[Prognostic value of donor chimerism at +90 days after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation in young patients with intermediate-risk acute myeloid leukemia].

Objective: To investigate the relationship between donor chimerism and relapse after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (allo-HSCT) .
Methods: The clinical data of 105 patients with acute myeloid leukemia (AML) who underwent allo-HSCT and recurrence-free survival>90 days from January 2010 to January 2019 were retrospectively analyzed. The bone marrow samples were collected at 15, 30, 60, 90, 180, 270, 360 days after transplantation. Donor chimerism was detected by single nucleotide polymorphism (SNP) -PCR.
Results: Of the 105 patients, 43 cases were male and 62 cases were female, with a median age of 38 (16-60) years. Till April 2019, the median follow-up was 843 (94-3 261) days. Ninety days after transplantation, 18 cases relapsed, 33 cases died, and 72 cases survived. The 3-year overall survival (OS) rate was (66.8±5.1) %, and the recurrence-free survival (RFS) rate was (65.1±5.0) %. Pre-transplant disease status, pre-transplant minimal residual disease (MRD) , and 90 day post-transplantation chimerism were independent risk factors related to RFS. The risk of recurrence was significantly increased in patients with a donor chimerism rate ≤97.24% at 90 days after transplantation[HR=6.921 (95%CI 2.669-17.950) , P<0.001], which was considered as a sign of early relapse.
Conclusion: SNP-PCR is an applicable method for detecting donor chimerism in patients after allo-HSCT. Chimerism rate equal or less than 97.24% at 90 days after transplantation predicts a higher risk of relapse.

在异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）中，供者造血干细胞植入是移植成功的标志之一[1]–[2]。供者造血干细胞逐渐植入并取代原有患者血细胞的状态被称为嵌合状态（chimerism）。嵌合状态的检测方法随着造血干细胞移植的进展而演化发展。基于单核苷酸多态性（SNP）的SNP-PCR是本中心研发的供者细胞嵌合率检测方法[3]。监测供者细胞嵌合率除了能早期判断供者细胞植入状态，和微小残留病（MRD）结合，还能早期发现患者的复发趋势，协助早期干预。为了评价移植后供者细胞嵌合率对复发的预后价值，我们回顾性分析了105例年轻（15～60岁）中危组急性髓系白血病（AML）患者的临床资料。

病例与方法

1．病例：2010年1月至2019年1月，在我院接受allo-HSCT的105例AML患者纳入本研究。纳入标准：①年龄15～60岁；②符合欧洲白血病网（ELN）的中危组定义[4]；③移植后90 d存活且未复发。

2．供者：HLA配型高分辨10/10位点相合同胞供者46例，亲缘HLA不全相合供者18例，HLA配型高分辨10/10位点相合无关供者26例，HLA不全相合无关供者15例。供受者ABO血型相合42例，血型不合63例。

3．预处理方案及移植物抗宿主病（GVHD）防治：清髓性预处理（MAC）71例，减低剂量预处理（RIC）34例。MAC采用白消安（Bu）+环磷酰胺（Cy）方案。RIC采用氟达拉滨（Flu）+阿糖胞苷（Ara-C）+Bu。无关供者和亲缘HLA不全相合供者移植在此基础上加用抗胸腺细胞球蛋白（ATG）。

GVHD预防采用环孢素A+霉酚酸酯+短程甲氨蝶呤方案[5]。ANC≥0.5×109/L连续3 d为粒细胞植活；PLT≥20×109/L连续7 d且脱离血小板输注为血小板植活。

4．SNP-PCR检测：于移植后15、30、60、90、180、270、360 d进行SNP-PCR检测，检测方法参照文献[3]。

5．MRD检测：采用多参数流式细胞术（MPFC）检测白血病相关免疫表型（LAIP）作为MRD的监测指标，抗体组合包括：CD34-PE /CD117-APC/CD45-Percp / CD56-PE-cy7 / CD2-FITC / CD7-FITC及CD34-APC /CD64-FITC /CD15-FITC /CD11c-PE/CD45-Percp。MRD≥0.1％为阳性。

6．随访及疗效评估指标：采用电话随访、查阅病历方式收集患者生存、复发资料。参照文献[6]–[7]标准评估疗效。完全缓解（CR）：白血病的症状和体征消失，白细胞分类中无白血病细胞，骨髓原始粒细胞<5％，无髓外白血病；复发：获得CR患者外周血重新出现白血病细胞或骨髓原始细胞≥5％或髓外出现白血病浸润。总生存（OS）时间：造血干细胞回输至随访截止或患者死亡日期；无复发生存（RFS）时间：造血干细胞回输至复发、随访截止或死亡的时间。

7．统计学处理：计量资料数据以均数±标准差表示，组间比较采用t检验。计数资料采用Fisher精确概率法分析，生存分析采用Kaplan-Meier方法，并进行Log-rank检验，检验水准α=0.05，采用Cox回归模型进行多因素分析。嵌合率界值采用描绘受试者工作特征（ROC）曲线，并确定ROC曲线下面积（AUC）。通过R软件竞争风险模型计算累积复发率（CIR），以复发和非复发死亡（NRM）为竞争风险。其余分析采用SPSS 25.0软件进行。P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1．一般资料及移植特征：全部105例患者中，男43例，女62例，中位年龄为38（16～60）岁。中位随访时间为843（94～3 261）d。+90 d后复发18例，3年OS率为（66.8±5.1）％，RFS率为（65.1±5.0）％。复发组、未复发组患者一般资料及移植特征见表1。

表1

105例中危组急性髓系白血病患者的一般资料和移植特征

临床特征	复发组（18例）	未复发组（87例）	统计量	P值
性别［例（％）］			χ2＝0.109	0.796
男	8（44.4）	35（40.2）
女	10（55.6）	52（59.8）
中位年龄［岁，M（范围）］	30（16～55）	39（17～60）	t＝2.742	0.135
移植前疾病状态［例（％）］			χ2＝4.659	0.031
CR1	13（72.2）	80（92.0）
CR2	5（27.8）	7（8.0）
供者类型［例（％）］			χ2＝1.095	0.304
亲缘供者	9（50.0）	55（63.2）
非亲缘供者	9（50.0）	32（36.8）
供、患者性别［例（％）］			χ2＝0.169	0.785
相合	11（61.1）	51（58.6）
不相合	7（38.9）	36（41.4）
供者年龄［岁，M（范围）］	30（12～49）	37（12～61）	t＝1.537	0.243
HLA配型［例（％）］			χ2＝7.444	0.114
10/10相合	11（61.1）	61（70.1）
9/10相合	3（16.7）	13（14.9）
8/10相合	3（16.7）	2（2.3）
7/10相合	1（5.5）	9（10.4）
5/10相合	0（0.0）	2（2.3）
供、患者血型［例（％）］			χ2＝0.402	0.790
相合	6（33.3）	35（40.2）
不合	12（66.7）	52（59.8）
预处理方案［例（％）］			χ2＝0.420	0.583
RIC	7（38.9）	27（31.0）
MAC	11（61.1）	60（69.0）
急性GVHD［例（％）］			χ2＝0.006	1.000
发生	4（22.2）	23（26.4）
未发生	14（77.8）	64（73.6）
移植前MRD阳性［阳性例数/检测例数（％）］	9/18（50.0）	13/87（14.9）	χ2＝4.183	0.041
输注MNC细胞［×108/kg，M（范围）］	5.55（2.19～10.32）	5.84（1.22～13.69）	t＝0.299	0.464
输注CD34+细胞［×106/kg，M（范围）］	2.35（1.01～8.23）	3.85（0.79～9.56）	t＝1.937	0.211
移植后90d供者细胞嵌合率［％，M（范围）］	96.99（30.41～100.00）	99.07（88.46～100.00）	t＝3.280	0.001
3年总生存率（％，x±sE）	8.6±7.9	80.2±4.4	χ2＝28.915	<0.001

注：CR1、CR2分别为第1、2次完全缓解；RIC：减低剂量预处理；MAC：清髓性预处理。MRD：微小残留病（≥0.1％为阳性，<0.1％为阴性）。MNC：单个核细胞

2．供者细胞嵌合率检测时间点的选择：针对110例中危组患者移植后15、30、60、90、180、270、360 d嵌合率分别进行OS、RFS的单因素分析，发现移植后15、30、60 d嵌合率不是OS、RFS的影响因素。移植后90、180、360 d嵌合率为OS的影响因素，而90、180、270、360 d供者细胞嵌合率为RFS的影响因素（表2）。

表2

急性髓系白血病患者移植后1年内不同时间点嵌合率对总生存率、无复发生存率影响的单因素分析

因素	总生存			无复发生存
	HR	95％CI	P值	HR	95％CI	P值
+15 d供者细胞嵌合率	1.190	0.975～1.453	0.087	1.171	0.858～1.432	0.123
+30 d供者细胞嵌合率	1.207	0.933～1.562	0.151	1.183	0.284～1.823	0.202
+60 d供者细胞嵌合率	1.007	0.775～1.309	0.958	1.597	0.630～4.023	0.826
+90 d供者细胞嵌合率	0.947	0.923～0.973	<0.001	0.949	0.932～0.968	<0.001
+180 d供者细胞嵌合率	0.956	0.937～0.975	<0.001	0.965	0.950～0.979	<0.001
+270 d供者细胞嵌合率	0.910	0.689～1.201	0.505	0.972	0.950～0.994	0.013
+360 d供者细胞嵌合率	0.965	0.948～0.983	<0.001	0.953	0.927～0.980	0.001

3．SNP-PCR检测嵌合率：105例可评估患者移植前供受者经过定量PCR后均能找到相互差异的SNP位点，找到至少1个可区别的SNP位点105例，找到2个以上可区别SNP位点29例。

4．影响OS、RFS的危险因素分析：单因素分析显示，患者性别、患者年龄、供者来源、供者年龄、供者性别、血型相合/不合、预处理方案、输注单个核细胞数量、输注CD34+细胞数量、有无急性GVHD发生等均不是影响RFS的危险因素，患者移植前疾病状态、移植前MRD、移植后90 d供者细胞嵌合率为影响OS、RFS的因素（P<0.05）（表3）。多因素分析结果显示，移植前MRD阳性和移植后90 d供者细胞嵌合率是影响RFS的独立危险因素，移植前疾病状态和移植后90 d供者细胞嵌合率是影响OS的独立影响因素（表4）。

表3

急性髓系白血病患者移植后总生存率、无复发生存率影响因素的单因素分析

因素	总生存			无复发生存
	HR	95％CI	P值	HR	95％CI	P值
患者年龄（<40/≥40岁）	0.466	0.167～1.313	0.147	0.447	0.159～1.254	0.126
患者性别（男/女）	0.656	0.261～1.672	0.375	0.717	0.282～1.824	0.485
移植前疾病状态（CR1/CR2）	3.838	1.357～10.815	0.011	3.783	1.345～10.635	0.012
供者来源（亲缘/非血缘）	1.564	0.620～3.937	0.343	1.597	0.634～4.024	0.321
供者性别（男/女）	1.104	0.432～2.851	0.838	1.145	0.444～2.935	0.780
供者年龄（<40岁/≥40岁）	0.962	0.914～1.015	0.129	0.964	0.919～1.012	0.142
血型（ABO相合/不合）	1.051	0.392～2.811	0.920	1.168	0.438～3.120	0.756
预处理方案（RIC/MAC）	0.968	0.382～2.536	0.981	0.823	0.319～2.126	0.688
输注MNC细胞数	0.983	0.789～1.222	0.877	0.955	0.771～1.182	0.670
输注CD34+细胞数	0.824	0.643～1.058	0.138	0.796	0.615～1.031	0.084
急性GVHD（发生/未发生）	1.312	0.433～3.992	0.632	1.312	0.431～3.991	0.632
移植后90 d供者细胞嵌合率（≤97.24％/>97.24％）	0.148	0.057～0.382	<0.001	0.144	0.056～0.375	<0.001
移植前MRD（阳性/阴性）	0.285	0.090～0.889	0.030	0.249	0.080～0.767	0.016

注：CR1、CR2分别为第1、2次完全缓解；RIC：减低剂量预处理；MAC：清髓性预处理；MRD：微小残留病，≥0.1％为阳性，<0.1％为阴性

表4

急性髓系白血病患者移植后总生存率、无复发生存率影响因素的多因素分析

因素	总生存			无复发生存
	HR	95％CI	P值	HR	95％CI	P值
移植前疾病状态（CR1/CR2）	5.759	0.924～0.983	0.038	3.440	0.679～17.438	0.129
移植前MRD（阳性/阴性）	0.394	0.114～1.402	0.149	0.252	0.082～0.802	0.024
移植后90 d供者细胞嵌合率（≤97.24％/>97.24％）	0.967	0.943～0.998	0.050	0.953	0.928～0.984	0.007

注：CR1、CR2分别为第1、2次完全缓解。MRD：微小残留病，≥0.1％为阳性，<0.1％为阴性

5．移植后90 d供者细胞嵌合率对复发的预后价值：分别对移植前MRD、移植后90 d供者细胞嵌合率以及两因素联合绘制ROC曲线验证其对复发的预后价值。发现移植后90 d供者细胞嵌合率对复发有较好的预测能力（AUC为0.714），移植后90 d嵌合率联合移植前MRD状态及移植前疾病状态时预测能力进一步提高（AUC为0.724）。

通过对ROC曲线分析，移植后90 d供者细胞嵌合率的理想界值为97.24％，≤97.24％组（27例）的复发风险显著增高［HR=6.921（95％ CI 2.669～17.950），P<0.001］。

两组患者分别绘制OS及RFS生存曲线并采用Log-rank检验比较。移植后供者细胞嵌合率>97.24％组、≤97.24％组3年OS率分别为（81.7 ± 4.6）％、（31.7 ± 9.4）％（P<0.001），RFS率分别为（78.7±4.9）％、（27.8±9.1）％（P<0.001），CIR分别为（10.15±0.14）％、（37.04±0.92）％（P<0.001）（图1）。

图1

移植后90 d嵌合率>97.24％、≤97.24％组总生存（A）、无复发生存曲线（B）

讨论

造血干细胞移植是中高危AML患者的重要治疗手段[8]–[9]。然而大约40％的AML患者在移植后仍会复发[10]–[11]。移植后动态监测DC并和MRD相结合，可以及早预测复发，以便及时干预。

嵌合状态分析现在已经被认为是监测供者细胞移植后植入的标准之一，且几乎可以在所有allo-HSCT患者中进行监测[1]–[2]。常用的嵌合检测方法包括限制性片段长度多态性分析、基于性别染色体特异探针的荧光原位杂交技术、基于可变串联重复序列（VNTR）和基于短串联重复序列多态性（STR）-PCR检测。STR-PCR是目前使用频率较高的测方法，具有高度可区别性、敏感性高和相对快速等优点[12]–[13]。但其只是一种半定量方法，存在PCR竞争及平台期结果偏倚的缺点[14]，其PCR产物需进行毛细管电泳，有产物污染的可能，灵敏度为5％～10％[15]。本研究中我们选择我科血液学实验室2010年建立的SNP-PCR方法作为嵌合率的检测手段。本组患者均可以用SNP-PCR方法找到差异的遗传信息位点，阳性率达到100％，敏感性达到0.01％。

动态监测移植后供者嵌合率对早期预测复发有一定预测价值[13],[16]–[17]。在大多数研究中，供受者的混合嵌合状态与复发相关[18]–[19]。移植后6个月内未达到完全供者嵌合的患者或供受者嵌合率持续下降的患者复发风险显著增高，早期达到移植后完全供者嵌合的患者复发风险低[20]–[22]。本研究纳入105例年轻（15～60岁）中危组AML患者，结果发现移植前疾病状态（CR1/CR2）、移植前MRD阳性及移植后90 d供者细胞嵌合率（≤97.24％）为影响患者RFS的独立危险因素。移植后90 d供者细胞嵌合率对复发有良好的预测价值，联合移植前MRD及移植前疾病状态后其预测效能增加。移植后90 d供者细胞嵌合率≤97.24％组的复发风险高于嵌合率>97.24％组［HR=6.921（95％CI 2.669～17.950），P<0.001］。

近年来，也有研究发现不同细胞亚群嵌合水平能更早的提示患者的复发和植入排斥风险[23]。Lee等[20]回顾性分析了378例接受清髓性预处理的AML/MDS患者，其中70％患者（265例）移植后90 d～120 d接受了分选T淋巴细胞的供者细胞嵌合率检测。结果发现移植后90 d供者淋巴细胞嵌合率≤85％的患者3年复发率显著增高。国内蒋瑛等[23]在移植后7 d分选不同淋巴细胞亚群，发现T淋巴细胞嵌合率>69％提示发生GVHD风险增加。为简便快速获得嵌合率结果，本研究未进行细胞亚群的嵌合率分析。

在结合移植前疾病状态以及MRD的动态检测基础上，加强对嵌合状态的监测有助于早期鉴别移植后复发高风险的患者以便进行及时干预，防止疾病复发[18],[24]。对于移植后90 d供者细胞嵌合率≤97.24％的患者，应增加检测频率，以期尽早发现复发趋势。本研究的局限性在于，样本量仍然相对较小，亦未对移植后患者各细胞亚群进行SNP-PCR供者细胞嵌合率检测。本研究结论仍需进行大样本前瞻性临床研究加以验证。