[Optimized AAV package and experimental application of recombinant AAV8/hFⅧ for gene therapy on hemophilia A mice].

Objective: To evaluate the effects of adeno-associated virus (AAV) carrying hFⅧ by serotype 8 (AAV8/hFⅧ) on hemophilia A (HA) mice by gene therapy strategy.
Methods: pAAV-CB-EGFP, pH22 (serotype 2) and pfΔ6 (adenovirus helper) were used to package AAV into HEK-293 cells in different conditions (ratios of cells to plasmids). The efficiency of transfection and infection were evaluated using immunofluorescence microscope to seek an optimized package condition. pAAV-TTR-hFⅧ, pH 28 (serotype 8) and pfΔ6 were applied to package AAV8/hFⅧ in HEK-293 cells using the optimized package condition. The purified AAV8/hFⅧ were intravenously injected into HA mice and the effects of gene therapy were estimated.
Results: The efficiency of package was evaluated according to the amount and intensity of enhanced green fluorescent protein (EGFP) under immunofluorescence microscope. Four package conditions including 10 cm-dish to transfect 10 μg plasmids, 20 cm-dish to 20 μg, 30 μg and 40 μg plasmids were employed, and the condition of 20 cm-dish to transfect 20 μg plasmids reached the highest transfection efficiency at 24 h, 48 h and 72 h after transfection. The small scale AAV-EGFP was packaged using the optimized condition and an AAV crude extract was harvested by a freeze-thaw method. HEK-293 and 16095 cells were infected by the AAV crude extract, and the preferential infection efficiency was recognized in 16095 cells under immunofluorescence microscope. Then, AAV8/hFⅧ was packaged and purified based on the optimized transfection condition, and the high purity of AAV8/hFⅧ was detected by Western blot. Fractions of AAV8/hFⅧ at the dose of 8×10(12) vg/kg were injected into HA mice through tail vein, an eye-bleeding was performed at every two weeks, and the activity of FⅧ was measured by aPTT assay. Results showed that the activity of FⅧ maintained at the therapeutic level and lasted up to 12 weeks after injection.
Conclusion: The purified AAV8/hFⅧ based on the optimized package condition could play a role in HA mice gene therapy, and the long-term therapeutic effects of AAV8/hFⅧ were observed in vivo.

血友病A（HA）是一种由凝血因子Ⅷ（FⅧ）基因缺陷导致的出血性疾病，为X染色体连锁的隐性遗传性疾病[1]–[2]。临床上HA的治疗以反复输注浓缩FⅧ或重组FⅧ替代治疗为主，而替代治疗需要长期反复输注，不仅给患者的治疗带来不便，而且还有感染血源性传染病（肝炎、获得性免疫缺陷综合征等）的风险[3]–[5]。基因治疗能够实现1次注射维持较长时间的基因表达[6]，减少注射次数和感染风险。

腺相关病毒（adeno-associated virus, AAV）载体安全性较好，可感染非分裂细胞，根据血清型的不同，AAV可以感染不同靶器官[7]。近年来，国外基因治疗血友病B（HB）[8]–[9]和HA[10]的实验研究主要以AAV介导的FⅨ和FⅧ为主，其安全性和有效性得到了证实。AAV8主要感染肝细胞，而FⅧ主要在肝脏的内皮细胞表达和分泌[11]，因此，本研究我们采用AAV8血清型携带重组人FⅧ（hFⅧ）进行实验。

为了提高AAV8/hFⅧ的包装效率，我们首先应用pAAV-CB-EGFP优化了AAV的包装条件，选择最佳条件包装、纯化获得AAV8/hFⅧ，通过尾静脉注射HA小鼠，检测小鼠血浆hFⅧ活性，为临床应用AAV载体治疗HA提供实验研究数据。

材料与方法

1．实验材料、动物及仪器：质粒pAAV-CB-EGFP，pH22（AAV血清型2）、pfΔ6（腺病毒辅助质粒）、pAAV-TTR-hFⅧ，pH28（AAV血清型8）由美国天普大学肖卫东教授赠予。人胚肾细胞HEK-293细胞和人成纤维细胞16095细胞购自美国ATCC细胞库。DMEM培养基、PBS、胰酶-EDTA购自美国Gibco公司；胎牛血清（FBS）购自澳大利亚Moregate公司；乏FⅧ血浆、活化部分凝血活酶时间（APTT）检测试剂、检测杯、钢珠购自法国Stago公司；DNA抽提试剂盒购自德国Qiagen公司；PAGE凝胶快速制备试剂盒购自美国Epizyme公司；抗-AAV（VP1/VP2/VP3）小鼠单克隆抗体购自美国Research Products公司。

小鼠FⅧ基因第16~19号外显子靶向剔除小鼠（HA小鼠）[12]从上海南方模式动物中心引进，遗传背景为S129，在上海交通大学医学院附属瑞金医院实验动物中心（SPF级饲养环境）饲养和繁殖。取7只6~8周龄小鼠（雌鼠3只，雄鼠4只）进行实验研究。小鼠的使用经上海交通大学医学院附属瑞金医院伦理委员会批准，严格按照相关实验动物管理条例进行。

荧光显微镜购自日本Olympus公司，半自动APTT检测仪购自法国Stago公司，Western blot显影仪ImageQuant LAS-4000购自日本富士胶片株式会社，Western blot基础电泳仪、电泳槽、转膜槽等购自美国Bio-Rad公司，水平摇床购自杭州奥盛仪器有限公司，细胞培养箱购自德国Thermo公司，生物安全柜购自新加坡ESCO公司。

2．AAV2-EGFP病毒包装条件摸索：质粒抽提按照Qiagen质粒抽提试剂盒提供的说明书进行。HEK-293细胞接种于10 cm和20 cm培养皿中培养过夜，待细胞处于对数生长期，融合度达到70%左右时开始进行细胞转染。采用标准的三质粒转染系统进行病毒包装，pH22、pfΔ6及pAAV-CB-EGFP按照1∶1∶1的比例进行转染。对于10 cm培养皿的细胞应用质粒总量10 µg，对于20 cm培养皿的细胞，质粒量分别为20、30和40 µg。应用磷酸钙法进行转染，具体操作如下：以10 cm培养皿转10 µg质粒用3 ml转染体系为例，首先配置CaCl2和质粒的混合液，无菌离心管中依次加入三蒸水1 314 µl、质粒DNA 10 µg、2 mol/L CaCl2 186 µl，混匀后，用移液器小心吸取1.5 ml 2×HBS（50 mmol/L HEPES缓冲液、10 mmol/L KCl、12 mmol/L右旋葡萄糖、280 mmol/L NaCl、1.5 mmol/L Na2HPO4，pH=7.05），逐滴加入到上述离心管中，小心吹泡20 s，然后逐滴均匀加入10 cm培养皿的细胞中。对于20 cm培养皿的细胞转染，相应的扩大转染体系为6、9和12 ml，质粒量分别为20、30和40 µg。转染后的细胞置于37 °C孵箱继续培养8~10 h后，更换新鲜完全培养基继续培养。转染后24、48、72 h于荧光显微镜下观察并拍照。

3．AAV2-EGFP感染HEK-293细胞和16095细胞：收集应用最佳转染条件包装AAV2-EGFP的HEK-293细胞，将细胞用PBS重悬后于干冰/乙醇混合液中放置10 min，然后于37 °C放置10 min，反复冻融3次裂解细胞，18 877×g离心15 min获得病毒粗提液。将HEK-293细胞和16095细胞接种于6孔板中，待细胞处于对数生长期时，每孔加入粗提液50 µl进行感染。于AAV2感染后的24、48、72 h于荧光显微镜下观察并拍照。

4．AAV8/hFⅧ的包装与纯化：应用最佳转染条件将pAAV-TTR-hFⅧ、pH28、pfΔ6按1∶1∶1的比例转染HEK-293细胞，转染72 h后收集细胞，用10 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0重悬细胞，超声裂解细胞后，应用两轮的氯化铯梯度离心法离心后收集AAV8/hFⅧ[13]，经PBS透析后，定量、分装，-80 °C冻存。应用qPCR对病毒滴度进行测定[14]。以SYBR Green为荧光染料，针对TTR序列设计引物，正向引物：5′-TCCGATACTCTAATCTCCC-3′，反向引物：5′-CTGACTCCAAACCTGCT-3′，产物长度103 bp。qPCR在10 µl反应体系中进行，反应条件为：50 °C 2 min，95 °C 10 min，进行40个循环的95 °C 30 s和60 °C 30 s。

5．Western blot检测AAV8/hFⅧ的纯度：取纯化前、后的AAV8/hFⅧ样品进行Western blot电泳，转膜，封闭后加入抗AAV（VP1/VP2/VP3）小鼠单克隆抗体4 °C孵育过夜，1×TBST洗膜3次，每次10 min，加入抗小鼠辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育1 h，1×TBST洗膜3次，每次10 min，进行显影。

6．AAV8/hFⅧ尾静脉注射HA小鼠：注射AAV前1周对小鼠进行眼眶采血，获得注射之前的小鼠血浆，注射病毒前对小鼠进行称重，随机分为对照组（3只，2雄1雌）和AAV8/hFⅧ组（4只，2雄2雌）。将纯化的AAV8/hFⅧ应用生理盐水进行稀释，通过尾静脉将8×1012 vg/kg AAV8/hFⅧ注射至HA小鼠体内，对照组小鼠注射相同体积的生理盐水。每2周进行眼眶采血，0.38%枸橼酸钠抗凝，收集血浆，-80 °C冻存。

7．APTT试验检测FⅧ活性：应用1×assay缓冲液（10 mmol/L HEPES、75 mmol/L NaCl、1% BSA，pH=7.4）10倍稀释小鼠血浆。测量杯中依次加入钢珠、50 µl reagent检测试剂、50 µl乏FⅧ血浆和稀释的50 µl小鼠血浆待测标本，37 °C孵育170 s，加入50 µl CaCl2（25 mmol/L），开始计时，读取并记录钢珠停止振动的时间。应用正常人预混血浆（normal human plasma，NHP）作为标准品，一般NHP为20个正常人预混血浆，起始活性设定为100%。将NHP进行2倍稀释，设置浓度梯度建立标准曲线，根据标准曲线计算待测小鼠血浆的FⅧ活性。测定3只正常小鼠血浆FⅧ活性，取平均值，正常小鼠FⅧ活性的平均值定义为100%，计算待测小鼠血浆FⅧ活性与正常小鼠FⅧ活性的比值，获得待测小鼠血浆FⅧ相对于正常小鼠的相对活性。

8．统计学处理：EGFP表达的荧光强度（包括平均荧光强度和总荧光强度）应用BioFlux200软件（美国Fluxion Biosciences公司产品）获得量化数值，统计数据由3次独立的重复实验获得，采用GraphPad Prism 7.0绘制统计图并进行组间比较，不同转染条件的组间比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1．AAV2-EGFP包装条件的优化：pH22、pfΔ6及pAAV-CB-EGFP质粒按照1∶1∶1的比例进行转染，应用4个转染条件（10 cm培养皿转10 µg质粒，20 cm培养皿转20、30、40 µg质粒）在相同起始密度的HEK-293细胞中转染EGFP，荧光显微镜观察转染24、48和72 h的荧光表达细胞数量和荧光强度（转染效率）的差异，结果如图1所示，20 cm培养皿转20 µg质粒的荧光表达细胞数量最多，荧光强度最强（图1B）；其次是10 cm培养皿转10 µg质粒（图1A），考虑到包装AAV2需要较多的细胞才能获得足够的病毒量，因此，20 cm培养皿转20 µg质粒条件优于10 cm培养皿转10 µg质粒。20 cm培养皿转30 µg质粒（图1C）和20 cm培养皿转40 µg质粒（图1D）可能由于随着质粒量的增加，增加了细胞毒性，活细胞数量减少，其转染效率明显低于20 cm培养皿转20 µg质粒。为了更确切地评价各组的转染效率，我们对EGFP表达的平均荧光强度和总荧光强度进行了量化处理，结果如图1E和图1F所示，20 cm培养皿转20 µg质粒的平均荧光强度略高于其他3组，而总体荧光强度显著高于其他3组（P<0.05），提示20 cm培养皿转20 µg质粒的转染效率最高。综上，20 cm培养皿转20 µg质粒是最佳包装条件。

图1

免疫荧光显微镜观察HEK-293细胞AAV2-EGFP病毒包装效率（×200）（实验重复3次；与其他各组比较，*P<0.05）

质粒为pH22、pfΔ6及pAAV-CB-EGFP按1∶1∶1比例构建。A：10 cm培养皿培养细胞，转染10 µg质粒，转染体系3 ml；B~D：20 cm培养皿培养细胞，分别转染20、30、40 µg质粒，转染体系分别为6、9、12 ml；E：平均荧光强度柱状图；F：总荧光强度柱状图（AU示任意单位）

2．应用最佳条件包装AAV2-EGFP并感染HEK-293细胞和16095细胞：应用20 cm培养皿转20 µg质粒在HEK-293细胞中包装AAV2-EGFP，共转染4个20 cm培养皿。HEK-293细胞在转染24、48和72 h的荧光表达情况如图2所示。收集转染72 h细胞，冻融法裂解细胞获得AAV2粗提液。将对数生长期HEK-293和16095细胞接种于6孔板中，每孔加入AAV2粗提液50 µl进行感染。感染24、48和72 h时分别于荧光显微镜下观察并拍照。结果如图3所示，无论是HEK-293细胞（图3A）还是16095细胞（图3B）在AAV2-EGFP感染48 h的荧光信号最强，分布最广，提示在AAV2感染后的48 h EGFP表达最高，16095细胞的感染效率强于HEK-293细胞。

图2

免疫荧光显微镜观察20 cm培养皿在6 ml体系内转染20 µg质粒（pH22、pfΔ6及pAAV-CB-EGFP按1∶1∶1比例构建）在HEK-293细胞包装腺相关病毒（AAV）病毒效率

图3

免疫荧光显微镜观察应用50 µl AAV2-EGFP粗提液感染HEK-293细胞（A）和16095细胞（B）24、48、72 h的感染效率

AAV：腺相关病毒

3．AAV8/hFⅧ病毒纯度检测及qPCR定量：pAAV-TTR-hFⅧ、pH28、pfΔ6按1∶1∶1转染HEK-293细胞72 h后收集细胞，利用氯化铯梯度离心法纯化获得AAV8/hFⅧ。Western blot检测纯化前后AAV8/hFⅧ衣壳蛋白VP1、VP2和VP3表达（其组成比例大约为1∶1∶10）。结果见图4，纯化前AAV8/hFⅧ除了含有VP1、VP2和VP3以外，还有较多杂带能够被检测到；而纯化后的AAV8/hFⅧ杂带较少，VP1、VP2和VP3的比例接近1∶1∶10。证明纯化获得的AAV8纯度较好。接着，我们应用qPCR对纯化的AAV8/hFⅧ进行定量。以pAAV-TTR-hFⅧ质粒（浓度1.0 µg/µl）稀释（10-3、10-4、10-5、10-6、10-7）作为标准曲线，AAV8/hFⅧ病毒10倍稀释检测。qPCR反应的扩增曲线如图5所示，根据标准曲线计算获得AAV8/hFⅧ的滴度为1.86×1012 vg/ml。

图4

Western blot检测AAV8/hFⅧ病毒纯化前后纯度（衣壳蛋白VP1∶VP2∶VP3的比例约为1∶1∶10，未纯化组可见较多杂带，纯化后病毒较纯）

AAV8/hFⅧ：携带人凝血因子Ⅷ的重组腺相关病毒血清型8；1：5 µl未纯化AAV8/hFⅧ；2：5 µl纯化AAV8/hFⅧ；3：10 µl纯化AAV8/hFⅧ

图5

qPCR检测AAV8/hFⅧ病毒定量

AAV8/hFⅧ：携带人凝血因子Ⅷ的重组腺相关病毒血清型8；A：AAV8/hFⅧ的扩增曲线；B：标准曲线的扩增曲线

4．AAV8/hFⅧ在HA小鼠体内的活性维持：6~8周龄HA小鼠随机分为对照组和AAV8/hFⅧ组，AAV8/hFⅧ注射剂量为8×1012 vg/kg，通过尾静脉注射，对照组注射生理盐水。每2周进行眼眶采血，枸橼酸钠抗凝，收集血浆，APTT试验检测FⅧ在HA小鼠体内的活性。结果如图6所示，注射AAV8/hFⅧ的小鼠可以在长达12周的时间内FⅧ活性维持10%以上，提示通过基因治疗的方法应用AAV8/hFⅧ注射HA小鼠，实现了1次注射维持长期FⅧ表达的目的。与对照组小鼠相比，在整个观察期内，注射AAV8/hFⅧ小鼠FⅧ的活性均显著高于对照组小鼠。

图6

AAV8/hFⅧ-BDD在血友病A小鼠体内的活性测定

讨论

基因治疗有望使HB和HA的治疗得到改善，而病毒载体的制备是基因治疗成功的关键。本研究中，我们应用易于观察结果的EGFP转染，摸索了AAV包装的几个条件，从中找到最佳转染条件为20 cm培养皿转染20 µg质粒（图1），该条件代表了能够与hFⅧ的包装效率和AAV总量相对应的最佳转染条件。应用该条件，小量包装了AAV2-EGFP（图2），获得AAV2粗提液感染HEK-293细胞和16095细胞，免疫荧光显微镜下观察到在AAV2-EGFP感染后的24、48和72 h细胞内有绿色荧光蛋白表达（图3）。证明了应用该条件包装的AAV2-EGFP能够有效感染细胞。在此基础上我们应用该最佳转染条件包装了AAV8/hFⅧ，通过经典的氯化铯梯度离心法获得纯化的病毒，经Western blot检测到病毒纯度较好（图4）。以8×1012 vg/kg的剂量注射HA小鼠，获得了在HA小鼠体内1次注射维持12周有效FⅧ活性的较好效果（图5～图6）。

关于AAV病毒的纯化，目前较常用的方法包括氯化铯梯度离心法[13]、碘克沙醇梯度离心法[15]、基于液相色谱的柱纯化法[16]以及梯度离心和柱纯化结合在一起的方法[17]。无论何种方法，能够有效提高实体病毒的产率和纯度，减少空壳病毒的污染是AAV病毒纯化中的共同挑战。本研究中使用的氯化铯梯度离心法获得病毒纯度和级别用于动物实验是安全的。但是若要应用于HA患者，必须使用符合生产质量管理规范（GMP）要求的纯度和安全性更高的AAV载体。

本研究我们通过摸索AAV的包装条件，获得优化的转染条件，以此方法包装AAV8/hFⅧ，纯化后用于HA小鼠的体内基因治疗研究，发现能够在小鼠体内维持较长时间的FⅧ活性。为AAV包装、纯化及基因治疗HA提供了实验研究数据。