Effects of ICI 182,780, an ERα and ERβ antagonist, and G-1, a GPER agonist, on autophagy in breast cancer cells.

OBJECTIVE: To investigate if ICI 182,780 (fulvestrant), a selective estrogen receptor alpha/beta (ERα/ERβ) antagonist, and G-1, a selective G-protein-coupled receptor (GPER) agonist, can potentially induce autophagy in breast cancer cell lines MCF-7 and SKBr3, and how G-1 affects cell viability.
METHODS: Cell viability in MCF-7 and SKBr3 cells was assessed by the MTT assay. To investigate the autophagy flux, MCF-7 cells were transfected with GFP-LC3, a marker of autophagosomes, and analyzed by real-time fluorescence microscopy. MCF-7 and SKBr3 cells were incubated with acridine orange for staining of acidic vesicular organelles and analyzed by flow cytometry as an indicator of autophagy.
RESULTS: Regarding cell viability in MCF-7 cells, ICI 182,780 and rapamycin, after 48 hours, led to decreased cell proliferation whereas G-1 did not change viability over the same period. The data showed that neither ICI 182,780 nor G-1 led to increased GFP-LC3 puncta in MCF-7 cells over the 4-hour observation period. The cytometry assay showed that ICI 182,780 led to a higher number of acidic vesicular organelles in MCF-7 cells. G-1, in turn, did not have this effect in any of the cell lines. In contrast, ICI 182,780 and G-1 did not decrease cell viability of SKBr3 cells or induce formation of acidic vesicular organelles, which corresponds to the final step of the autophagy process in this cell line.
CONCLUSION: The effect of ICI 182,780 on increasing acidic vesicular organelles in estrogen receptor-positive breast cancer cells appears to be associated with its inhibitory effect on estrogen receptors, and GPER does notseem to be involved. Understanding these mechanisms may guide further investigations of these receptors' involvement in cellular processes of breast cancer resistance.

INTRODUCTION

Breast cancer is one major cause of death among women, in Brazil and other countries. [1] Treatment can be curative in some cases, and one of the most commonly used protocol involves surgical excision, followed by chemotherapy/radiation therapy. In case of hormone-sensitive breast cancer, [2] hormone therapy consists of inhibiting estrogen synthesis or interfering in signaling mediated by this steroid. [3] In these cases, the standard treatment uses tamoxifen, a selective estrogen receptor (ER) modulator, as well as ICI 182,780 (fulvestrant − herein referred to as ICI) and aromatase inhibitors, [4] to reduce estrogen stimulation and the related protein synthesis and cell proliferation.

The first ERs described were alpha (ERα) and beta (ERβ), the primary mechanism of which is their action as transcription factors. Later, a G-protein-coupled ER (GPER) was described, with seven G-protein-coupled transmembrane domains, the expression pattern of which can reveal the aggressiveness of the tumor when associated with ER expression. [5] Even though ICI is an antagonist of classic receptors (ERα and ERβ), it is a GPER agonist, [5] and the related signaling pathways are still not fully understood. Evidence points to ERα expression as a potential modulator of cancer cell response to different therapies, by means of autophagy. [6 , 7] Macroautophagy, herein referred to as “autophagy”, is a lysosomal pathway for recycling of macromolecules and cell organelles sequestered into autophagosomes, bounded by a double membrane. They merge with lysosomes to form autolysosomes, within which degradation takes place. [8]

Studies showed that activating autophagy in normal cells can prevent tumor formation, and inhibiting autophagy could be beneficial in established tumors. On the other hand, cytotoxic drugs used in cancer treatment are known to induce autophagy and could trigger cell death in apoptosis-deficient cells. [9] Since autophagy has a double role in tumorigenesis and tumor progression, understanding these mechanisms could favor the discovery of potential treatment targets in breast cancer.

OBJECTIVE

To assess if ICI 182,780 (fulvestrant), a selective antagonist of estrogen receptors alpha and beta (ERα/ERβ), and G-1, a selective G-protein-coupled estrogen receptor (GPER) agonist, can potentially induce autophagy in breast cancer cell lines MCF-7 and SKBr3, and if G-1 can affect cell viability.

METHODS

This study was approved by the Ethics Committee of the Universidade Federal de São Paulo under opinion number 1748/10.

Reagents

DMEM/F12, fetal bovine serum (FBS), penicillin/streptomycin and trypsin/ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 0.5% were obtained from Invitrogen™ of Brazil (St. Louis, MO, USA). ICI 182,780 (AstraZeneca of Brazil; Cotia, São Paulo, Brazil), 1-[4-(6-bromobenzo[1,3] dioxol-5yl)-3a,4,5,9b-tetrahydro-3H-cyclopenta[c]quinolin-8-yl]-ethanone (G-1; Calbiochem ® ; Merck Biosciences, Darmstadt, Germany), 17β-estradiol 3-benzoate (17β-estradiol, E2) (Sigma Chemical Co.; St Louis, MO, USA) and 4,4’,4’’-(4-propyl-(1H)-pyrazole-1,3,5-triyl) trisphenol (PPT). Rapamycin (RAP) and 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) were obtained from Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA). Acridine orange (AO) was obtained from Molecular Probes (Eugene, OR, USA). The GFP-LC3 plasmid was obtained from the National Institute for Infectious Diseases, USA, and Istituto di Ricovero e Cura a Carattere Scientifico L. Spallanzani , Rome, Italy.

Cell culture

ERα, ERβ and GPER-expressing MCF-7 breast cancer cell lines were used to investigate the effect of ICI 182,780 and of G-1 on cells that express these three receptors. The SKBr3 cell line, which expresses GPER but not ERα, was used to investigate whether ICI and G-1’s effect on the formation of acidic compartments was present only in cells expressing ERα. [5] These cells were kept at 37 o C and 5% carbon dioxide in serum-free phenol red DMEM/F12, supplemented with 10% FBS, 100U/mL penicillin and 100µg/mL streptomycin. They were also plated into serum free phenol red DMEM/F-12 for 24 hours.

Treatments to verify cell viability and autophagy

The concentrations used in the experiments were based on the literature. Estrogen receptor can respond to concentrations in the picomolar and nanomolar ranges. Thus, for the components that act on these receptors, we used nanomolar concentrations to shorten the treatment duration required for effects to be observed, since induction of autophagy usually occurs before any reduction in viability can be detected. The antiproliferative effects of ICI 182,780 can be observed at concentrations as low as 1nM and are treatment-duration- and concentration-dependent. [4 , 10] Studies show that G-1 at 100nM leads to GPER activation through rapid pathways and signaling pathways that trigger gene transcription, although lower concentrations have been reported. [11] In these experiments, cells were also treated with RAP as positive control for autophagy induction, due to its mTOR inhibition. Concentrations in the literature range between 20nM and 10µM, for 24-hour treatments in breast cancer cell lines. [12 , 13] For this study, we used 1µM RAP, which has been shown to induce LC3-II formation on the membrane of autophagosomes.

Since ICI is an ER antagonist, as counterproof to rule out the activation of ERs, we used E2, an ER and GPER agonist, and PPT, a selective ERα agonist. The E2 concentrations to activate ERs are in the picomolar and nanomolar ranges, such as 0.1nM to 10nM. [4] In the literature, PPT concentrations range from 5 to 200nM and, therefore, we chose to use intermediate concentrations, such as 10nM and 100nM. [14]

Western blot for assessment of estrogen-receptor alpha and G-protein-coupled receptor (GPER) expression

Cells were plated into six-well plates and kept in medium until the day of the experiment. We performed the total protein extraction protocol with lysis buffer containing 10mM Tris, pH 7.4, 10mM NaCl, 3mM MgCl 2 , 0.5% Nonidet P40, protease inhibitor cocktail, 1mM PMSF, 2mM Na 3 VO 4 , 50mM NaF, 10mM Na 2 P 2 O 7 (Sigma Chemical Co.). Next, extracts were centrifuged (13.200rpm for 5 minutes at 4°C), and the supernatant was collected. Approximately 50μg of proteins were separated by polyacrylamide gel electrophoresis and transferred onto a polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane. Blocking of nonspecific sites was performed by incubation with non-fat skim milk (5%) in TBS-Tween (1%) buffer for 1 hour, at room temperature. Membranes were incubated overnight at 4°C with primary antibodies (diluted with 2% skim milk in TBS-Tween buffer) for ERα (sc 8002, Santa Cruz Biotechnology) and GPER (ab39742, Abcam). A specific, horseradish peroxidase (HRP) labelled antibody was used. The product of the reaction was developed with ECL (PerkinElmer), and images were captured with a UVITEC digital photo documenter (Cambridge). Next, membranes were subjected to a stripping protocol and incubated with anti-alpha tubulin (1:10,000, Sigma-Aldrich Biotechnology), for internal control labelling.

Cell viability assessment using the MTT assay

The MTT assay is based on the activity of mitochondrial enzymes from viable cells, leading to conversion of yellow MTT tetrazolium salt into a dark blue formazan product. [15] The MCF-7 were plated in triplicate in 96-well plates, at a density of 10 [4] cells/well. After 24 hours, the FBS was removed and cells were kept in DMEM/F12 for 24 hours, then treated with ICI, G-1 and RAP for 24 hours, 48 hours and 72 hours, and compared with a no-treatment control (CTR) group kept only in DMEM/F12. For reading, we added 50µg/mL MTT (diluted with phosphate-buffered saline − PBS) to each well, and proceeded with incubation at 37°C, for 3 hours. The medium was removed and 100% alcohol was added to each well. The reading was performed on a plate spectrophotometer at a wavelength of 595nm.

Transfection of MCF-7 cells for GFP-LC3 expression

During elongation of the autophagic vesicle, LC3 (light chain 3) is recruited. The LC3 protein, homogeneously spread throughout the cytosol as LC3-I, is specifically recruited to the membrane of autophagosome vesicles, changing into LC3-II. When LC3 fuses with the green fluorescent protein (GFP), induction of autophagy can be observed as LC3 accumulates in autophagosomes, and green puncta GFP can be seen on fluorescence microscopy. [16]

Cells were plated into 35mm plates with a 25mm cover slip treated with polyornithine (0.01mg/mL). After adhesion, cells were transfected with 0.5µg pCLPCX-GFP-LC3 plasmid, which contains the gene encoding for the LC3 protein, conjugated with the gene encoding for GFP. For transfection, we used 0.5µg of the plasmid mixed with 3μL FuGENE ® HD (Fugent, LLC., USA) in 100μL DMEM/F12. Cells were incubated with the reagent mix in 1.5mL DMEM/F12 supplemented with 10% FBS, 100U/mL penicillin and 100µg/mL streptomycin, kept at 37°C and 5% carbon dioxide. On the following day, cells were carefully washed with FBS and incubated with non-supplemented DMEM/F12 for another 24 hours, adding up to a total of 48 hours for protein expression.

Fluorescence microscopy to assess autophagy resulting from GFP-LC3 expression

Transfected cells were analyzed on a Nikon TE300 (Nikon Osaka, Japan) fluorescence microscope equipped with a CoolSNAP™ high-resolution digital camera (Roper Sci, Princeton Instruments, USA), and a cooling system to reduce noise and improve image resolution. Images were obtained every 30 minutes, with a maximum duration of 4 hours for each experiment. Forty-times magnification was used to perform the experiments. Excitation took place at a wavelength of 488nm and emission at 505nm.

Since autophagy is a basal process, the increase in GFP-LC3 puncta is due to the presence of an autophagy-inducing stimulus. To quantify the puncta, we established a cutoff point derived from the control sample (non-treated cells, kept in DMEM/F12). For each control cell, we calculated the difference between the baseline and peak number of puncta, irrespective of time, with a maximum observation duration of 4 hours.

Detection of acidic compartments by flow cytometry

Cells were stained with AO for estimation of the number of acidic vesicular organelles by flow cytometry, as a marker of the final steps of the autophagy process, [17] since AO, in its protonated form, accumulates inside acidic vesicles.

The cells were plated in six-well plates and kept in FBS-free DMEM/F12. In the experiments, cells were treated with ICI, G-1, RAP, E2 and PPT, for 24 or 48 hours, compared with the control (CTR) group. Next, they were trypsinizated with addition of 1mL PBS, transferred into tubes, and centrifuged at 1,300rpm for 8 minutes. The supernatant was discarded, and cells were resuspended in 400µL AO diluted with PBS (100ng/mL). Cells were incubated for 15 minutes at room temperature and protected from light. Measures were obtained by flow cytometry (FACSCalibur, BD, Biosciences). The wavelength for excitation was 488 nm, fluorescence was detected at 510 to 530nm (green fluorescence, FL1) and 650nm (red fluorescence, FL3). The data were generated by the CellQuest™ software program and analysed on WinMDI 2.9.

Statistical analysis

The results obtained were subjected to statistical analysis by one-way analysis of variance (ANOVA), followed by Turkey or Bonferroni’s post-hoc test, and Student’s t test. The data were expressed in histograms as mean±standard error of the mean. Analyses were conducted in the GraphPad Prism software program, version 4.0.

RESULTS

Expression of estrogen receptors in MCF-7 and SKBr3 cell lines

Initially we conducted a Western blot assay to identify any receptors differentially expressed in the two different breast cancer cell lines. As shown in figure 1A , ERα was highly expressed on MCF-7 cells, but not significantly on SKBr3 cells. The GPER receptor, in turn, was expressed in similar quantities in both cell lines.

Figure 1

Expression of estrogen receptors in MCF-7 and SKBr3 cell lines and cell viability by MTT in MCF-7 cells. In A, expression of estrogen receptors alpha and G-protein-coupled receptors (GPER) in MCF-7 and SKBr3 cells. Representative autoradiograms show that estrogen receptor alpha is differentially expressed in the two cell lines, whereas the G-protein-coupled receptor (GPER) is expressed at similar levels. In B, C and D, cell viability by MTT in MCF-7 cells treated with ICI (B), G-1 (C) and rapamycin (D) for 24, 48 and 72 hours in FBS-free DMEM/F12. The data represent the mean±standard error of the mean of four independent experiments (24 hours and 48 hours) and three experiments in triplicate (72 hours). One-way analysis of variance (ICI and G-1) with multiple comparisons by Tukey’s test. Unpaired t test (rapamycin versus CTR). P<0.05 represents a significant difference versus the Control Group (no treatment). ICI and rapamycin reduced cell viability in MCF-7 after 48 and 72 hours. G-1 did not affect cell viability after 24, 48 or 72 hours

ERα: estrogen receptor alpha; CTR: Control Group (no treatment); RAP: rapamycin; ICI: fulvestrant.

Cell viability assay of MCF-7 and SKBr3 cells

A viability assay was performed to test the effect of ICI, G-1 and RAP (as an autophagy inducer by mTOR inhibition) on the growth of MCF-7 ( Figure 1B to 1D ) and SKBr3 ( Figure 2A to 2C ) cells. The decrease in the number of cells could be due to inhibition of proliferation, or cell death. [15] To proceed with the autophagy assessment, we first checked how long it took for cell viability to decrease after treatment with ICI, G-1 and RAP in MCF-7 cells. Twenty-four-hour treatments with ICI (25, 50, 100 and 200nM) produced no changes in cell viability. However, when used for 48 and 72 hours, ICI led to decreased viability (p<0.05). When comparing the response to ICI at different concentrations, there was no difference in reduction of cell viability, however at 100nM, the variability between samples was smaller ( Figure 1B ). There was no difference between the 48- and the 72-hour treatment (p>0.05). In treatments with GPER agonist G-1 at 1nM, 10nM and 100nM, for 24, 48 and 72 hours ( Figure 1C ), there was no decrease in the number of cells (p>0.05). To use RAP as positive control in autophagy assays, we tested its effect on viability to determine the best treatment duration preceding observable decreased cell viability. In the 24-hour treatment with RAP (1µM), no changes were observed (p>0.05); however, treatments for 48 and 72 hours (p<0.05 versus control) led to decreased viability ( Figure 1D ). There was no difference between the 48- and 72-hour treatment durations (p>0.05).

Figure 2

Effects of ICI, G-1 and rapamycin in SKBr3 cells. Cell viability by MTT in SKBr3 cells treated with ICI (A), G-1 (B) and rapamycin (C) for 24, 48 and 72 hours in FBS-free DMEM/F12. The data represent the mean of an experiment in triplicate. p<0.05* represents a statistical difference from control, considering the standard deviation of the sample. None of the compounds (ICI, G-1 and RAP) was capable of reducing cell viability in SKBr3 cells. In D and E, staining of SKBr3 cells with acridine orange after treatment with ICI (100nM), G-1 (100nM) and rapamycin (1µM) for 24 hours shows that ICI and G-1 did not induce formation of acidic compartments in SKBr3, a cell line that does not express estrogen receptor alpha. In D, fluorescence detection charts for green and red fluorescence. In E, histograms show mean values (±standard error of the mean) in percentage of cells stained with acridine orange. One-way analysis of variance, followed by Bonferroni’s test (n=4). Control Group (no treatment). In E, *p<0.05 represents a statistical difference of rapamycin versus Control Group (no treatment) and G-1

CTR: Control Group (no treatment); RAP: rapamycin; ICI: fulvestrant; AO: acridine orange.

When assessing cell viability of SKBr3 cells ( Figure 2A ), differently from MCF-7 cells, ICI showed a time- and concentration-dependent increase in viability compared with the Control Group. We observed increased cell viability at 50nM (48 hours), 100nM (24, 48 and 72 hours) and 200nM (24 and 48 hours). Treatment with G-1 in SKBr3 cells also increased cell viability at certain concentrations and treatment durations (at 1nM for 24 hours, and at 10nM and 100nM for 72 hours; Figure 2B ). RAP did not affect cell viability in SKBr3 cells, irrespective of duration ( Figure 2C ). To investigate the absence of autophagy, SKBr3 cells, which do not express ERα, were treated with ICI (100nM), G-1 (100nM) and RAP (1μM) for 24 hours ( Figures 2D and 2E ). Cells were stained with AO and analyzed by flow cytometry. The data showed that ICI and G-1 did not increase the number of acidic vesicular organelles when compared with CTR (p>0.05) and RAP (p<0.05), suggesting that, since there was no decrease in viability, the absence of autophagy could explain this result.

Effect of treatment with ICI 182,780 and G-1 on autophagy induction based on GFP-LC3 puncta and formation of acidic vesicular organelles in MCF-7 cells

During formation of autophagosomes, LC3 is specifically translocated onto the autophagosome membrane. [16]

GFP-LC3-expressing MCF-7 cells were visualized for 4 hours after treatment with ICI (100nM) and G-1 (100nM) ( Figure 3 ). Rapamycin (1μM) was used as positive control. Results show that treatment with ICI and G-1 did not induce GFP-LC3 translocation indicating increased autophagy when compared with CTR. Rapamycin contrarily, induced formation of autophagosomes, shown by GFP-LC3 translocation and increased puncta ( Figure 3A ).

Figure 3

Autophagy induced by rapamycin based on GFP-LC3 puncta in MCF-7 cells. ICI and G-1 did not induce autophagy within the time observed (4 hours). In A, images obtained by fluorescence microscopy of GFP-LC3-expressing MCF-7 cells stimulated with rapamycin (1µM), ICI (100nM) and G-1 (100nM). Cells were kept in DMEM/F12 (CTR) and visualized every 30 minutes, over the course of 4 hours (40X magnification). In B, the histogram represents the quantification of cells with increased GFP-LC3 puncta, within 4 hours in MCF-7 cells. The mean±standard error of the mean was calculated from five independent control experiments. The upper limit was obtained (mean + two times the standard error of the mean) and established as cutoff which, in this case, was equal to an increase of nine puncta per cell. For each experiment, we calculated the percentage of cells with an increase greater than this limit. One-way analysis of variance, followed by Bonferroni’s test. Mean values obtained from at least three independent experiments. The ICI, G-1 and rapamycin groups were compared with the Control Group

* p<0.05 represents a significant difference.

CTR: Control Group (no treatment); RAP: rapamycin; ICI: fulvestrant.

As previously described, [9] seeing that autophagy is a process that can take place as a survival mechanism in the presence of a stressor, we investigated whether these effects took place before any potential reduction in viability. Since results showed there was no decrease in proliferation within 24 hours, but rather within 48 hours, we used these treatment durations to investigate the effects of ICI and G-1 on formation of acidic compartments by AO staining and detection by flow cytometry ( Figure 4 ). Results showed that treatment with ICI (100nM) increased the number of acidic compartments, for both 24 and 48 hours of treatment, similarly to RAP (1μM). Both treatments were significantly different (p<0.05) from CTR and there was no difference between ICI and RAP (p>0.05), nor between 24 and 48 hours of treatment ( Figure 4 ). On the other hand, no changes were observed in the number of acidic compartments (p>0.05) in cells treated with G-1 ( Figure 4 ).

Figure 4

Effect of ICI, G-1 and rapamycin on formation of acidic vesicular organelles in MCF-7 cells. ICI and rapamycin induce formation of acidic compartments within 24 and 48 hours in MCF-7 cells, whereas G-1 did not affect this process. Histograms show the mean value±standard error of mean, in percentage of cells stained with acridine orange and analyzed by flow cytometry. MCF-7 cells were treated with ICI (100nM), G-1 (100nM) and rapamycin (1µM) for 24 hours (A and C) and 48 hours (B and D). One-way analysis of variance, followed by Bonferroni’s test. In A, n=6; in B, n=5

*p<0.05 represents a significant difference of ICI versus (Control Group, no treatment, and G-1) rapamycin (control group, no treatment, and G-1).

CTR: Control Group (no treatment); RAP: rapamycin; ICI: fulvestrant; AO: acridine orange.

Effect of 17β-estradiol and PPT on formation of acidic compartments in MCF-7 cells as an indicator of autophagy

Since the decrease in cell viability and the increase in acidic compartments in MCF-7 cells occurred after treatment with ICI but not with G-1, these effects could be associated with ER antagonism, without involving GPER activation. To investigate how ER antagonists affect autophagy, MCF-7 cells were treated for 24 hours with E2 (0.1nM, 1nM and 10nM) and compared with ICI (100nM). Results show that the different E2 concentrations were not capable of increasing the number of acidic compartments in cells (p>0.05 compared with CTR; Figures 5A and 5C ). Since E2 acts differently on different ERs, MCF-7 cells were treated for 24 hours with PPT (10nM and 100nM), a specific ERα agonist that also failed to increase the number of acidic compartments (p>0.05 compared with control) ( Figures 5B and 5D ).

Figure 5

Detection of acidic vesicular organelles by flow cytometry in MCF-7 cells stained with acridine orange after treatment with compounds for 24 hours. The activation of estrogen receptors with 17β-estradiol, as well as the selective activation of estrogen receptor alpha with PPT, does not induce acidic compartment formation in MCF-7 cells. In A and C, MCF-7 cells treated with 17β-estradiol at 0.1nM, 1nM and 10nM. In B and D, MCF-7 cells treated with PPT at 10nM and 100nM. In MCF-7 cells, the effects were compared with those of ICI (100nM). In A and B, fluorescence detection charts for green and red fluorescence. In C and D, histograms show mean values±standard error of the mean, in percentage of cells stained with acridine orange. One-way analysis of variance, followed by Bonferroni’s test (n=4). In C and D, *p<0.05 means a statistical difference in comparison with the other groups

* p<0.05 means a statistical difference in comparison with the other groups.

CTR: Control Group (no treatment); E2: 17β-estradiol; ICI: fulvestrant; AO: acridine orange.

DISCUSSION

Autophagy is a cell mechanism that can potentially eliminate intracellular components following an insult or build-up of defective proteins or organelles. [9] Abnormal autophagy may occur in cancer cells and after chemotherapy. In breast cancer, evidence shows that proteins involved in autophagy, such as beclin-1, regulate cell growth and interfere in estrogen signaling. [18]

Studies with ER antagonists, such as ICI and tamoxifen, in breast cancer cells show increased autophagy [10 , 18 - 22] which can lead to breast cancer resistance and proliferation. ICI is knowingly an ERα and ERβ antagonist, however, there are reports that in models in which ICI has no effect or agonist effect, its action supposedly results from GPER activation [5] Therefore, in this study, we initially compared the cytotoxic/antiproliferative actions of ICI with G-1, a selective GPER agonist. We verified a potential antiproliferative action of ICI in ER-expressing MCF-7 cells, with 48- and 72-hour treatments, considering that there was no death of these cells under these experimental conditions in parallel trials performed (data not shown). We know that ICI leads to decreased ERα activity [23] and its antiproliferative effect is associated with blocking of classic ERs, leading ER-positive cells to cell death by apoptosis. [24]

As for the role of GPER in cell proliferation, despite our results showing that selective GPER activation by G-1 did not affect the parameters assessed, previous studies have shown the antiproliferative and apoptotic effects of G-1 on MCF-7, at concentrations equal to or higher than 1µM for at least 72 hours of treatment. [25 , 26] On the other hand, it has been shown that the GPER pathway may be involved in the aggressive behavior of breast tumors by regulation of expression of the aromatase enzyme, after GPER inhibition in tamoxifen-resistant MCF-7 cells. [27] Thus, GPER could be a potential target for breast cancer management, and its role in breast tumor growth and tumor resistance after antiestrogen therapy must be further investigated.

To investigate the role of ER and GPER in autophagy, we studied the effect of ICI and G-1 on GFP-LC3 translocation, which corresponds to an estimate of the autophagy process. Despite ICI not leading to GFP-LC3 translocation in this study, this may be due to the short exposure time of 4 hours, whereas more time would be required to induce autophagy. [10 , 28] Also, the autophagic pathways induced may not involve LC3 translocation. [7] Selective GPER activation with G-1, in turn, did not lead to autophagy by LC3 translocation. The effects of G-1 on autophagy are still unclear and under the experimental conditions used herein, no significant changes were observed. As for the role of GPER in autophagy, it was reported that G-15, a GPER antagonist, can induce ER-independent autophagy in human head and neck cancer cell lines, irrespective of GPER expression levels. [29] The role of GPER in cancer proliferation has been greatly explored, however no inter-relation between this pathway and autophagy, an important phenomenon related with cell survival, has been identified.

Experiments with ICI in MCF-7 cells have shown increased staining with AO, indicative of an increased number of acidic compartments. This effect was not seen in the SKBr3 cell line, which does not express ERα. Studies have shown [10 , 28] that ICI can induce autophagy in MCF-7 cells by other methods, corroborating our findings. In addition to investigating LC3 translocation, these studies also addressed the decrease in p62, another indicator of induced autophagy. This protein is required for formation of ubiquitinated protein aggregates, targeted at and incorporated into autophagosomes and, ultimately, degraded in autolysosomes. [16] ICI is known to reduce ERα activity by inducing degradation of this receptor by the ubiquitin-proteasome system. [23] The relation between the ubiquitin-proteasome system and autophagy in molecule uptake and degradation processes must be further investigated. [30] Also, evidence points to an interaction between ERα and beclin 1, one of the primary proteins involved in formation of autophagosomes, [18] which indicates that ICI-induced autophagy is mainly related with ICI’s effect as an ERα antagonist.

MTT results show that the viability of SKBr3 cells was not affected after treatment with RAP 1µM for 24, 48 and 72 hours. According to clinical trials, RAP appears to have a cytostatic effect, since the reduction in breast cancer proliferation is modest, however when combined with other chemotherapeutic agents, their synergistic effect is more effective. [31] Nevertheless, RAP induces formation of acidic vesicles, possibly by inducing autophagy, without, however, decreasing cell viability. Notwithstanding, in this study, RAP was used as positive control to assess the increase in acidic vesicular organelles, compared with ICI and G-1.

When comparing ICI and G-1 in SKBr3 cells, some of the treatments, depending on the respective duration and concentration, increased viability of these cells without any reduction in cell viability. GPER induction appeared to be a survival response in ER-negative cells. In parallel, there was no increased formation of acidic vesicles such as lysosomes, which correspond to the latest steps of macromolecular component degradation, and take place in the presence of cell stressors. Some studies [11 , 32] have reported pro-proliferative effects of G-1 and ICI in SKBr3 cells, showing that the absence of ERs, particularly ERα, and the presence of GPER can determine proliferative effects in estrogen-receptor-negative breast cancer cells, which explains why treatment with antiestrogens, such as tamoxifen and ICI, is not effective in this type of breast cancer.

Since the link between autophagy and cancer was established, many studies have attempted to understand the role of autophagy and how it relates with cancer and treatment response, investigating the connection between the autophagic pathway and cell proliferation and/or death. In breast cancer, studies identified that ER antagonists, such as ICI and tamoxifen, can promote autophagy in breast cancer cells. [10 , 18 - 22] Recent evidence shows that inhibiting autophagy can induce cell death, since autophagy is a survival mechanism, [22 , 33 , 34] and, in estrogen-receptor-positive breast cancer cells, ICI-induced autophagy seems to contribute to cancer resistance. [10] Since ICI also acts by activating GPER, the possibility of the GPER pathway being involved in survival by autophagy must also be investigated. Thus, it is important to assess the role of this receptor in the survival mechanisms of breast cancer, since it could potentially become a relevant target for cancer treatment.

CONCLUSION

A relevant issue in breast cancer therapy is the resistance developed after therapy with antiestrogens such as ICI. One of its targets, the G-protein-coupled estrogen receptor, supposedly has a major role in the proliferation/viability of cancer cells, and its effect seems to vary based on surrounding conditions. The activation of autophagy is currently widely investigated as a cell protection mechanism. The effect of ICI in increasing acidic compartments in ER-positive cells seems to be greatly associated with its ability to inhibit estrogen receptors, whereas the G-protein-coupled estrogen receptor does not seem to be involved. These data may be important to explain cell death and resistance mechanisms, aiming to develop new treatment alternatives.

INTRODUÇÃO

O câncer de mama é uma das principais causas de morte em mulheres, tanto no Brasil quanto em outros países.[1] Em alguns casos, o tratamento pode levar à cura, e um dos protocolos mais adotados envolve a excisão cirúrgica, seguida de quimioterapia/radioterapia. Nos casos de câncer de mama responsivos a hormônios,[2] a terapia endócrina consiste em inibir a síntese do estrógeno ou interferir na sinalização mediada por este esteroide.[3] Nestes casos, para o tratamento padrão, é utilizado o tamoxifeno, um modulador seletivo de receptores de estrógeno (RE), além do tratamento com ICI 182,780 (fulvestranto − referido neste artigo como ICI) e os inibidores de aromatase,[4] para diminuir a estimulação estrogênica, que pode promover a síntese proteica e a proliferação celular.

Os RE primeiramente descritos foram o alfa (REα) e o beta (REβ), cujo principal mecanismo é sua ação como fator de transcrição. Posteriormente, foi descrito um RE com sete domínios transmembranosos acoplados à proteína G (GPER), cujo padrão de expressão pode indicar a agressividade do tumor quando associada à expressão de RE.[5] Apesar da ação antagonista de ICI ser sobre os receptores clássicos (REα e REβ), sua ação sobre o GPER é agonista,[5] e as vias de sinalização ainda precisam ser elucidadas. Evidências têm indicado que a expressão de REα pode modular a resposta de células de câncer frente a diferentes tratamentos, por meio da autofagia.[6 , 7] A macroautofagia, referida como “autofagia”, é uma via lisossomal de reciclagem de macromoléculas e organelas celulares, que são sequestradas em autofagossomos, circundados por membrana dupla. Estas se fundem com lisossomos, formando os autolisossomos, nos quais ocorre a degradação.[8]

Estudos demonstraram que a ativação de autofagia em células normais pode evitar a formação do tumor, e a inibição de autofagia pode ser benéfica em tumores estabelecidos. Por outro lado, drogas citotóxicas utilizadas no tratamento de câncer mostraram ser indutoras de autofagia e podem desencadear morte celular em células deficientes em apoptose.[9] Pelo fato da autofagia ter papel duplo na tumorigênese e na progressão tumoral, a compreensão desses mecanismos pode trazer entendimento de como atuar na descoberta de possíveis alvos de tratamento no câncer de mama.

OBJETIVO

Avaliar o efeito dos compostos ICI 182,780 (fulvestranto), um antagonista seletivo dos receptores de estrógeno alfa/beta (REα/REβ), e do G-1, um agonista seletivo de receptores de estrógeno acoplados a proteínas-G (GPER), na possível indução de autofagia em linhagens de câncer de mama MCF-7 e SKBr3, bem como o efeito de G-1 na viabilidade celular.

MÉTODOS

Este trabalho foi aprovado pelo Comitê de Ética da Universidade Federal de São Paulo, com número do parecer 1748/10.

Reagentes

DMEM/F12, soro fetal bovino (SFB), penicilina/ estreptomicina e tripsina/ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA) 0,5% foram obtidos da Invitrogen™ do Brasil (St. Louis, MO, USA). ICI 182,780 (AstraZeneca do Brasil; Cotia, São Paulo, Brasil), 1-[4-(6-bromobenzo[1,3]dioxol-5-il)-3a,4,5,9b-tetrahidro-3Hciclopenta[c]quinolin-8-il]-etanona (G-1; Calbiochem®; Merck Biosciences, Darmstadt, Alemanha), 3-benzoato 17β-estradiol (17β-estradiol, E2) (Sigma Chemical Co.; St Louis, MO, USA) e 4,4’,4’’-[4-propil-(1H)-pirazol-1,3,5-triil]trisfenol (PPT). Rapamicina (RAP) e brometo de [3-(4,5-dimetiltiazol-2il)-2,5-difenil tetrazólio (MTT) foram obtidos da Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA). Laranja de acridina (LA) foi obtida da Molecular Probes (Eugene, OR, USA). O plasmídeo GFP-LC3 foi proveniente do National Institute for Infectious Diseases , nos Estados Unidos, e Istituto di Ricovero e Cura a Carattere Scientifico L. Spallanzani , Roma, Itália.

Cultura de células

Foram utilizadas linhagens de células de câncer de mama MCF-7, que expressam REα, REβ e GPER, para verificar qual o efeito de ICI 182,780 e G-1 nas células que possuem os três tipos de receptores. A linhagem SKBr3, que expressa GPER mas não expressa REα, foi utilizada para verificar se os efeitos de ICI e G-1 na formação de compartimentos ácidos ocorriam apenas nas células que possuem REα.[5] As células foram mantidas em 37°C e 5% dióxido de carbono em meio DMEM/F12 livre de vermelho de fenol e suplementado com 10% SFB, 100U/mL de penicilina e 100µg/mL de estreptomicina. Foram também plaqueadas em meio DMEM/F-12 livre de vermelho de fenol por 24 horas.

Tratamentos na verificação de viabilidade celular e autofagia

As concentrações utilizadas nos experimentos foram baseadas na literatura. Os RE podem responder a concentrações na ordem de picomolar e nanomolar. Assim, para os componentes que possuem ação nesses receptores, foram utilizadas concentrações na ordem de nanomolar, para que os efeitos fossem observados em tempos menores de tratamento, já que o processo de indução de autofagia ocorre normalmente antes de se detectar a redução na viabilidade. Os efeitos antiproliferativos de ICI 182,780 podem ser observados a partir de concentrações como 1nM e são dependentes do tempo de tratamento, assim como da concentração.[4 , 10] Estudos demonstram que G-1 na concentração de 100nM leva à ativação de GPER por vias rápidas e vias de sinalização que levam à transcrição de genes, embora concentrações menores também tenham sido relatadas.[11] Nos experimentos, as células também foram tratadas com RAP como controle positivo na indução de autofagia, por sua inibição em mTOR. As concentrações utilizadas na literatura variam de 20nM até 10µM, em tratamentos por 24 horas, em linhagens de células de câncer de mama.[12 , 13] Para este estudo, utilizou-se a concentração de 1µM de RAP descrita como capaz de levar à formação de LC3-II na membrana de autofagossomos.

Como o ICI é um antagonista de REs, como contraprova para descartar a ativação de REs, utilizou-se E2, que é agonista de REs e GPER, e PPT, um agonista seletivo de REα. As concentrações de E2 para ativar REs variam na ordem de picomolar e nanomolar, como 0,1nM até 10nM.[4] Na literatura, são utilizadas concentrações de PPT desde 5 a 200nM, então, optou-se por utilizar concentrações intermediárias, como 10nM e 100nM.[14]

Western blot para avaliar a expressão dos receptores de estrógeno alfa e receptores acoplados a proteínas-G

As células foram plaqueadas em placas de seis poços e mantidas em meio de cultura até o dia do experimento. Foi realizado o protocolo de extração de proteínas totais com tampão de lise contendo 10mM Tris, pH 7,4, 10mM NaCl, 3mM MgCl2, 0,5% Nonidet P40, coquetel de inibidores de proteases, 1mM PMSF, 2mM Na3VO4, 50mM NaF, 10mM Na2P2O7(Sigma Chemical Co.). Em seguida, os extratos foram centrifugados (13.200rpm, por 5 minutos, a 4°C), e o sobrenadante foi coletado. Aproximadamente 50μg de proteínas foram separados por eletroforese em gel de poliacrilamida e, posteriormente, transferidos para uma membrana de fluoreto de polivinilideno (PVDF). O bloqueio dos sítios inespecíficos foi realizado com incubação com leite desnatado (5%) em tampão TBS-Tween (1%) por 1 hora, à temperatura ambiente. As membranas foram incubadas durante a noite a 4°C com anticorpos primários (diluídos em leite 2% em tampão TBS-Tween) para o REα (sc 8002, Santa Cruz Biotechnology) e o GPER (ab39742, Abcam). Foi utilizado anticorpo secundário específico, marcado com peroxidase (HRP - horseradish peroxidase ). O produto da reação foi revelado com ECL (PerkinElmer), e as imagens foram capturadas em fotodocumentador digital UVITEC (Cambridge). Em seguida, as membranas foram submetidas a protocolo de stripping e incubadas com anti-alfa tubulina (1:10.000, Sigma-Aldrich Biotechnology), para a marcação do controle interno.

Avaliação de viabilidade celular pelo ensaio de MTT

O ensaio de MTT se baseia na ação de enzimas mitocondriais de células viáveis que levam à conversão do sal tetrazólio MTT, amarelo, para um produto formazan azul escuro.[15] Células MCF-7 foram plaqueadas em triplicatas em placas de 96 poços, com densidade de 10[4] células/poço. Após 24 horas, o SFB foi retirado, e as células foram mantidas em DMEM/F12 por 24 horas, sendo posteriormente tratadas com ICI, G-1 e RAP por 24 horas, 48 horas e 72 horas e comparadas com um Grupo Controle (CTR), sem tratamento, mantido apenas em DMEM/F12. Para a leitura, foram adicionados 50µg/mL de MTT (diluído em tampão fosfato-salina − PBS) em cada poço e foi realizada incubação a 37°C, por 3 horas. O meio foi retirado e adicionou-se álcool 100% em cada poço. A leitura foi realizada em espectrofotômetro de placa, no comprimento de onda de 595nm.

Transfecção de células MCF-7 para expressão de GFP-LC3

Durante a elongação da vesícula autofágica, ocorre recrutamento de LC3 ( light chain 3). A proteína LC3, encontrada dispersa homogeneamente no citosol na forma de LC3-I, é recrutada especificamente para a membrana de vesículas de autofagossomos, mudando para a forma LC3-II. A fusão da proteína LC3 com proteína fluorescente verde (GFP - green fluorescent protein ) permite observar a indução do processo de autofagia por meio do acúmulo de LC3 nos autofagossomo, sendo observada pontuação verde GFP em microscopia de fluorescência.[16]

As células foram plaqueadas em placas de 35mm contendo lamínula de 25mm tratada com poliornitina (0,01mg/mL). Após adesão, as células foram transfectadas com 0,5µg de plasmídeo pCLPCX-GFP-LC3, que contém o gene que codifica a proteína LC3 conjugada com o gene que, por sua vez, codifica a GFP. Para transfecção, foi utilizado 0,5µg do plasmídeo misturado com 3μL de FuGENE®HD (Fugent, LLC., USA) em 100μL de DMEM/F12. As células foram incubadas com a mistura dos reagentes em 1,5mL de meio DMEM/F12 suplementado com 10% de SFB, 100U/mL de penicilina e 100µg/mL de estreptomicina, e mantidas em 37°C e 5% de dióxido de carbono. No dia seguinte, as células foram cuidadosamente lavadas com PBS e incubadas com meio de cultura DMEM/F12 não suplementado por mais 24 horas, totalizando 48 horas para a expressão da proteína.

Microscopia de fluorescência para avaliar autofagia decorrente de expressão de GFP-LC3

As células transfectadas foram visualizadas com microscópio de fluorescência Nikon TE300 (Nikon Osaka, Japão) acoplado a uma câmera digital CoolSNAP™ (Roper Sci, Princeton Instruments, USA) de alta resolução, com sistema de resfriamento para diminuição de ruídos e aumento da resolução. As imagens foram obtidas a cada 30 minutos, com tempo máximo de 4 horas para cada experimento. Os experimentos foram realizados com a objetiva de 40x. A excitação foi feita no comprimento de onda 488nm e emissão coletada em 505nm.

Como a autofagia é um processo basal, o aumento de pontuações da GFP-LC3 ocorre na presença de um estímulo indutor autofágico. Para fazer a quantificação dessas pontuações, foi estabelecido um limite de corte a partir do controle (células sem tratamento, mantidas em DMEM/F12). Para cada célula controle, foi calculada a diferença entre o número de pontuações no início e o número de pontuações máximo, independentemente do tempo, sendo tempo máximo de observação até 4 horas.

Detecção de compartimentos ácidos por citometria de fluxo

As células foram marcadas com LA para estimar a quantidade de organelas vesiculares ácidas por citometria de fluxo, como indicativo das etapas finais do processo autofágico,[17] uma vez que a LA, na forma protonada, acumula-se em vesículas ácidas.

Células plaqueadas em placas de seis poços foram mantidas em DMEM/F12 sem SFB. Nos experimentos, as células foram tratadas com ICI, G-1, RAP, E2 e PPT, por 24 ou 48 horas, e comparadas ao Grupo Controle (CTR). Depois foram tripsinizadas, adicionando-se 1mL de PBS, e transferidas para tubos, seguindo com centrifugação por 1.300rpm, por 8 minutos. O sobrenadante foi descartado, e as células foram ressuspensas em 400µL de LA diluída em PBS (100ng/mL). As células foram incubadas por 15 minutos em temperatura ambiente e protegidas da luz. As medidas foram obtidas por citometria de fluxo (FACSCalibur, BD, Biosciences). O comprimento de onda para excitação foi 488nm, e a detecção da fluorescência foi obtida por 510 a 530nm (fluorescência verde, FL1) e por 650nm (fluorescência vermelha, FL3). Os dados foram obtidos pelo programa CellQuest™ e analisados pelo programa WinMDI 2.9.

Análise estatística

Os resultados obtidos foram submetidos à análise estatística por análise de variância (ANOVA) de uma via, seguida de pós-teste Tukey ou Bonferroni, e teste t de Student. Os dados foram expressos nos histogramas como média±erro médio padrão. As análises foram feitas no programa GraphPad Prism, versão 4.0.

RESULTADOS

Expressão de receptores de estrógeno nas linhagens MCF-7 e SKBr3

Inicialmente, foi realizado um ensaio de Western blot para verificar a presença dos receptores que estariam expressos diferencialmente nas duas linhagens de câncer de mama. Conforme demonstrado na figura 1A , o REα esteve expresso em grande quantidade em células MCF-7, mas não estava expresso de maneira significativa na célula SKBr3. Quanto ao receptor GPER, este encontrou-se expresso em quantidades similares em ambas as linhagens.

Figura 1

Expressão de receptores de estrógeno nas linhagens MCF-7 e SKBr3 e viabilidade celular por MTT em células MCF-7. Em A, expressão de receptores de estrógeno alfa e receptores acoplados a proteínas-G em células MCF-7 e SKBr3. Os autorradiogramas representativos mostram a expressão diferencial de receptores de estrógeno alfa nas duas linhagens, enquanto o receptor acoplado a proteínas-G se mantém em níveis similares. Em B, C e D, viabilidade celular por MTT de células MCF-7 tratadas com ICI (B), G-1 (C) e rapamicina (D) por 24 horas, 48 horas e 72 horas em meio DMEM/F12 sem soro fetal bovino. Os dados representam a média±erro médio padrão de quatro experimentos independentes (24 horas e 48 horas) e três experimentos (72 horas) feitos em triplicata. Análise de variância uma via (ICI e G-1) com múltiplas comparações por teste Tukey. Teste t não pareado (rapamicina versus CTR). Valor de p<0,05 foi considerado significativamente diferente ao Grupo Controle, sem tratamento. ICI e rapamicina diminuem a viabilidade celular em MCF-7 após 48 e 72 horas. G-1 não influenciou na viabilidade celular em 24, 48 ou 72 horas

REα: receptor de estrógeno alfa; CTR: Grupo Controle (sem tratamento); RAP: rapamicina; ICI: fulvestranto.

Ensaio de viabilidade celular das células MCF-7 e SKBr3

O ensaio de viabilidade foi realizado para testar o efeito do ICI, de G-1 e RAP (como indutor de autofagia, por inibição de mTOR) no crescimento de células MCF-7 ( Figura 1B a 1D ) e SKBr3 ( Figura 2A a 2C ). A diminuição no número de células pode ter sido devida à inibição da proliferação ou morte celular.[15] Para prosseguir com a avaliação da autofagia, verificou-se, antes, em quanto tempo ocorreu a diminuição da viabilidade das células após os tratamentos com ICI, G-1 e RAP em células MCF-7 inicialmente. Nos tratamentos por 24 horas com ICI (25, 50, 100 e 200nM), não foram observadas alterações na viabilidade celular. Porém, nos tratamentos de 48 horas e 72 horas, o ICI levou à diminuição da viabilidade (p<0,05). Ao comparar a resposta entre as diferentes concentrações de ICI, não houve diferença na diminuição da viabilidade celular, mas na concentração de 100nM a variação entre as amostras foi menor ( Figura 1B ). Não houve diferença entre os tratamentos de 48 e 72 horas (p>0,05). Nos tratamentos com o agonista de GPER, G-1, nas concentrações de 1nM, 10nM e 100nM, por 24, 48 e 72 horas ( Figura 1C ), não foi observada diminuição no número de células (p>0,05). Para utilizar a RAP como controle positivo nos ensaios de autofagia, testou-se seu efeito na viabilidade, para determinar o melhor período de tratamento que precede à observação da diminuição de viabilidade celular. No tratamento de 24 horas com RAP (1µM), não foram observadas alterações (p>0,05), porém, nos tratamentos de 48 e 72 horas (p<0,05 em relação ao controle), houve diminuição da viabilidade ( Figura 1D ). Não houve diferença entre os tratamentos de 48 e 72 horas (p>0,05).

Figura 2

Efeitos de ICI, G-1 e rapamicina em células SKBr3. Viabilidade celular por MTT de células SKBr3 tratadas com ICI (A), G-1 (B) e rapamicina (C) por 24, 48 e 72 horas, em meio DMEM/F12, sem soro fetal bovino. Os dados representam a média de um experimento em triplicata. Valor de p<0,05* foi considerado significativamente diferente do controle, considerando desvio padrão da amostra. Nenhum dos compostos (ICI, G-1 e RAP) foi capaz de induzir a redução da viabilidade celular em SKBr3. Em D e E, marcação de células SKBr3 com laranja de acridina após tratamento com ICI (100nM), G-1 (100nM) e rapamicina (1µM) por 24 horas mostra que ICI e G-1 não induziram formação de compartimentos ácidos em SKBr3, linhagem que não expressa receptor de estrógeno alfa. Em D, gráficos de detecção da fluorescência em fluorescência verde e fluorescência vermelha. Em E, histograma mostrando valores médios (±erro médio padrão) em percentagem de células marcadas com laranja de acridina. Análise de variância de uma via, seguida do teste de Bonferroni (n=4). Grupo Controle, sem tratamento. Em E, *p<0,05 representa diferença estatística entre rapamicina versus Grupo Controle (sem tratamento) e G-1

CTR: Grupo Controle (sem tratamento); RAP: rapamicina; ICI: fulvestranto; LA: Laranja de acridina.

Na avaliação da viabilidade celular de células SKBr3 ( Figura 2A ), ao contrário do que ocorre nas células MCF-7, o ICI aumentou a viabilidade dependente do tempo e da concentração quando comparado ao Grupo Controle. Foi observado aumento de viabilidade celular nas concentrações de 50nM (48 horas), 100nM (24, 48 e 72 horas) e 200nM (24 e 48 horas). O tratamento com G-1 em células SKBr3 também aumentou a viabilidade celular em determinadas concentrações e tempo (na concentração de 1nM, em 24 horas, e nas concentrações de 10nM e 100nM, em 72 horas; Figura 2B ). A RAP não influenciou na viabilidade celular em células SKBr3, independente do tempo ( Figura 2C ). Para investigar se a ausência da autofagia, células SKBr3, que não expressaram REα, foram tratadas com ICI (100nM), G-1 (100nM) e RAP (1μM) por 24 horas ( Figura 2D e 2E ). As células foram marcadas com LA e analisadas por citometria de fluxo. Os dados demonstraram que ICI e G-1 não aumentaram o número de organelas vesiculares ácidas quando comparadas com o CTR (p>0,05) e RAP (p<0,05), sugerindo que, uma vez que não houve redução de viabilidade, a falta de autofagia pode justificar este resultado.

Efeito do tratamento com ICI 182,780 e G-1 na indução de autofagia por meio da pontuação de GFP-LC3 e na formação de organelas vesiculares ácidas em células MCF-7

Durante a formação dos autofagossomos, ocorre a translocação específica de LC3 para a membrana do autofagossomo.[16]

Células MCF-7 expressando GFP-LC3 foram visualizadas por 4 horas após tratamento com ICI (100nM) e G-1 (100nM) ( Figura 3 ). Rapamicina (1μM) foi utilizada como controle positivo. Os resultados mostram que os tratamentos com ICI e G-1 não induziram translocação de GFP-LC3 que caracterizasse um aumento na autofagia quando comparados com o CTR. Por outro lado, a RAP aumentou a formação de autofagossomos, evidenciado pela translocação de GFP-LC3 e aumento de pontuações ( Figura 3A ).

Figura 3

Indução de autofagia induzida por rapamicina por meio da pontuação de GFP-LC3 em células MCF-7. Observa-se que ICI e G-1 não induziram autofagia no tempo observado (4 horas). Em A, imagens obtidas por microscopia de fluorescência de células MCF-7 expressando GFP-LC3 e estimuladas com rapamicina (1µM), ICI (100nM) e G-1 (100nM). Células foram mantidas em DMEM/F12 (CTR) e visualizadas a cada 30 minutos, durante 4 horas. (objetiva de 40x). Em B, histograma representando a quantificação de células que apresentaram aumento na pontuação de GFP-LC3 por 4 horas em células MCF-7. A média±erro médio padrão foi calculada a partir de cinco experimentos controles independentes. O limite superior foi obtido (média + duas vezes o erro médio padrão) e estabelecido como limite de corte, que, nesse caso, foi igual a um aumento de nove pontuações por célula. Para cada experimento, foi calculada a percentagem de células com aumento superior a esse limite. Análise de variância de uma via, seguida do teste de Bonferroni. Valores médios obtidos de pelo menos três experimentos independentes. Os grupos ICI, G-1 e rapamicina foram comparados ao Grupo Controle

*p<0,05, representa diferença significante.

CTR: Grupo Controle (sem tratamento); RAP: rapamicina; ICI: fulvestranto.

Conforme descrito anteriormente,[9] a autofagia é um processo que pode ocorrer como forma de sobrevivência na presença de um estímulo estressante, avaliamos se esses efeitos estariam envolvidos na diminuição da viabilidade. Como os resultados demonstraram que não houve diminuição da proliferação em 24 horas, mas houve com 48 horas, prosseguiu-se com esses períodos de tratamento para investigar os efeitos de ICI e G-1 na formação de compartimentos ácidos pela marcação com LA e detecção por citometria de fluxo ( Figura 4 ). Os resultados mostraram que o tratamento com ICI (100nM) aumentou o número de compartimentos ácidos, tanto em 24 horas quanto em 48 horas, similar a RAP (1μM). Ambos os tratamentos foram significativamente diferentes (p<0,05) do CTR e não houve diferença entre os tratamentos com ICI e RAP (p>0,05), e entre os tratamentos de 24 e 48 horas ( Figura 4 ). Por outro lado, não foram observadas alterações nas medidas de compartimentos ácidos (p>0,05) nas células tratadas com G-1 ( Figura 4 ).

Figura 4

Efeito do ICI, G-1 e rapamicina sobre a formação de organelas vesiculares ácidas em células MCF-7. ICI e rapamicina induzem a formação de compartimentos ácidos em 24 e 48 horas em células MCF-7, enquanto G-1 não altera esse processo. Os histogramas apresentam valores médios±erro médio padrão em percentagem de células marcadas com laranja de acridina e analisadas por citometria de fluxo. Células MCF-7 foram tratadas com ICI (100nM), G-1 (100nM) e rapamicina (1µM) durante 24 horas (A e C) e 48 horas (B e D). Análise de variância de uma via, seguida do teste de Bonferroni. Em A, n=6; em B, n=5

* p<0,05 representa diferença significante entre ICI versus (Grupo Controle, sem tratamento, e G-1) rapamicina (Grupo Controle, sem tratamento, e G-1).

CTR: Grupo Controle (sem tratamento); RAP: rapamicina; ICI: fulvestranto; LA: laranja de acridina.

Efeito de 17β-estradiol e PPT na formação de compartimentos ácidos em células MCF-7 como indicativo de autofagia

Como o efeito de diminuição da viabilidade celular e do aumento de compartimentos ácidos em células MCF-7 ocorreu após o tratamento com ICI, mas não com G-1, esses efeitos poderiam estar associados com o antagonismo de REs e não envolveriam a ativação de GPER. Para investigar o efeito de agonistas de REs na autofagia, células MCF-7 foram tratadas por 24 horas com E2 (0,1nM, 1nM e 10nM) e comparadas com ICI (100nM). Os resultados mostraram que diferentes concentrações de E2 não foram capazes de aumentar os níveis de compartimentos ácidos nas células (p>0,05 comparado com CTR; Figura 5A e 5C ). Como E2 age nos diferentes RE, células MCF-7 foram tratadas por 24 horas com PPT (10nM e 100nM), um agonista específico de REα, que também não aumentou o nível de compartimentos ácidos (p>0,05 comparado ao controle) ( Figuras 5B e 5D ).

Figura 5

Detecção de organelas vesiculares ácidas por citometria de fluxo em células MCF-7 marcadas com laranja de acridina após tratamento com os compostos por 24 horas. A ativação dos receptores de estrógeno com 17β-estradiol, assim como a ativação seletiva de receptor de estrógeno alfa com PPT não induz formação de compartimentos ácidos em células MCF-7. Em A e C, células MCF-7 tratadas com 17β-estradiol nas concentrações 0,1nM, 1nM e 10nM. Em B e D, células MCF-7 tratadas com PPT nas concentrações de 10nM e 100nM. Em células MCF-7, os efeitos foram comparados com o ICI (100nM). Em A e B, gráficos de detecção da fluorescência em fluorescência verde e vermelha. Em C e D, os histogramas mostram valores médios±erro médio padrão em percentagem de células marcadas com laranja de acridina. Análise de variância de uma via, seguida do teste de Bonferroni (n=4). Em C e D, *p<0,05 representa diferença estatística em comparação com os outros grupos

* p<0,05 representa diferença estatística em comparação com os outros grupos.

CTR: Grupo Controle (sem tratamento); E2: 17β-estradiol; ICI: fulvestranto; LA: laranja de acridina.

DISCUSSÃO

A autofagia é um mecanismo celular que pode levar à eliminação de componentes intracelulares quando da presença de um estímulo agressor ou pelo acúmulo de proteínas ou de organelas defeituosas.[9] Alterações na via autofágica podem ocorrer em células cancerígenas e após quimioterapia. No câncer de mama, evidências apontam que proteínas envolvidas na via autofágica, como beclina-1, regulam o crescimento celular e interferem na sinalização de estrógeno.[18]

Estudos com os antagonistas de REs, como ICI e tamoxifeno, em células de câncer mamário, promovem aumento da autofagia[10 , 18 - 22] que pode levar à resistência do câncer de mama e proliferação. Sabe-se que o ICI é antagonista de REα e REβ, mas foi relatado que, em modelos nos quais o ICI não tem efeito ou possui efeito agonista, sua ação deve ocorrer devido à ativação de GPER.[5] Dessa forma, para o presente trabalho, compararam-se inicialmente as ações citotóxicas/antiproliferativas de ICI com G-1, um agonista seletivo de GPER. Verificou-se uma possível ação antiproliferativa de ICI em células MCF-7, que expressam REs, com tratamentos de 48 e 72 horas, pois não verificamos morte destas células nestas condições experimentais, em ensaios paralelos realizados (dados não mostrados). Sabe-se que o ICI causa uma diminuição da atividade de REα[23] e seu efeito antiproliferativo está associado ao bloqueio dos REs clássicos, levando as células RE-positivas à morte celular por apoptose.[24]

Quanto ao envolvimento de GPER na proliferação celular, embora nossos resultados tenham demonstrado que a ativação seletiva de GPER pelo G-1 não tenha interferido nos parâmetros avaliados, trabalhos anteriores demonstraram os efeitos antiproliferativos e apoptóticos de G-1 em MCF-7, com concentração igual ou superior a 1µM de G-1, com pelo menos 72 horas de tratamento.[25 , 26] Por outro lado, foi demonstrado que a via GPER pode estar envolvida no comportamento agressivo de tumores de mama, por meio da regulação da expressão da enzima aromatase, após inibição de GPER em células MCF-7 resistentes a tamoxifeno.[27] Assim, GPER pode representar um alvo de tratamento no câncer de mama, e sua participação no crescimento de tumores de mama e na resistência tumoral após tratamento com antiestrógenos precisa ser melhor investigada.

Para verificar a participação dos RE e do GPER na autofagia, investigamos o efeito de ICI e G-1 na translocação de GFP-LC3, que é uma estimativa do processo de autofagia. Embora o ICI não tenha levado à translocação de GFP-LC3 neste estudo, isso pode estar relacionado com o tempo de exposição, que foi de 4 horas, e seria necessário um tempo maior para a indução da autofagia[10 , 28] ou ainda poderia ocorrer a indução de vias autofágicas, que não envolvem a translocação de LC3.[7] Já a ativação seletiva de GPER, com G-1, não induziu autofagia por translocação de LC3. Os efeitos de G-1 na autofagia ainda são desconhecidos e nas condições experimentais utilizadas no presente estudo, não foram observadas alterações significativas. Sobre a participação de GPER na autofagia, foi verificado que G-15, um antagonista de GPER, pode induzir autofagia independente de REs em linhagens de células de câncer de cabeça e pescoço humano, a despeito nos níveis de expressão de GPER.[29] O papel de GPER na proliferação do câncer tem sido bastante explorado, porém a existência de uma interrelação entre esta via e a autofagia, um importante fenômeno de sobrevivência celular, não foi identificada.

Os experimentos com ICI em células MCF-7 mostraram aumento na marcação, com LA indicando maior número de compartimentos ácidos. Esse efeito não foi observado na linhagem SKBr3, que não expressa REα. Estudos demonstraram[10 , 28] que o ICI pode levar à autofagia em células MCF-7 por outras metodologias, corroborando nossos resultados. Além de verificarem a translocação de LC3, checaram também a diminuição de p62, outro indicador da indução de autofagia. Essa proteína é requerida para a formação de agregados proteicos ubiquitinados, sendo direcionada e incorporada nos autofagossomos e, por fim, degradada nos autolisossomos.[16] Sabe-se que o ICI causa uma diminuição da atividade de REα por induzir a degradação do receptor pelo sistema ubiquitina-proteassomo.[23] A relação entre sistema ubiquitina-proteassomo com autofagia nos processos de captação de moléculas e degradação precisa ser mais bem investigada.[30] Além disso, evidências apontam para a existência de uma interação de REα com beclina 1, uma das principais proteínas responsáveis pela formação de autofagossomos,[18] sugerindo que a autofagia induzida por ICI tem relação principalmente com sua ação antagonista em REα.

Os resultados do MTT mostraram que a viabilidade de células SKBr3 não foi alterada com o tratamento com RAP 1µM por 24, 48 e 72 horas. De acordo com estudos clínicos, a RAP parece ter efeito citostático, pois a diminuição da proliferação do câncer de mama é modesta, mas quando utilizada em conjunto com outros quimioterápicos, o sinergismo é mais efetivo no tratamento.[31] Apesar disso, a RAP induz formação de vesículas ácidas, que podem ser por indução de autofagia, embora não cause diminuição da viabilidade celular. Porém ressalta-se que para o presente estudo, a RAP foi utilizada como um controle positivo para verificar o aumento de organelas vesiculares ácidas e comparar com os efeitos de ICI e G-1.

Ao comparar os efeitos de ICI e G-1 em células SKBr3, alguns dos tratamentos, dependendo do tempo e da concentração, aumentaram a viabilidade celular dessas células, sem que fosse observada redução da viabilidade celular. Aparentemente, a resposta pela indução de GPER foi de sobrevivência em células RE-negativas. Paralelamente a esse evento, não ocorre estimulação na formação de vesículas ácidas, como lisossomos, que representam as últimas etapas da degradação de componentes macromoleculares e ocorrem na presença de estímulos causadores de estresse celular. Alguns estudos[11 , 32] relataram efeitos pró-proliferativos de G-1 em células SKBr3 e também de ICI em células SKBr3, mostrando que a falta de expressão de REs, principalmente REα, e a presença de GPER podem determinar efeitos proliferativos em células de câncer de mama negativas para receptores de estrógeno, demonstrando porque os tratamentos com antiestrógenos, como o tamoxifeno e ICI, não são efetivos nesse tipo de câncer de mama.

Depois que foi estabelecida a relação entre autofagia e câncer, diversas pesquisas foram realizadas, a fim de descobrir o papel da autofagia e sua relação com o câncer e resposta terapêutica, avaliando a relação entre a via autofágica e a proliferação e/ou morte celular. Em relação ao câncer de mama, estudos verificaram que antagonistas de REs, como ICI e tamoxifeno, em células de câncer mamário, promoveram o aumento da autofagia.[10 , 18 - 22] Evidências recentes mostraram que a inibição da autofagia é capaz de induzir morte celular, sendo a autofagia um mecanismo de sobrevivência,[22 , 33 , 34] e, no caso de células de câncer de mama positivas para receptores de estrógeno, a autofagia induzida pelo ICI parece contribuir para a resistência do câncer.[10] Como ICI tem efeito de ativação em GPER, ainda não foi investigado se a via GPER está envolvida com a sobrevivência pelo processo autofágico. Assim, é importante avaliar qual o papel desse receptor nos mecanismos de sobrevivência do câncer mamário, tornando-se um importante alvo no tratamento do câncer.

CONCLUSÃO

Um problema importante na terapia do câncer de mama é a resistência adquirida após tratamento com antiestrógenos, como o ICI. Um de seus alvos, o receptor de estrógeno acoplado a proteína-G, parece ter papel importante na proliferação/viabilidade de células cancerígenas, e sua ação parece variar dependendo das condições do meio. Um mecanismo celular de proteção bastante investigado atualmente é a ativação da autofagia. O efeito do ICI no aumento de compartimentos ácidos em células positivas para receptores de estrógeno parece estar associado principalmente com seu efeito de inibição dos receptores de estrógenos, e o receptor de estrógeno acoplado a proteína-G parece não estar envolvido. Esses dados podem ser importantes para compreender os mecanismos de morte celular e resistência, visando a novas alternativas terapêuticas.