Although with intact mucosa at colonoscopy, chagasic megacolons have an overexpression of Gal-3.

OBJECTIVE: To evaluate the density of anti-galectin-3-immunostained cells, collagen percentage, mast cell density and presence of pathological processes in intestinal muscle biopsies of patients.
METHODS: Thirty-five patients who underwent intestinal biopsy were selected from 1997 to 2015. Patients were divided into three groups: chagasic patients with mucosal lesion (n=13), chagasic patients with intact mucosa (n=12) and non-chagasic patients with no mucosal lesion (n=10). Histological processing of the biopsied fragments and immunohistochemistry for galectin-3 were performed. Additional sections were stained with hematoxylin and eosin to evaluate the general pathological processes, picrosirius for evaluation of collagen and toluidine blue to evaluate the mast cell density.
RESULTS: Patients of mucosal lesion group had a significantly higher frequency of ganglionitis and myositis when compared to the chagasic patients with intact mucosa and non-chagasic group. The density of anti-galectin-3-immunostained cells was significantly higher in the chagasic patients with intact mucosa group when compared to the non-chagasic group. The group of chagasic patients with intact mucosa presented a higher percentage of collagen in relation to the patients with mucosal lesion and to the non-chagasic group, with a significant difference. There was no significant difference in mast cell density among the three groups.
CONCLUSION: The higher density of anti-galectin-3-immunostained cells in patients in the chagasic patients with intact mucosa group suggested the need for greater attention in clinical evaluation of these patients, since this protein is associated with neoplastic transformation and progression.

INTRODUCTION

Chagas disease, described by Carlos Chagas in 1909, is a potentially lethal zoonosis ( that affects millions of people in Latin America. ( The World Health Organization (WHO) estimates there are approximately 6 to 7 million people infected worldwide – mostly in Latin America. In Brazil, the number of infected persons is approximately 1,156,821, which is very expressive in the health and social context of the continent, requiring priority and attention on the part of the countries. ( About 20 to 30% of the infected individuals develop cardiomyopathy and/or digestive syndromes, leading to incapacity or death, with social and economic implications. ( In the digestive form of Chagas disease, there is destruction of the intramural ganglions and parasympathetic denervation in the entire digestive tract, especially affecting the esophagus and the rectosigmoid. (

Association between the digestive form of Chagas disease and malignant neoplasms varies from 3.4 to 9.2%. In Chagas disease, neoplasms can arise due to dilation of the organ and the consequent food stasis, triggering prolonged contact between the carcinogen agents and the intestinal mucosa. ( In this way, the modifications that occur in a chronic infection by Trypanosoma cruzi (T. cruzi), especially myoenteric denervation, responsible for the digestive forms of the disease, have a close relation with the etiopathogeny of colorectal carcinogenesis. ( According to the last global estimate, colon and rectal cancer are the third most common type among men, with 17,380 new cases a year, and the second most common type of cancer in women, with 18,980 new cases in 2018. (

Various molecules participate in the inflammatory condition in Chagas disease, among which, galactic 3 (Gal-3). ( It has been demonstrated that T. cruzi uses Gal-3 to interact with laminin, the primary constituent of basal membranes, promoting fixation and entrance of the parasite. ( On the other hand, the lower expression of Gal-3 favors the multiplication of amastigotes, which suggests that this galectin develops control throughout the chagasic infection. ( In addition to controlling the multiplication of the amastigotes, it is known that Gal-3 is important in fibrinogenesis, ( and is increased in activated myofibroblasts and monocytes, besides being important for the activation of mast cells. ( Mast cells release tryptase and thrombin, which increase the differentiation of human fibrocytes, leading to the formation of collagen fibers in damaged tissues. (

Although Gal-3 seems to be important for the control of T. cruzi , ( this galectin has been associated with the malignization of a few lesions, having been suggested that the evaluation of this galectin could work as a marker for tumor lesions. ( Nevertheless, the role of Gal-3 in neoplasms is not yet well understood. Generally, it is related to the cell-cell adhesion and cell-matrix adhesion, cellular polarity, motility, activation, differentiation, transformation, signaling, regulation of the adaptive/innate immunity, and angiogenesis. (

In colorectal cancers, it has been shown that the large expression of Gal-3 promotes the beginning and progression of the tumors, and is associated with metastasis and with a poor prognosis. ( Patients with increased expression of Gal-3 die more frequently or have a greater tendency towards relapses. Despite this, the risk of death is reduced in patients with the absence or low expression of Gal-3. (

In the present study, we raised the hypothesis that the patients with chagasic megacolon show a greater frequency of pathological processes, such as myositis, and ganglionitis; a greater percentage of collagen; and lower density of mast cells in the muscular layer of the colon. Additionally, we believe that the Chagas disease patients present with greater expression of Gal-3, especially in areas with a lesion visible on colonoscopy. The large expression of Gal-3 in these lesions would indicate a greater possibility of malignant transformation and metastasis of cancerous lesions. Thus, the evaluation of Gal-3 could contribute as an additional factor in determining the malignancy potential of the lesions found in chagasic megacolons.

OBJECTIVE

To evaluate the frequency of pathological processes, the percentage of collagen, the density of mast cells, and the density of cells immunostained by anti-Gal-3 in the intestinal muscles of patients biopsied with chagasic megacolon, who presented with an intact or damaged mucosa on colonoscopy.

METHODS

Patient selection

Thirty-five colon fragments were selected from the biopsies of 35 patients aged between 44 and 85 years. Patients were divided into three groups, according to the description present in the reports: Chagas disease patients with mucosal lesion (CML) (n=13), Chagas disease patients with intact mucosa (CIM) (n=12), and non-chagasic patients with no mucosal lesions (NC) (n=10). Individuals were homogenized as per age and sex.

The inclusion criteria were: (1) for the CML Group: Chagas disease patients, presenting with megacolon with an ulcerated intestinal mucosa and/or mucosal hypotrophy; (2) for the CIM Group: chagasic patients, presenting with megacolon and intact intestinal mucosa; (3) for the NC Group: non-chagasic patients with intestinal infarction, who did not present with any inflammatory lesion of the intestinal mucosa or muscles. For this group, the fragments were removed from the region close to the infarction.

Excluded from the study were patients with megacolon from other etiologies, aged under 18 years, Chagas disease patients with no megacolon, and intestinal mucosa lesions with no chagasic megacolon.

The present project was approved by the Research Ethics Committee of the Universidade Federal do Triângulo Mineiro (UFTM), with CAAE: 22725013.4.0000.5154 and opinion no. 735.931. After approval, a longitudinal retrospective study was carried out with an analysis of protocols of complete biopsies performed with clinical indication in a private laboratory in the city of Uberaba (MG, Brazil), between 1997 and 2015.

Histological processing

The biopsied fragments of the colon muscularis propria were included in paraffin and sliced in a microtome, obtaining 5µm-thick slices. These slices were placed on glass slides and stained with the following elements: hematoxylin and eosin, for evaluation of general pathological processes; picrosirius and toluidine blue, for evaluation of collagen and mast cells, respectively. The other slice was placed on a silanized slide for immunohistochemical processing for Gal-3.

Processing and immunohistochemical evaluation for galectin-3

For the immunohistochemical processing of Gal-3, the slices were deparaffinized, rehydrated, and washed with ultrapure water for 5 minutes at room temperature. Then, the antigenic retrieval with humid heat was done, with 0.01 M citric acid and pH 6 for 30 minutes. Next, the slices were incubated with 2% phosphate buffered saline/bovine serum albumin (PBS/BSA) during 30 minutes, to block unspecific bonds.

The anti-Gal-3 antibodies were diluted in 2% PBS/BSA at a concentration of 1:75 (R&D, Minnesota, USA). Further, the slices were incubated for 18 hours (overnight) at 4°C with diluted primary antibody, and posteriorly were washed twice with PBS and Tween 20 at 0.05%. The slices were the treated with methanol and hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) at 3% for 15 minutes, to block the endogenous peroxidase of the tissues. For detection of the antibody, the technique used was avidin-biotin conjugated with peroxidase (ABC) utilizing the lsab-plus (DAKO, Carpinteria, USA) kit. The complex was incubated for 30 minutes at room temperature of the laboratory (22°C - 25°C), and washed with PBS in the same manner as before.

The slides were developed with diaminobenzidine (DAB) (0.5mg/mL) and H 2 O 2 0.05% at room temperature, protected from light. Soon afterwards, the slices were washed with distilled water, counterstained with Harris hematoxylin, and mounted with Entellan.

The slides on which the immunohistochemical technique was performed for Gal-3, were analyzed under common light microscopy and a 63x lens, utilizing the Eclipse (Nikon, Berlin, Germany) microscope. Counting of cells immunostained with Gal-3 was carried out in all the fields of intestinal muscles. With the help of a micrometer blade, the area of the field on the 63x lens was calculated. Next, this area (0.14µm 2 ) was multiplied by the total number of fields analyzed to obtain the total area analyzed. With the total number of immunostained cells and the total area analyzed, the density of immunostained cells was calculated and was expressed in number of cells per µm 2 .

Determination of the collagen percentage

To evaluate the determination of the percentage of collagen in the intestinal muscles, slides stained by picrosirius were used. Picrosirius allows visualization of collagens type I and type III, enabling the qualitative analysis of the collagen fibers of the connective tissue, by means of different color interference, intensity, and birefringence of the stained tissues, distinguishing primarily type I and type III fibers. Type I fibers are presented thick, highly bifrengent and red, while type III fibers are in thin bundles, with weak birefringence and yellow-greenish. Analysis of the collagen was performed in all the fields where it was possible to observe muscles. Images were captured using a common light microscope, Axio 4.1 (ZEISS, Berlin, Germany), an Axiocam (ZEISS, Berlin, Germany) image-capturing camera, a computer, and the Axiovision 4.8 (ZEISS, Berlin, Germany) software. The images seen on the microscope were transmitted to the computer screen. For this analysis, the 40x lens and a polarizing filter were used. In the polarized image, collagen showed birefringence with yellowish, reddish, or greenish coloring, and is marked by the examiner with the help of a cursor. In this way, the software automatically determined the percentage of collagen per field.

Determining mast cell density

To determine the mast cell density, slides stained by toluidine blue were used. The slices were deparaffinized, washed in distilled water, stained with fuchsin-orange G, and quickly immersed in 60% alcohol. Next, the slides were rapidly immersed in toluidine blue and washed in running water. The images were analyzed on a common light microscope (Nikon, Berlin, Germany), with a 40x lens.

Mast cell count was carried out in all fields of the slide. With the help of a micrometer slide, the area of each field was calculated, and this area was multiplied by the total number of fields analyzed, in order to obtain the total area analyzed. With the total number of mast cells and the total area analyzed, the density of mast cells was calculated, expressed in number of mast cells per µm 2 .

Assessment of the pathological processes

The evaluation of the general pathological processes was done with the slides stained by hematoxylin and eosin. The following pathological processes were assessed as being present or absent: ganglionitis, myositis, congestion, hemorrhage, degeneration, and necrosis, with a score of zero and one, where zero corresponded to absent, and one to present.

The histochemical and immunohistochemical analyses were conducted by a single blinded examiner.

Statistical analysis

The statistical analysis was done by means of the GraphPad Prism 5 (GraphPad, San Diego, California, USA) software. Kolmogorov-Smirnov test was used to evaluate normality. In cases with normal distribution, for comparison among the three groups, the variance analysis test (ANOVA) was used, and in cases of non-normal distribution, Kruskal-Wallis test was employed. For comparison among chagasic (CIM+CML) and non-chagasic (NC) patients with normal distribution, Student’s t test was used, and for non-normal distribution, the Mann-Whitney test. To compare between sexes, the χ 2 test was employed. For correlations, Spearman’s correlation test was used. The adopted level of significance was 5% (α<0.05).

RESULTS

When evaluating individuals from the three groups, there was no significant difference as to age and sex, demonstrating a homogeneous distribution among the groups ( Table 1 ).

Table 1

Distribution of age and sex of the individuals in the groups chagasic patients with mucosal lesions, chagasic patients with intact mucosa, and non-chagasic individuals

	CML	CIM	NC
	(n=13)	(n=12)	(n=10)
Age*	67 (85-44)	66 (82-54)	69 (80-56)
Sex (male: female) #	4:9	4:8	6:4

* Variance analysis test; F=0.8458; p>0.050; # test χ 2 =2,350.2; p=0.309.

CML: Chagasic patient with mucosal lesion; CIM: Chagasic patient with intact mucosa; NC: Non-chagasic individuals with no mucosal lesion.

The CML Group presented with a significantly higher frequency of myositis (p=0.0250) and of ganglionitis (p=0.0390) when compared to the others. The chagasic individuals (CML + CIM) presented with a significantly higher frequency of myositis (p=0.0216) and of ganglionitis (p=0.0140) when compared to those of the NC Group ( Figure 1 and Table 2 ).

Figure 1

Ganglionitis, myositis, Gal-3 expression, and fibrosis in the muscularis propria of the colon of patients in the groups of chagasic patients with mucosal lesions, chagasic patients with intact mucosa, and non-chagasic. A) Ganglionitis in the group of chagasic patients with mucosal lesion (CML); B) Ganglionitis in the group of chagasic patients with intact mucosa (CIM); C) Absence of ganglionitis in the group of chagasic patients non-chagasic; D) Myositis in the group of chagasic patients with mucosal lesions (hematoxylin and eosin, 400x); E) Myositis in the group of chagasic patients with intact mucosa (hematoxylin and eosin, 400x); F) Absence of myositis in the group of chagasic patients non-chagasic (hematoxyllin and eosin, 400x); G) Expression of Gal-3 in the group of chagasic patients with mucosal lesions (immunohistochemistry, 400x); H) Expression of ganglionitis 3 in the group of chagasic patients with mucosal lesions (immunohistochemistry, 400x); I) Expression of ganglionitis in the group non-chagasic (immunohistochemistry, 400x); J) Fibrosis in the group of chagasic patients with mucosal lesion (picrosirius, 1600x); K) Fibrosis in the group of chagasic patients with intact mucosa (picrosirius, 1600x); L) Fibrosis in the group non-chagasic (picrosirius, 1600x); M) Fibrosis in the group of chagasic patients with mucosal lesion (polarized picrosirius image, 1600x); N) Fibrosis in the group of chagasic patients with intact mucosa (picrosirius, polarized image, 1600x); O) Discreet fibrosis in the group non-chagasic (picrosirius, polarized image, 1600x)

Table 2

Distribution of the general pathological processes in the groups of chagasic patients with mucosal lesions, chagasic patients with intact mucosa, and non-chagasic individuals

Pathological process	CML	CIM	NC
	n=13 (100%)	n=12 (100%)	n=10 (100%)
Congestion ≠	6 (46.15)	10 (83.33)	6 (60)
Hemorrhage #	0 (0)	2 (16.67)	1 (10)
Degeneration †	3 (23.08)	4 (33.33)	2 (20)
Necrosis ‡	0 (0)	0 (0)	1 (10)
Myositis* £	10 (76.92)	6 (50)	2 (20)
Ganglionitis* §	6 (46.15)	5 (41.67)	0 (0)

* indicates statistical difference; ≠ χ 2 test=3,744.2, p=0.153; # Fisher’s exact test (CML + CIM versus NC); p=1; † χ 2 test=0.582; p=0.747; ‡ Fisher’s exact test (CML + CIM versus NC), p=1; £ χ 2 test=7,347.2, p=0.025; § χ 2 test=6,475.2, p=0.039.

CML: chagasic patients with mucosal lesion; CIM: chagasic patients with intact mucosa; NC: non-chagasic individuals with no mucosal lesion.

The density of immunostained cells by anti-Gal-3 was significantly greater in the chagasic patients (CML + CIM) when compared to the NC Group (p=0.0032; data not shown) and significantly greater in the CIM Group when compared to the NC Group (p=0.0050) ( Figures 1 and 2 ).

Figure 2

Density of cells immunostained with anti-galectin-3 among the groups of chagasic patients with mucosal lesions, chagasic patients with intact mucosa, and non-chagasic individuals

* Statistical difference according to the Kruskal-Wallis test, K=10.58; p=0.0050. CML: chagasic patients with mucosal lesion; CIM: chagasic patients with intact mucosa; NC: non-chagasic individuals with no mucosal lesions.

As to the density of mast cells, there was no significant difference among the three groups (p=0.5883) ( Figure 3 ).

Figure 3

Density of mast cells among the groups of chagasic patients with mucosal lesions, chagasic patients with intact mucosa, and non-chagasic individuals

Kruskal-Wallis test, K=1.061; p=0.5883.

CML: chagasic patients with mucosal lesion; CIM: chagasic patients with intact mucosa; NC: non-chagasic individuals with no mucosal lesions.

The chagasics patients (CML + CIM) presented percentage of collagen significantly greater than the patients in the NC Group (p=0.0014; data not shown). The percentage of collagen was significantly greater in the CIM and CML Groups when compared to the NC Group (p=0.0002) with a predominance of type I collagen, typical of a chronic inflammatory process, seen in reddish color under polarized light ( Figures 1 and 4 ).

Figure 4

Percentage of collagen among the groups of chagasic patients with mucosal lesions, chagasic patients with intact mucosa, and non-chagasic individuals

* Statistical difference according to the Kruskal-Wallis test, K=17.09; p=0.0002.

CML: chagasic patients with mucosal lesion; CIM: chagasic patients with intact mucosa; NC: non-chagasic individuals with no mucosal lesions.

Regardless of the integrity of the mucosa, chagasic patients presented with a greater density of immunostained cells by anti-Gal-3, and a greater percentage of collagen when compared to non-chagasic individuals.

DISCUSSION

Although the biological role of Gal-3 is not yet totally known, we do know that it is associated with adhesion, cell proliferation, and apoptosis. Additionally, it participates in pathological processes, such as cell hypertrophy, inflammation, and neoplastic transformation. ( In Chagas disease, Gal-3 increases the adherence of T. cruzi to the extracellular matrix, allowing the parasites to accumulate in these locations before invading host cells. (

Gal-3 also presents with pro-inflammatory action, even when participating in the fixation of T. cruzi to tissues, and is increased in the hearts of mice chronically infected by the parasite. ( As in the present study, chagasic patients presented with a significantly greater density of cells immunostained by anti-Gal-3 when compared to non-chagasic individuals. We suggest that this increase is a consequence of the inflammatory condition caused by the parasite. This finding corroborates a previous study carried out by our team, which demonstrated a greater density of Gal-3 in the megacolon of chagasic patients when compared to non-chagasic individuals, but without taking into consideration the presence of mucosal lesions. ( Since the CIM Group patients showed a significantly greater Gal-3 density when compared to the NC Group, we reinforced the hypothesis that this galectin would be increased due to the chagasic infection, and not because of possible mucosal lesions, which could affect the muscularis propria of the colon with resulting inflammation.

The most frequent modifications in the chagasic megacolon are myositis, ganglionitis, periganglionitis, neuritis, perineuritis, denervation, and degenerative phenomena of the neurons, ( which corroborates the findings of the present study, since chagasic patients (CML + CIM) have a significantly greater presence of ganglionitis and myositis, when compared to the patients from the NC Group. When the comparison was made among the three groups, the CML Group had a significantly greater presence of ganglionitis and myositis, when compared to the other Groups. In this way, the inflammatory process in the ganglia and in the intestinal musculature of the CML Group should also occur by the propagation of the mucosal inflammatory process, and not only by the infection with T. cruzi in the intestinal muscles. Additionally, since the chagasic patients presented with a greater density of cells immunostained for Gal-3, we believe that this galectin presents pro-inflammatory action and therefore could be contributing towards the condition of myositis and ganglionitis. The present study was the first to compare the frequency of myositis and of ganglionitis among chagasic patients with mucosal lesions and intact mucosa seen in colonoscopy.

Gal-3 is also associated with fibrosis, participating in the activation of myofibroblasts. It has already been shown that the fibrotic activity of the tissue growth factor (TGF-β) only occurs in the presence of Gal-3, ( and the absence of Gal-3 is related to the interruption of the fibrogenic process. ( Additionally, this galectin provokes an increase in number and degranulation of mast cells. ( Mast cells release tryptase and thrombin, which increase the differentiation of human fibrocytes that, in turn, lead to the formation of collagen fibers in damaged tissues. ( In the present study, chagasic patients (CML+CIM), who also presented with a higher density of Gal-3, showed a percentage of collagen significantly greater than the NC Group, which corroborates the literature, since it has already been demonstrated in mice that T. cruzi can be the factor direct or indirectly responsible for molecular modification in different tissues and organs, enabling the induction of cell lesions, inflammatory response, and fibrosis mediated by Gal-3. ( Nonetheless, our study was the first to associate Gal-3 with fibrosis in Chagas disease in humans.

When individually analyzing the groups, the percentage of collagen was significantly greater in the CIM and CML Groups, when compared to the NC Group, with a predominance of collagen type I, typical of a chronic inflammatory process, seen as redish on polarized light. Although we found no studies evaluating the percentage of collagen comparing areas with or without intestinal mucosa lesion, we know that in Chagas disease, there is a greater percentage of collagen in the affected organs. ( Additionally, during inflammation, there is release of substances that present with lytic action, such as metaloproteinases-2, proteolytic enzymes that are involved in the lysis of collagen, ( which perhaps justifies the fact that CML Group presented with a relatively smaller percentage of collagen than CIM Group, probably as a result of the inflammatory response in these sites.

It is known that during the chronic phase of Chagas disease, there is an increase in the number of mast cells in various locations. ( Studies carried out in bone marrow of mice demonstrated that Gal-3 is related to increased number and degranulation ( of these cells. Therefore, we raised the hypothesis that chagasic patients would present with a higher density of mast cells, since they already presented with a higher density of cells immunostained by Gal-3. Nevertheless, in the present study, there was no statistical difference relative to the density of mast cells among the groups evaluated. In this way, a large part of the mast cells would have undergone degranulation, impeding their identification.

In addition to being involved in the inflammatory process in Chagas disease, promoting the fixation of the parasite in the tissues, degranulation of mast cells, and fibrosis, Gal-3 is also associated with neoplasms in several sites, since it is associated with increased invasive capacity, decrease in apoptosis, angiogenesis, and tumor growth. ( In colorectal cancers, the large expression of Gal-3 promotes the beginning and progression of the tumors, and is associated with metastasis and with a poor prognosis. ( Also, patients with increased expression of Gal-3 die with greater frequency or have a greater tendency to present with relapses. On the other hand, the risk of death is reduced in patients with a low expression or absence of Gal-3. ( Therefore, as we found a greater density of Gal-3 in CIM group when compared to NC Group, we suggested that chagasic patients, even without presenting clinical lesion on colonoscopy, should be periodically accompanied in order to prevent the development of colon cancer, as they showed more Gal-3 in these locations.

CONCLUSION

Chagasic patients with intact mucosa on colonoscopy presented with overexpression of Gal-3 and a greater percentage of collagen in the colon muscles, when compared to chagasic patients with mucosal lesions, and to non-chagasic individuals. The greater density of cells immunostained by anti-galectin-3 in patients with intact mucosa suggests the need for clinical follow-up of these patients, since this protein is associated with neoplastic transformation and progression. Nevertheless, new studies should be done to understand the mechanism of action of Gal-3 in colorectal cancers associated with Chagas disease, in order to suggest indications and frequency of colonoscopies in these patients.

INTRODUÇÃO

A doença de Chagas, descrita por Carlos Chagas, em 1909, é uma zoonose potencialmente letal,( que afeta milhões de pessoas na América Latina.( A Organização Mundial da Saúde (OMS) estima em aproximadamente 6 a 7 milhões o número de pessoas infectadas em todo o mundo − a maioria na América Latina. No Brasil, o número de pessoas infectadas é em torno de 1.156.821, o qual é muito expressivo no contexto sanitário e social do continente, requerendo prioridade e atenção por parte dos países.( Cerca de 20 a 30% dos indivíduos infectados desenvolvem cardiomiopatia e/ou síndromes digestivas, levando à incapacidade ou à morte, com implicações de ordem social e econômica.( Na forma digestiva da doença de Chagas, existe destruição de gânglios intramurais e desnervação parassimpática em todo o trato digestório, afetando especialmente o esôfago e o retossigmoide.(

A associação entre a forma digestiva da doença de Chagas e neoplasias malignas varia de 3,4 a 9,2%. Na doença de Chagas, as neoplasias podem surgir devido à dilatação do órgão e à consequente estase alimentar, desencadeando contato prolongado entre os agentes cancerígenos e a mucosa intestinal.( Dessa maneira, as alterações que ocorrem na infecção crônica por Trypanossoma cruzi (T. cruzi), em especial a denervação mioentérica, responsável pelas formas digestivas da doença, guardam estreita relação com a etiopatogenia da carcinogênese colorretal.( De acordo com a última estimativa mundial, o câncer de cólon e reto configura-se como o terceiro tipo mais comum entre os homens, com 17.380 casos novos, e o segundo tipo de câncer mais comum nas mulheres, sendo 18.980 casos novos para o ano de 2018.(

Várias moléculas participam do quadro inflamatório na doença de Chagas, dentre elas a galectina-3 (Gal-3).( Já foi demonstrado que T. cruzi utiliza a Gal-3 para interagir com a laminina, principal constituinte das membranas basais, promovendo a fixação e a entrada do parasita.( Por outro lado, a menor expressão de Gal-3 favorece a multiplicação dos amastigotas, o que sugere que essa galectina desempenhe controle no decorrer da infecção chagásica.( Além de controlar multiplicação dos amastigostas, sabe-se que a Gal-3 é importante na fibrogênese,( encontrando-se aumentada em miofibroblastos e monócitos ativados, além de ser importante para ativação de mastócitos.( Os mastócitos liberam triptase e trombina, que aumentam a diferenciação de fibrócitos humanos, levando à formação de fibras colágenas em tecidos danificados.(

Embora a Gal-3 pareça ser importante para o controle de T. cruzi ,( essa galectina foi associada com a malignização de algumas lesões, sendo sugerido, inclusive, que a avaliação dessa galectina poderia funcionar como marcador para lesões tumorais.( No entanto, o papel da Gal-3 nas neoplasias ainda não é bem compreendido. Geralmente, está relacionada com adesão célula-célula e adesão célula-matriz, polaridade celular, motilidade, ativação, diferenciação, transformação, sinalização, regulação da imunidade adaptativa/inata e angiogênese.(

Em cânceres colorretais, já foi demonstrado que a grande expressão de Gal-3 promove o início e a progressão dos tumores, estando associada com metástase e com mau prognóstico.( Pacientes com aumento na expressão de Gal-3 vão a óbito com mais frequência ou possuem maior tendência de recidivas. No entanto o risco de morte é reduzido em pacientes com ausência ou baixa expressão de Gal-3.(

No presente estudo, levantamos a hipótese de que os pacientes com megacólon chagásico apresentam maior frequência de processos patológicos, como miosite e ganglionite; maior percentagem de colágeno; e maior densidade de mastócitos na camada muscular do cólon. Além disso, acreditamos que os pacientes chagásicos apresentam maior expressão de Gal-3, principalmente em áreas com lesão de mucosa visível à colonoscopia. A grande expressão de Gal-3 nessas lesões indicaria maior probabilidade de transformação maligna e de metástase de lesões cancerígenas. Assim, a avaliação de Gal-3 poderia contribuir como um fator adicional para determinar o potencial de malignidade das lesões encontradas nos megacólons chagásicos.

OBJETIVO

Avaliar a frequência de processos patológicos, a percentagem de colágeno, a densidade de mastócitos e a densidade de células imunomarcadas por anti-Gal-3 na musculatura intestinal de pacientes biopsiados com megacólon chagásico que apresentavam mucosa íntegra ou lesada à colonoscopia.

MÉTODOS

Seleção dos pacientes

Foram selecionados 35 fragmentos de cólon provenientes de biópsias de 35 pacientes com idade entre 44 a 85 anos. Os pacientes foram divididos em três grupos, de acordo com a descrição presente nos laudos: chagásicos com lesão de mucosa (CLM) (n=13), chagásicos com mucosa íntegra (CMI) (n=12) e não chagásicos sem lesões de mucosa (NC) (n=10). Os indivíduos foram homogeneizados de acordo com idade e sexo.

Os critérios de inclusão foram: (1) para o Grupo CLM: pacientes chagásicos, apresentando megacólon com a mucosa intestinal ulcerada e/ou com hipotrofia de mucosa; (2) para o Grupo CMI: pacientes chagásicos, apresentando megacólon com mucosa intestinal íntegra; (3) para o Grupo NC: pacientes com infarto intestinal, não chagásicos e que não apresentavam qualquer lesão inflamatória de mucosa ou na musculatura intestinal. Para este grupo, os fragmentos foram retirados na região próxima ao infarto.

Foram excluídos do estudo os pacientes com megacólon de outras etiologias; pacientes com idade inferior a 18 anos; chagásicos sem megacólon e pacientes que apresentavam lesões de mucosa intestinal sem apresentar megacólon chagásico.

O presente projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal do Triângulo Mineiro (UFTM), sob o número CAAE: 22725013.4.0000.5154 e parecer 735.931. Após aprovação, foi realizado estudo retrospectivo longitudinal com a análise de protocolos de biópsias completas realizadas com indicação clínica em um laboratório particular da cidade de Uberaba (MG), no período entre 1997 a 2015.

Processamento histológico

Os fragmentos biopsiados da camada muscular própria do colón foram incluídos em parafina e cortados em micrótomo, obtendo-se cortes de 5µm de espessura. Esses cortes foram colocados sobre lâminas de vidro e corados pelas seguintes colorações: hematoxilina e eosina, para avaliação de processos patológicos gerais; picrosírius, para avaliação do colágeno; azul de toluidina, para avaliação dos mastócitos. O outro corte foi colocado em lâmina silanizada para o processamento imunohistoquímico para Gal-3.

Processamento e avaliação imunohistoquímica para Galectina-3

Para o processamento da imunohistoquímica para Gal-3, os cortes foram desparafinados, reidratados e lavados com água ultrapura por 5 minutos à temperatura ambiente. Posteriormente, foi realizada a recuperação antigênica ao calor úmido, com ácido cítrico 0,01M e pH 6, durante 30 minutos. Em seguida, os cortes foram incubados com tampão fosfato-salino/albumina de soro bovino (PBS/BSA) 2%, durante 30 minutos, para bloqueio das ligações inespecíficas.

Os anticorpos anti-Gal-3 foram diluídos em PBS/BSA 2% na concentração de 1:75 (R&D, Minnesota, EUA). Em seguida, os cortes foram incubados por 18 horas a 4°C com anticorpo primário diluído, sendo posteriormente lavados duas vezes com PBS e Tween 20 a 0,05%. Os cortes foram, então, tratados com metanol e peróxido de hidrogênio (H2O2) a 3% durante 15 minutos para bloqueio da peroxidase endógena dos tecidos. Para a detecção do anticorpo, a técnica utilizada foi a de avidina-biotina conjugada com peroxidase (ABC) utilizando o kit lsab-plus (DAKO, Carpinteria, EUA). O complexo foi incubado por 30 minutos à temperatura ambiente do laboratório (22°C a 25°C), e lavado com PBS da mesma maneira que anteriormente.

A revelação foi realizada com diaminobenzidina (DAB) (0,5mg/mL) e H2O20,05% à temperatura ambiente, ao abrigo da luz. Logo após, os cortes foram lavados em água destilada, contracorados com hematoxilina de Harris e montados com Entellan.

As lâminas, nas quais foi realizada a técnica de imunohistoquímica para Gal-3, foram analisadas sob microscopia de luz comum, na objetiva de 63x, utilizando o microscópio Eclipse (Nikon, Berlim, Alemanha). A contagem de células imunomarcadas por Gal-3 foi realizada em todos os campos da musculatura intestinal. Com o auxílio de lâmina micrometrada, foi calculada a área do campo na objetiva de 63x. Em seguida, essa área (0,14µm2) foi multiplicada pelo número total de campos analisados para obter a área total analisada. Com o número total de células imunomarcadas e a área total analisada, foi calculada a densidade de células imunomarcadas, sendo expressa em número de células por µm2.

Determinação da percentagem de colágeno

Para a avaliação da determinação da percentagem de colágeno na musculatura intestinal, foram utilizadas lâminas coradas pelo picrosírius. A coloração de picrosírius permite visualizar os colágenos tipo I e tipo III, permitindo análise qualitativa das fibras colágenas do tecido conjuntivo, por meio das diferenças de cores, intensidade e birrefringência dos tecidos corados, distinguindo principalmente as fibras tipos I e III. As fibras tipo I se apresentam grossas, altamente birrefringentes e na cor vermelha, enquanto que as fibras tipo III se apresentam em feixes finos, com fraca birrefringência e na cor amarelo-esverdeado. A análise do colágeno foi realizada em todos os campos onde foi possível observar musculatura. As imagens foram capturas utilizando um microscópico de luz comum Axio 4.1 (ZEISS, Berlim, Alemanha), uma câmera capturadora de imagem Axiocam (ZEISS, Berlim, Alemanha), um computador e o programa Axiovision 4.8 (ZEISS, Berlim, Alemanha). As imagens vistas no microscópio foram transmitidas ao monitor do computador. Para esta análise, foram utilizadas a objetiva de 40x e um filtro polarizador. Na imagem polarizada, o colágeno apresentou birrefringência com coloração amarelada, avermelhada ou esverdeada, sendo marcadas pelo examinador com auxílio de um cursor. Dessa forma, o programa determinava automaticamente a percentagem de colágeno por campo.

Determinação da densidade de mastócitos

Para a avaliação da densidade de mastócitos, foram utilizadas lâminas coradas pela técnica de azul de toluidina. Os cortes foram desparafinados, lavados em água destilada, corados com Orange G e rapidamente imersos em álcool a 60%. Em seguida, as lâminas foram rapidamente imersas em azul de toluidina e rapidamente lavadas em água corrente. As imagens foram analisadas em um microscópico de luz comum (Nikon, Berlim, Alemanha), com objetiva de 40x.

A contagem de mastócitos foi realizada em todos os campos da lâmina. Com o auxílio de uma lâmina micrometrada, foi calculada a área de cada campo, sendo tal área multiplicada pelo número total de campos analisados, a fim de se obter a área total analisada. Com o número total de mastócitos e a área total analisada, foi calculada a densidade de mastócitos, expressa em número de mastócitos por µm2.

Avaliação dos processos patológicos

A avaliação dos processos patológicos gerais foi realizada nas lâminas coradas pela coloração de hematoxilina e eosina. Foram avaliados como presente ou ausente os seguintes processo patológicos: ganglionite, miosite, congestão, hemorragia, degeneração e necrose, sendo estabelecido escore de zero e 1, onde zero corresponde a ausente e 1 a presente.

As análises histoquímica e imunohistoquímica foram realizadas por um único examinador calibrado e às cegas.

Análise estatística

A análise estatística foi realizada por meio dos softwares GraphPad Prism 5 (GraphPad, San Diego, Califórnia, USA). O teste de Kolmogorov-Smirnov foi utilizado para a avaliação da normalidade. Nos casos de distribuição normal para comparação entre os três grupos, foi utilizado o teste de análise de variância (ANOVA) e, nos casos de distribuição não normal, foi empregado o teste Kruskal-Wallis. Para comparação entre chagásicos (CMI+CLM) e não chagásicos (NC) com distribuição normal, utilizou-se o teste t de Student e, para distribuição não normal, utilizou-se o teste de Mann-Whitney. Para comparação entre sexos, utilizou-se o teste χ2. Para as correlações, utilizou-se o teste de correlação de Spearman. O nível de significância assumido foi de 5% (α<0,05).

RESULTADOS

Ao avaliar os indivíduos dos três grupos, não houve diferença significativa em relação à idade e ao sexo, demonstrando distribuição homogênea entre os grupos ( Tabela 1 ).

Tabela 1

Distribuição de idade e gênero dos indivíduos dos grupos chagásicos com lesão de mucosa, chagásicos com mucosa íntegra e não chagásicos

	CLM	CMI	NC
	(n=13)	(n=12)	(n=10)
Idade (Mediana) (máx-min)*	67 (85-44)	66 (82-54)	69 (80-56)
Gênero (M: F)#	4:9	4:8	6:4

*teste ANOVA, F=0,8458; p>0,050;#teste χ2=2350,2; p=0,309.

CLM: chagásico com lesão de mucosa; CMI: chagásico com mucosa íntegra; NC: não chagásico sem lesão de mucosa.

O Grupo CLM apresentou frequência significativamente maior de miosite (p=0,0250) e de ganglionite (p=0,0390) quando comparado aos demais. Os indivíduos chagásicos (CLM + CMI) apresentavam frequência significativamente maior de miosite (p=0,0216) e de ganglionite (p=0,0140) quando comparados ao Grupo NC ( Figura 1 e Tabela 2 ).

Figura 1

Ganglionite, miosite, expressão de Gal-3 e fibrose na camada muscular própria do cólon de pacientes dos grupos chagásicos com lesão de mucosa, chagásicos com muscosa íntegra e não chagásicos. A) Ganglionite no grupo chagásicos com mucosa lesada (CLM); B) Ganglionite no grupo chagásico com mucosa íntegra (CMI); C) Ausência de ganglionite no grupo não-chagásico (NC); D) Miosite no grupo chagásico com lesão de mucosa (CLM) (HE, 400x); E) Miosite no grupo chagásico com mucosa íntegra (CMI) (HE, 400x); F) Ausência de miosite no grupo chagásico com mucosa íntegra (CMI) (HE, 400x); G) Expressão de Gal-3 no grupo chagásico com lesão de mucosa (CLM) (Imunohistoquímica, 400x); H) Expressão de Gal-3 no grupo chagásico com mucosa íntegra (CMI) (Imunohistoquímica, 400x); I) Expressão de Gal-3 no grupo não chagásico (NC) (Imunohistoquímica, 400x); J) Fibrose no grupo chagásico com mucosa lesada (CLM) (Picrosírius, 1600x); K) Fibrose no grupo chagásico com mucosa íntegra (CMI) (Picrosírius, 1600x); L) Fibrose no grupo não chagásico (NC) (Picrosírius, 1600x); M) Fibrose no grupo chagásico com lesão de mucosa (CLM) (Picrosírius; imagem polarizada, 1600x); N) Fibrose no grupo chagásico com mucosa íntegra (CMI) (Picrosírius; imagem polarizada, 1600x); O) Fibrose discreta no grupo não chagásico (NC) (Picrosírius; imagem polarizada, 1600x)

Tabela 2

Distribuição dos processos patológicos gerais nos grupos chagásicos com mucosa lesada, chagásicos com mucosa íntegra e não chagásicos

Processos patólogicos	CLM	CMI	NC
	n=13 (100%)	n=12 (100%)	n=10 (100%)
Congestão≠	6 (46,15%)	10 (83,33%)	6 (60%)
Hemorragia#	0 (0%)	2 (16,67%)	1 (10%)
Degeneração†	3 (23,08%)	4 (33,33%)	2 (20%)
Necrose‡	0 (0%)	0 (0%)	1 (10%)
Miosite*£	10 (76,92%)	6 (50%)	2 (20%)
Ganglionite*§	6 (46,15%)	5 (41,67%)	0 (0%)

* indica diferença estatística;≠teste χ2=3.744,2; p=0,153;#teste exato de Fisher (CLM+CMI versus NC); p=1;†teste χ2=0.582; p=0,747;‡teste exato de Fisher (CLM+CMI versus NC); p=1;£teste χ2=7.347,2; p=0,025;§teste χ2=6.475,2; p=0,039.

CLM: chagásico com lesão de mucosa; CMI: chagásico com mucosa íntegra; NC: não chagásico sem lesão de mucosa.

A densidade de células imunomarcadas por anti-Gal-3 foi significativamente maior nos pacientes chagásicos (CLM + CMI) quando comparados ao Grupo NC (p=0,0032; dados não demonstrados) e significativamente maior no Grupo CMI quando comparado ao Grupo NC (p=0,0050) ( Figuras 1 e 2 ).

Figura 2

Densidade de células imunomarcadas por anti-galectina-3 entre os grupos chagásicos com lesão de mucosa, chagásicos com mucosa íntegra e não chagásicos

* Diferença estatística de acordo com o teste Kruskal-Wallis, K=10,58; p=0,0050.

CLM: chagásico com lesão de mucosa; CMI: chagásico com mucosa íntegra; NC: não chagásico sem lesão de mucosa.

Com relação à densidade de mastócitos, não houve diferença significativa entre os três grupos (p=0,5883) ( Figura 3 ).

Figura 3

Densidade de mastócitos entre os grupos chagásicos com lesão de mucosa, chagásicos com mucosa íntegra e não chagásicos

Teste de Kruskal-Wallis, K =1,061; p=0,5883.

CLM: chagásico com lesão de mucosa; CMI: chagásico com mucosa íntegra; NC: não chagásico sem lesão de mucosa.

Os pacientes chagásicos (CLM + CMI) apresentavam percentagem de colágeno significativamente maior que os pacientes do Grupo NC (p=0,0014; dados não demonstrados). A percentagem de colágeno foi significativamente maior nos Grupos CMI e CLM quando comparados ao Grupo NC (p=0,0002) com predomínio de colágeno tipo I, típico de processo inflamatório crônico, visto na cor avermelhada na luz polarizada ( Figuras 1 e 4 ).

Figura 4

Percentagem de colágeno entre os grupos chagásicos com lesão de mucosa, chagásicos com mucosa íntegra e não chagásicos

* Diferença estatística de acordo com o teste Kruskal-Wallis, K =17,09; p=0,0002.

CLM: chagásico com lesão de mucosa; CMI: chagásico com mucosa íntegra; NC: não chagásico sem lesão de mucosa.

Independentemente da integridade da mucosa, os pacientes chagásicos apresentaram maior densidade de células imunomarcadas por anti-Gal-3 e maior percentagem de colágeno quando comparados aos não chagásicos.

DISCUSSÃO

Embora o papel biológico da Gal-3 não seja totalmente conhecido, sabe-se que ela está associada com adesão, proliferação celular e apoptose. Além disso, participa de processos patológicos, como hipertrofia celular, inflamação e transformação neoplásica.( Na doença de Chagas, a Gal-3 aumenta a aderência de T. cruzi à matriz extracelular, permitindo que os parasitas acumulem-se nesses locais antes de invadir as células hospedeiras.(

A Gal-3 apresenta também ação pró-inflamatória, mesmo participando da fixação de T. cruzi aos tecidos, estando aumentada em corações de camundongos cronicamente infectados pelo parasita.( Como no presente estudo, os pacientes chagásicos apresentavam densidade significativamente maior de células imunomarcadas por anti-Gal-3 quando comparados aos não chagásicos. Sugerimos que esse aumento seja em decorrência do quadro inflamatório ocasionado pelo parasita. Esse achado corrobora estudo anterior realizado pela nossa equipe, que demonstrou maior densidade de Gal-3 no megacólon dos chagásicos comparados aos não chagásicos, mas sem considerar a presença de lesões de mucosa.( Como os pacientes do Grupo CMI apresentaram densidade significativamente maior de Ga-3 quando comparados ao Grupo NC, reforçamos a hipótese de que essa galectina estaria aumentada devido à infecção chagásica, e não em função de possíveis lesões de mucosa, que poderiam afetar a muscular própria do cólon com consequente inflamação.

As alterações mais frequentes no megacólon chagásico são miosite, ganglionite, periganglionite, neurite, perineurite, desnervação e fenômenos degenerativos dos neurônios,( o que corrobora os achados do presente estudo, pois os chagásicos (CLM + CMI) possuíam presença significativamente maior de ganglionite e miosite, quando comparados aos pacientes do Grupo NC. Quando se realizou a comparação entre os três grupos, o Grupo CLM possuía presença significativamente maior de ganglionite e de miosite, quando comparado aos demais grupos. Dessa forma, o processo inflamatório nos gânglios e na musculatura intestinal do Grupo CLM deve ocorrer também pela propagação do processo inflamatório da mucosa, e não apenas pela infecção por T. cruzi na musculatura intestinal. Além disso, como os chagásicos apresentavam maior densidade de células imunomarcadas para Gal-3, acreditamos que essa galectina, por apresentar ação pró-inflamatória, poderia estar contribuindo para o quadro de miosite e de ganglionite. O presente estudo foi o primeiro a comparar a frequência de miosite e de ganglionite entre pacientes chagásicos com mucosa lesada e mucosa íntegra à colonoscopia.

A Gal-3 está associada também com fibrose, participando da ativação de miofibroblastos. Já foi demonstrado que a atividade fibrótica do fator de transformação do crescimento (TGF-β) só ocorre na presença de Gal-3( e a ausência de Gal-3 está relacionada com a interrupção do processo fibrogênico.( Além disso, essa galectina provoca aumento do número e degranulação de mastócitos.( Os mastócitos liberam triptase e trombinha, que aumentam a diferenciação de fibrócitos humanos, que, por sua vez, levam à formação de fibras colágenas em tecidos danificados.( No presente estudo, os pacientes chagásicos (CLM+CMI), que também apresentavam maior densidade de Gal-3, apresentavam percentagem de colágeno significativamente maior que o Grupo NC, o que corrobora com a literatura, pois já foi demonstrado em camundongos que T. cruzi pode ser o responsável direto ou indireto por alterações moleculares em diferentes tecidos e órgãos, podendo induzir lesões celulares, resposta inflamatória e fibrose mediada pela Gal-3.( No entanto, nosso estudo foi o primeiro a associar Gal-3 com fibrose em doença de Chagas em humanos.

Ao analisar individualmente os grupos, a percentagem de colágeno foi significativamente maior nos grupos CMI e CLM, quando comparados ao NC, com predomínio de colágeno tipo I, típico de processo inflamatório crônico, visto na cor avermelhada na luz polarizada. Embora não encontramos estudos que avaliaram a percentagem de colágeno comparando áreas com ou sem lesão de mucosa intestinal, sabe-se que, na doença de Chagas, existe maior percentagem de colágeno nos órgãos afetados.( Além disso, durante inflamação, existe liberação de substâncias que apresentam ação lítica, como metaloproteinases-2, enzimas proteolíticas que estão envolvidas na lise do colágeno,( o que talvez justifique o fato de o Grupo CLM ter apresentado percentagem relativamente menor de colágeno que o Grupo CMI, provavelmente em decorrência da resposta inflamatória nesses locais.

Sabe-se que, na fase crônica da doença de Chagas ocorre aumento do número de mastócitos em vários locais.( Estudos realizados em medula óssea de camundongos demonstraram que a Gal-3 está relacionada com o aumento do número e degranulação( dessas células. Portanto, levantamos a hipótese de que os chagásicos apresentassem maior densidade de mastócitos, já que apresentavam maior densidade de células imunomarcadas por Gal-3. Entretanto, no presente estudo, não houve diferença estatística em relação à densidade de mastócitos entre os grupos avaliados. Dessa forma, grande parte dos mastócitos teriam sofrido degranulação, impossibilitando que fossem identificados.

Além de estar envolvida no processo inflamatório na doença de Chagas promovendo a fixação do parasita nos tecidos, degranulação de mastócitos e fibrose, a Gal-3 está também associada com neoplasias em vários locais, estando associada com o aumento da capacidade invasiva, a diminuição da apoptose, a angiogênese e o crescimento tumoral.( Em cânceres colorretais, a grande expressão de Gal-3 promove o início e a progressão dos tumores, estando associada com metástase e com mau prognóstico.( Além disso, pacientes com aumento da expresssão de Gal-3 vão a óbito com mais frequência ou possuem maior tendência a apresentar recidivas. Por outro lado, o risco de morte é reduzido em pacientes com baixa expressão ou ausência de Gal-3.( Portanto, como encontramos maior densidade de Gal-3 no Grupo CMI, quando comparado ao Grupo NC, sugerimos que os pacientes chagásicos, mesmo que não apresentem lesão clínica ao exame de colonoscopia, deveriam ser acompanhados periodicamente, no sentido de prevenir o desenvolvimento de neoplasia de cólon, já que apresentam mais Gal-3 nesses locais.

CONCLUSÃO

Pacientes chagásicos com mucosa íntegra à colonoscopia apresentaram superexpressão de Gal-3 e maior percentagem de colágeno na musculatura do cólon, quando comparados aos chagásicos com lesão de mucosa e aos não chagásicos. A maior densidade de células imunomarcadas por anti-galectina-3 nos pacientes com mucosa íntegra sugere a necessidade de acompanhamento clínico desses pacientes, uma vez que essa proteína está associada com transformação e progressão neoplásica. No entanto novos estudos devem ser realizados para compreender o mecanismo de ação da Gal-3 nos cânceres colorretais associados à doença de Chagas, a fim de sugerir as indicações e a periodicidade das colonoscopias nesses pacientes.