[Prediction of acute graft-versus-host disease after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation by the level of galectin-9 in peripheral blood].

Objective: To evaluate possible effects of Gelctin-9 on acute graft versus host disease (aGVHD) development and clinical outcomes in patients before and afer allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (allo-HSCT) .
Methods: Peripheral blood samples were obtained from 29 patients and 15 healthy volunteers with heparin anticoagulant tubes. Samples were analyzed using ELISA kits to measure the serum concentrations of Galectin-9.
Results: Patients developing aGVHD had significantly lower level of Galectin-9 [ (7.96±1.18) μg/L] before allo-HSCT compared with those not developing aGVHD [ (12.37±0.97) μg/L, P<0.001]. And after allo-HSCT, the consentration of Galectin-9 increased markedly in patients developing aGVHD [ (17.78±1.78) μg/L] compared with those not developing aGVHD [ (9.45±0.80) μg/L, P<0.001]. Patients developing 3-4 grade aGVHD had significantly higher level of Galectin-9 [ (23.25±2.59) μg/L] compared with those developing 1-2 grade aGVHD [ (14.37±1.45) μg/L, P=0.008] and those without aGVHD [ (9.45±0.80) μg/L, P<0.001]. The patients with lower level of Galectin-9 after allo-HSCT (<13.61 μg/L) showed more favorable clinical outcomes compared with those with higher level of Galectin-9 (≥13.61 μg/L) . The 3-year overall survival rates were (100.00±6.05) % and (69.23±12.80) %, respectively (P=0.009) . The cumulative incidence of non-relapse mortality was significantly higher in high Galectin-9 group [ (23.08±11.69) %] in comparison with low Gaelctin-9 group [ (0.00±7.39) %] (P=0.023) . There was no significant difference between the two groups in terms of the cumulative incidence of relapse. The cumulative incidence of relapse at 3 years were (8.33±7.98) % and (12.50±8.27) % in high and low Galectin-9 groups, respectively (P=0.708) . Conclusions: The serum concentration of Galectin-9 at the time of engraftment after allo-HSCT may be used as a predictor for the development and severity of aGVHD. Galectin-9 might be considered as a potential new approach to regulate transplant rejection to achieve desirable survival.

异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）是恶性血液病最有效的治疗方法之一，急性移植物抗宿主病（GVHD）是allo-HSCT后最主要的并发症和移植失败的重要原因。目前，在临床上预防和治疗急性GVHD的手段仍然十分有限[1]–[2]。因此，早期预测、早期预防、早期干预是减少和减轻急性GVHD的关键，也是提高allo-HSCT成功率的关键。近年来急性GVHD的机制被逐渐阐明，但其诊断技术进展仍十分缓慢，主要还是依靠临床表现以及靶器官组织的活检。由于急性GVHD的临床表现缺乏特异性，与移植后粒细胞缺乏期感染、植入综合征、放化疗损伤等难以鉴别，因此寻找急性GVHD特异性生物学标志物对于疾病的早期诊断及精准治疗显得尤为重要[3]。半乳糖凝集素（Galectin）是一类能与糖类专一的非共价结合，并具有凝集细胞和沉淀聚糖与复合糖作用的非抗体蛋白质或糖蛋白，广泛分布于人体多数组织中，在细胞黏附、细胞凋亡、炎症反应、肿瘤转移等各种生理和病理过程中发挥重要作用[4]–[8]。本研究探讨外周血Galectin-9水平对allo-HSCT后急性GVHD的预测作用。

病例与方法

1．病例：本研究共纳入2013至2014年在我院接受allo-HSCT的血液病患者29例，其中男16例，女13例，中位年龄26（14~42）岁；急性髓系白血病（AML）17例，急性淋巴细胞白血病（ALL）5例，骨髓增生异常综合征（MDS）4例，慢性髓性白血病（CML）3例；亲缘全相合移植21例，单倍型移植3例，无关供者移植5例；移植时原发病完全缓解28例，部分缓解1例。以粒细胞集落刺激因子（G-CSF）5 µg·kg−1·d−1×4~5 d进行干细胞动员。预处理方案：8例采用阿糖胞苷（Ara-C）+白消安（Bu）+环磷酰胺（Cy）+司莫司汀（Me-CCNU）方案，21例采用Ara-C+Bu+氟达拉滨（Flu）+Me-CCNU方案。GVHD预防：21例患者采用环孢素A+甲氨蝶呤（MTX）方案，8例采用环孢素A+MTX+霉酚酸酯（MMF）方案。急性GVHD按照Glucksberg标准分级。13例（44.83%）患者发生急性GVHD，其中4例（13.79%）为Ⅲ/Ⅳ度急性GVHD，16例（55.17%）未发生急性GVHD。所有患者及健康志愿者均签署知情同意书。

2．ELISA法检测Galectin-9浓度：收集我院2013至2014年行allo-HSCT的29例恶性血液病患者及15例健康志愿者（对照组）的外周血标本。allo-HSCT患者于干细胞回输前及造血重建（移植后粒细胞及血小板均植活）时采集外周血标本（肝素抗凝）。对于标本采集时存在感染的患者予以剔除。用ELISA法检测Galectin-9浓度（试剂盒为美国R&D Systems公司产品，按照说明书操作）。

3．随访：采用查阅门诊/住院病历及电话联系方式进行随访。随访截止日期为2017年12月31日。总生存（OS）时间：造血干细胞回输至随访截止或因任何原因引起死亡的时间。

4．统计学处理：采用Graphpad prism5.0和SPSS 25.0软件进行统计学分析，结果以均数±标准误表示。单变量两组资料之间的比较采用独立样本t检验；生存曲线用Kaplan-Meier；用ROC曲线来评估Galectin-9表达水平诊断急性GVHD患者的灵敏度及特异度。P≤0.05认为差异具有统计学意义。

结果

1．allo-HSCT患者移植前Galectin-9浓度与急性GVHD的关系：29例患者移植前Galectin-9浓度高于对照组[（10.39±0.85）µg/L对（4.83±0.49）µg/L，P<0.001]；13例发生急性GVHD患者移植前Galectin-9浓度低于16例未发生急性GVHD患者[（7.96±1.18）µg/L对（12.37±0.97）µg/L，P=0.007]；Ⅰ/Ⅱ度急性GVHD患者（9例）、Ⅲ/Ⅳ度急性GVHD患者（4例）移植前Galectin-9浓度分别为（9.29±1.78）µg/L、（5.84±0.29）µg/L（P=0.162）；Ⅰ/Ⅱ度急性GVHD患者与未发生急性GVHD患者移植前Galectin-9浓度[（12.37±0.97）µg/L]差异无统计学意义（P=0.113）。未发生急性GVHD组（16例）移植前Galectin-9浓度明显高于Ⅲ/Ⅳ度急性GVHD组（P=0.002）。

2．allo-HSCT患者移植后Galectin-9：急性GVHD组植活时Galectin-9浓度高于未发生急性GVHD组[（17.78±1.78）µg/L对（9.45±0.80）µg/L，P<0.001]，且移植患者Galectin-9浓度明显高于正常对照[（13.19±1.19）µg/L对（4.83±0.49）µg/L，P<0.001]。在发生急性GVHD的患者中，Ⅲ/Ⅳ度急性GVHD患者Galectin-9浓度[（23.25±2.59）µg/L]明显高于Ⅰ/Ⅱ度急性GVHD患者[（14.37±1.45）µg/L]及未发生急性GVHD的患者[（9.45±0.80）µg/L]（P=0.008，P<0.001）。而Ⅰ/Ⅱ度急性GVHD患者Galectin-9浓度明显高于未发生急性GVHD的患者（P=0.004）。

3．allo-HSCT患者移植前后Galectin-9浓度：未发生急性GVHD组移植前、移植后外周血Galectin-9浓度分别为（12.37±0.97）µg/L、（9.45±0.80）µg/L（P=0.028）；急性GVHD组移植前、移植后外周血Galectin-9浓度分别为（7.96±1.18）µg/L、（17.78±1.78）µg/L（P<0.001）。

4．生存分析：至随访截止时，29例患者中22例存活，其中3例患者分别在移植后3.5、8.3、8.5个月复发。7例患者死亡（2例死于复发，3例死于肺部感染后呼吸衰竭，2例死于Ⅳ度急性GVHD）。中位随访时间为1 470（105~1 816）d。

对患者移植前后Galectin-9的表达水平进行ROC分析，进一步分析Galectin-9的表达对allo-HSCT患者临床预后的影响。移植前Galectin-9水平ROC分析提示，其曲线下面积为0.851（95%CI 0.686~1.000）（P=0.001），最佳甄别阈值为8.86 µg/L，灵敏度为0.875，特异度为0.846。移植后Galectin-9水平ROC分析显示，其曲线下面积为0.887（95% CI 0.741~1.000）（P<0.001），最佳甄别阈值为13.61 µg/L，灵敏度为0.846，特异度为0.875。移植前高表达Galectin-9的患者（≥8.86 µg/L）与低表达的患者（<8.86 µg/L）3年OS率分别为（87.50±8.27）%、（84.61±10.01）%（P=0.505）（图1），3年累积复发率分别为（13.33±8.78）%、（7.69±7.39）%（P=0.617），非复发死亡率分别为（12.95±0.56）%、（7.69±7.39）%（P=0.911）。移植后Galectin-9高表达（≥13.61 µg/L）、低表达（<13.61 µg/L）患者的3年OS率分别为（69.23±12.80）%、（100.00±6.05）%（P=0.009）（图2），非复发死亡率分别为（23.08±11.69）%、（0.00±7.39）%（P=0.023），3年累积复发率分别为（8.33±7.98）%、（12.50±8.27）%（P=0.708）。

图1

移植前高表达Galectin-9组与低表达Galectin-9组总生存曲线

图2

移植后高表达Galectin-9组与低表达Galectin-9组总生存曲线

讨论

急性GVHD的相关危险因素包括干细胞的输注量、年龄、供者性别、干细胞来源、全身照射、细胞因子及受体的基因多态性等[3]，但临床上仍然无法准确预测急性GVHD的发生和发展。理想的生物学标志物不仅应具备敏感性、特异性、无创性及标准化等特点，还应该能够预测疾病预后并对治疗效果进行评估。尽管已发现多种miRNA、细胞因子及免疫调节细胞对于急性GVHD的诊断及预后相关，但目前的研究仍局限于动物实验及小样本临床研究，其可靠性及临床应用价值仍需验证。

Galectin广泛分布于人体多数组织中，包括脑、乳腺、胃、肝脏、胰岛细胞、肺、子宫、扁桃体和多种免疫细胞，在细胞黏附、细胞凋亡、炎症反应、肿瘤转移等各种生理和病理过程中发挥重要作用[4]–[8]。在乳腺癌、口腔肿瘤、肝癌、膀胱癌患者中均发现了肿瘤细胞Galectin-9高表达[9]–[12]，而在一些肿瘤模型中，重组Galectin-9能明显抑制肿瘤转移[13]–[15]。可见Galectin-9与肿瘤的发生、发展、转移和预后密切相关，在机体肿瘤免疫调节中发挥重要作用[16]。最新有Meta分析研究了Galectin-9对2 408例实体肿瘤患者预后的影响，结果发现Galectin-9的表达与肿瘤患者预后具有显著相关性，Galectin-9可作为评估实体瘤患者预后的有效生物学标志[17]。而在自身免疫性疾病小鼠体内，注射重组Galectin-9蛋白能减轻疾病严重程度，降低疾病致死率[18]–[20]。急性GVHD与自身免疫性疾病的发病机制具有相似的免疫学特征，注射重组Galectin-9蛋白能明显减轻实体器官移植小鼠急性排斥反应并延长生存时间[18]–[20]。可见Galectin-9在移植后免疫耐受中同样发挥着重要的作用。然而有关Galectin-9在allo-HSCT中的研究非常有限，其与急性GVHD的发生及患者预后是否具有相关性尚不明确。故本研究是首次在移植患者体内，通过检测Galectin-9的表达探讨其在预测allo-HSCT后急性GVHD及患者预后中的作用。

在本研究中，我们发现Galectin-9在allo-HSCT中具有预测急性GVHD的发生及发展的重要临床意义。我们研究发现，在移植前，患者外周血中Galectin-9的表达越高，其移植后发生急性GVHD概率越低，但是移植前Galectin-9的表达高低并无法预测急性GVHD的严重程度。且根据对移植前Galectin-9表达的ROC分析，其表达高低对患者3年OS率、非复发死亡率和复发率并无预测价值。然而我们却发现，在移植后植活时，患者外周血中Galectin-9的表达变化趋势与移植前完全相反。未发生急性GVHD的患者移植前Galectin-9高表达且在移植后逐渐下降，而发生急性GVHD的患者移植前Galectin-9低表达且移植后则明显升高。造血干细胞植活时，患者外周血Galectin-9浓度越高，其发生急性GVHD的可能性越大。且高表达患者，急性GVHD的严重程度也越重。此外，我们通过对移植后Galectin-9表达水平进行ROC分析，将13.61 µg/L作为甄别阈，结果发现，移植后高表达Galectin-9患者3年OS率较Galectin-9低表达患者更差，非复发死亡率明显增高，而3年复发率却无明显差异。我们推测，OS和非复发死亡率的差别是由于急性GVHD的发生所导致的，移植后Galectin-9高表达患者发生急性GVHD的概率明显增高，其值越高，急性GVHD的程度越重，故增加了急性GVHD相关死亡率及并发症的发生，导致OS率明显降低、非复发死亡率增高。由此，我们认为，移植前检测Galectin-9有助于预测移植后发生急性GVHD的风险，然而在移植后干细胞植活1周内检测Galectin-9的表达更具有临床意义。若患者此时Galectin-9浓度水平大于13.61 µg/L，则考虑发生急性GVHD的可能性极大。对于这类患者，应密切关注其病情变化并提前进行急性GVHD的预防及干预。

本研究结果显示Galectin-9具有作为免疫调节方面生物标志的重要潜能，尤其在allo-HSCT后预测急性GVHD的发生及预后中具有重要临床意义。目前，关于Galectin-9在allo-HSCT中的调节作用的研究较少,具体机制有待于进一步研究阐明，对Galectin-9进行深入研究或许能够为急性GVHD的预防和治疗提供一个新思路。