo controle ( GC ), sem aplicação das ondas mecânicas emitidas pelo ultrassom terapêutico. Para aquisição das imagens macroscópicas, foi utilizada uma câmera digital Nikon D 3100 (Nikon Corp., Minato, Tóquio, Japão ).

Protocolo de Aplicação do Ultrassom Terapêutico

Os protocolos foram iniciados no 1° dia do pós-operatório. Em todos os animais do GUS 5 e do GUS 10 foram realizadas anestesia e sedação para permitir a aplicação da terapêutica, seguidas de, quando necessário, tricotomia na região da calvária. Posteriormente, cada animal foi posicionado individualmente, em decúbito ventral, na mesa de procedimentos, e foi aplicado gel hidrossolúvel nas regiões da calvária e na parte superior da bolsa de água ( Figura 2 ).

Fig. 2

Utilização do ultrassom terapêutico. Fonte: Elaboração da autora.

Utilizou-se equipamento de ultrassom terapêutico de baixa intensidade, modelo Sonopulse III (Ibramed, Amparo, SP, Brasil), que havia sido previamente calibrado pelo fabricante, com frequência de 1 MHz, modo pulsado, intensidade 0,2 W/cm 2 , 50% de ciclo de trabalho, frequência de repetição de pulso de 16 Hz e tamanho de área efetiva de radiação (AER) de 7 cm 2 . Durante a aplicação do ultrassom terapêutico, foram realizados movimentos lentos, circulares e contínuos com o transdutor, por 5 ou 10 minutos, a depender do grupo experimental. O protocolo foi realizado 5 vezes por semana, com pausa de 48 horas, nos pontos biológicos de 15, 30, e 60 dias, o que equivale, respectivamente, a 11, 22, e 44 aplicações do ultrassom.

Os protocolos foram estabelecidos após adaptação dos utilizados por Albertin, 11 Barreto, 17 e Skau et al., 18 e realização de teste-piloto, por não se ter localizado, na literatura disponível, relato de protocolo de terapia por ultrassom terapêutico, com equipamento nacional, para regeneração de defeito ósseo crítico. Após os protocolos terapêuticos, os animais foram mantidos em local aquecido para recuperação da narcose anestésica e, em seguida, colocados em gaiolas individuais.

Após os pontos biológicos de 15, 30, e 60 dias, os animais foram eutanasiados, as calvárias foram removidas e fixadas em formol tamponado a 10% e mantidas em coletores plásticos por 72 horas. Em seguida, as amostras foram clivadas nas regiões laterais e inferior, seguindo-se a divisão em 2 porções, sendo de, aproximadamente, ⅔ a anterior e de ⅓ a posterior.

A porção anterior foi descalcificada em solução de ácido etileno-diamino-tetracético (EDTA) a 7%, durante 7 dias, com troca do ácido a cada 24 horas. As calvárias foram processadas, incluídas em parafina e cortadas de forma seriada em um micrótomo com espessura de 5,0 µm. Utilizou-se a técnica de coloração de rotina com hematoxilina e eosina (H&E); para identificar proteínas colagênicas, empregou-se o picrosirius red (PIFG) e, para identificar a matriz óssea, foi usado o kit tricrômico de Masson-Goldner. Na análise histológica, foi utilizado o microscópio vertical digital Leica DM6 B (Leica Camera AG, Wetzlar, Alemanha) e o software LAS V4.12 (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Alemanha).

Grupo ultrassom terapêutico 5

Aos 15 dias, houve formação de matriz osteoide reacional e inespecífica ( Figura 3A ), que foi incrementada aos 30 dias ( Figura 3B ) e estabilizada aos 60 dias ( Figura 3C ), embora restrita às regiões de borda óssea, com ausência do restabelecimento do volume ósseo original. Os osteoblastos ativos estavam presentes em todos os pontos biológicos. A extensão do defeito foi preenchida pela matriz de tecido conjuntivo frouxo, que apresentou menor espessura na região central do defeito aos 15 dias, evoluiu para o espessamento contínuo aos 30 dias, porém, aos 60 dias, sofreu redução ( Figura 3C ). Em todos os pontos biológicos, notou-se a presença de fibras colágenas, que, aos 30 dias, apresentaram-se em paralelo ( Figura 3B ), e proliferação difusa de capilares. Aos 15 dias o edema apresentava-se moderado, e havia presença de infiltrado inflamatório mononuclear difuso, que se reduziu aos 30 dias e tornou-se inconspícuo aos 60 dias.

Fig. 3

Grupo ultrassom terapêutico 5 - Fotomicrografia do defeito ósseo crítico com presença de neoformação de matriz osteoide (*). ( A ) Aos 15 dias, presença de osteoblastos ativos e diversos espaços capilares (hematoxilina e eosina – H&E). ( B ) Alinhamento das fibras colágenas aos 30 dias (PIFG). ( C ) Redução do espessamento do tecido conjuntivo frouxo aos 60 dias (H&E). Fonte: Elaboração da autora.

Grupo ultrassom terapêutico 10

Aos 15 dias, a neoformação da matriz osteoide apresentava-se restrita à borda óssea ( Figura 4A ) e evoluiu, a partir dos 30 dias ( Figura 4B ), para a formação em direção centrípeta ( Figura 4C ), com ausência do restabelecimento do volume ósseo original. Os osteoblastos permaneceram presentes e ativos em todos os pontos biológicos, e o preenchimento da área do defeito ocorreu com tecido conjuntivo frouxo que apresentou aumento da espessura em toda a extensão. Em todos os pontos biológicos, as fibras colágenas estavam organizadas em paralelo ( Figura 4B ), houve proliferação de vasos sanguíneos, com estabilização da angiogênese aos 60 dias. O edema e o infiltrado inflamatório mononuclear apresentaram-se reduzidos e tornaram-se ausentes aos 60 dias.

Fig. 4

Grupo ultrassom terapêutico 10 - Fotomicrografia da região do defeito ósseo crítico com presença de neoformação de matriz osteoide (*). ( A ) Presença de osteoblastos ativos e diversos espaços capilares aos 15 dias (hematoxilina e eosina – H&E). ( B ) Organização das fibras colágenas em paralelo aos 30 dias (PIFG). ( C ) Neoformação de matriz osteoide em direção centrípeta aos 60 dias (H&E). Fonte: Elaboração da autora.

Grupo controle

A neoformação de matriz osteoide reacional apresentou-se restrita à borda óssea em todos os pontos biológicos ( Figuras 5 A , B e C ), e o volume ósseo original não foi reestabelecido. Apenas aos 15 dias, houve presença de osteoblastos ativos. O preenchimento do defeito, em todos os pontos biológicos, ocorreu com tecido conjuntivo frouxo, que se apresentou delgado aos 15 dias e ainda mais delgado aos 60 dias ( Figura 5C ), com espessura menor que a borda óssea. Constataram-se poucos capilares e, aos 30 e 60 dias, estabilização da angiogênese, discreto edema e infiltrado inflamatório mononuclear difuso que se tornaram ausentes posteriormente.

Fig. 5

Grupo controle - Fotomicrografia da região do defeito ósseo crítico com presença de neoformação de matriz osteoide (*). ( A ) Osteoblastos ativos e poucos espaços capilares aos 15 dias (hematoxilina e eosina - H&E). ( B ) Preenchimento do defeito com delgado tecido conjuntivo frouxo aos 30 dias (PIFG). ( C ) Neoformação de matriz osteoide restrita às bordas ósseas aos 60 dias (H&E). Fonte: Elaboração da autora.

Discussão

A ausência da padronização de protocolos de ultrassom terapêutico com a finalidade de auxiliar a regeneração tecidual pode comprometer o resultado terapêutico desejado. Desse modo, é necessário que sejam eleitos com cautela e que se unifiquem os parâmetros a serem utilizados na reabilitação. 8 Dentre os diversos parâmetros está a variável tempo, pouco estudada nos artigos científicos disponíveis, impondo-se, portanto, a necessidade de definir o tempo de tratamento a ser empregado em cada lesão. 8 Sendo assim, o presente experimento buscou comparar o efeito de dois protocolos de diferentes tempos de tratamento do ultrassom terapêutico na regeneração de defeito ósseo crítico.

A realização da terapia com ondas ultrassônicas na fase inicial incrementou o reparo tecidual, pois o efeito do ultrassom está relacionado, principalmente, com o intervalo de tempo entre o início da lesão e o início do tratamento, de modo que, quanto mais precocemente se iniciar a terapia, mais rápida será a recuperação tecidual. 2 19 20 21

No presente estudo, os resultados obtidos na fase inicial do reparo mostraram que os tempos de 5 e 10 minutos não foram suficientes para estimular o aumento da neoformação no defeito ósseo crítico. 10 A evolução apresentada nos demais pontos biológicos do GUS 5 pode ter sido motivada pelo prolongamento do estímulo no tecido ósseo, que é capaz de promover regiões de remodelação, 10 sendo considerado um tempo suficiente para promover a consolidação óssea. 18 Entretanto, alguns autores 11 22 23 afirmam que o tempo ideal para promover o estímulo osteogênico e a organização tecidual é a partir de 10 minutos, o que sugere que o ultrassom possui efeito dose-dependente quanto ao tempo de estimulação.

O incremento constatado nos pontos biológicos tardios do GUS 10 pode ter ocorrido em consequência do prolongamento do estímulo na via de mecanotransdução, que potencializa o estímulo osteogênico e gera aumento da taxa de neoformação óssea. 24 Entretanto, no GC houve manutenção da limitação da neoformação 24 em razão da ausência de estímulo adicional.

O padrão celular encontrado nos grupos experimentais em que se realizou a terapia com ultrassom demonstrou que as ondas ultrassônicas são capazes de induzir e fomentar a ativação e a diferenciação de células mesenquimais e osteoprogenitoras. 19 24 Apesar de não estar elucidado esse mecanismo de indução à osteogênese por meio desse recurso terapêutico, 24 sabe-se que o ultrassom estimula as células mesenquimais a se diferenciar em osteoblastos, que, por sua vez, têm sua atividade celular estimulada. Além disso, o ultrassom acelera a diferenciação dos osteoblastos e promove aumento da mineralização óssea. 25 26

O tecido de reparo que preencheu o defeito no GUS 5 e no GUS 10 foi estimulado pelas ondas ultrassônicas que, além de fomentar a síntese de células mesenquimais, estimulam colágeno e fibroblastos, principalmente quando utilizadas na fase inicial do reparo, 10 19 20 24 como se procedeu neste experimento. A partir de 2 minutos de emissão das ondas ultrassônicas, ocorre o estímulo ao crescimento de fibroblastos 27 e o alinhamento das fibras de colágeno acontece a partir de 3 minutos. 8

Neste estudo, o ultrassom mostrou-se promissor no estímulo à angiogênese tanto aos 5 quanto aos 10 minutos de terapia, quando ocorre a vascularização a partir da fase inicial do reparo 10 e torna-se evidente na fase tardia, o que favorece o processo de reparo ósseo. 25

Há duas hipóteses para justificar a angiogênese promovida pelo ultrassom: o estímulo ao aumento da secreção de interleucina-8 (IL-8) e a produção do fator de crescimento endotelial vascular (FCEV). Supõe-se que as ondas ultrassônicas regulam a secreção da IL-8 pelos osteoblastos, por ser uma citocina responsável por induzir a proliferação e a migração de células endoteliais, o que leva à angiogênese. A segunda hipótese sugere que o ultrassom estimula a produção de FCEV também pelos osteoblastos, um fator fundamental para a angiogênese, que atua na regulação da mitose e no recrutamento das células endoteliais. 28

As ondas ultrassônicas promoveram a redução do tempo do processo inflamatório após os tempos de 5 e 10 minutos de terapia, por favorecer a aceleração da fase inflamatória, decorrente do aumento e da liberação de células mononucleares, assim como da liberação de histaminas, que fomenta uma rápida resolução do processo inflamatório. 20 29 Devido a esse mecanismo, o ultrassom é capaz de eliminar o processo inflamatório a partir da fase inicial do reparo. 23

O ultrassom terapêutico, apesar de apresentar efeito osteogênico e possibilitar seu uso em situações em que o reparo é crítico, não mostrou eficácia quanto ao restabelecimento do volume e da morfologia do tecido ósseo original em ambos os protocolos. Dessa forma, a fim de potencializar os efeitos das ondas ultrassônicas, sugere-se uma possível associação desse recurso terapêutico a um arcabouço tridimensional, que servirá de maior suporte estrutural e mecânico, potencializará o crescimento celular e induzirá a diferenciação celular. 16 30

Conclusão

O ultrassom terapêutico estimulou o reparo do defeito ósseo crítico, e o tempo mais longo de exposição promoveu maior estímulo osteogênico.