[Clinical and prognostic values of TP53 mutation in patients with acute myeloid leukemia].

Objective: To explore the clinical and prognostic values of TP53 gene mutation in patients with acute myeloid leukemia (AML) .
Methods: A retrospective analysis of 265 newly diagnosed AML patients with next-generation sequencing (NGS) data in the Hematology Department of Changhai Hospital from January 2010 to January 2019 was performed. Mutation analysis was carried out by targeted sequencing technology including 200 hematological malignancy related genes. The association of TP53 mutation with clinical features was analyzed.
Results: Alterations in TP53 were found in 20 (7.5%) patients, including 17 case (6.4%) of missense mutations, 2 cases (0.7%) of frame-shift deletion mutations and 1 case (0.4%) of splicing sites mutation. A total of 23 kinds of TP53 mutations were detected, most of them (16, 69.6%) were located in the DNA binding domain of exon 5-8, 4 in the DNA binding domain of exon 3-4, 2 in exon 10 and 1 in splice site, respectively. The median age of patients with TP53 alterations was higher than those without [52 (26-72) years old vs 45 (14-75) years old, P= 0.008]. The frequency of complex karyotypes was higher in patients with TP53 alterations than those without [45.0% (9/20) vs 6.1% (15/245) , P<0.001]. Median overall survival (OS) of patients with TP53 alterations was shorter than those without[14.1 (95%CI 6.78-21.42) months vs 31.4 (95%CI 13.20-49.59) months, P=0.029]. The OS of patients treated with "Decitabine + CAG" was superior than that of patients treated with "3 + 7" regimen [30.0 (95%CI 27.35-38.84) months vs 12.5 (95%CI 5.80-19.19) months, P=0.018]. Multivariate analysis indicated that TP53, DNMT3A and USH2A alterations, WBC ≥ 12.45×10(9)/L had negative impacts on OS.
Conclusion: The frequency of TP53 mutation was 7.5% in our cohort. Most mutations were located in the DNA binding domain. TP53 alterations were strongly associated with older age, complex karyotype and shorter OS. Decitabine-based induction chemotherapy and hematopoietic stem cell transplantation may improve OS, more cases and/or multicenter randomized studies are needed for further confirmation.

急性髓系白血病（AML）是一组血液系统恶性克隆性疾病，多种基因突变参与AML的发生发展过程，具有很高的临床、细胞遗传学和分子生物学异质性，对治疗敏感性及预后不尽相同。细胞遗传学是评估预后并指导治疗的重要依据，随着二代测序（next-generation sequencing，NGS）技术的发展，疾病的精准分层及个体化治疗进一步成为可能[1]。欧洲白血病网（ELN）将分子生物学与细胞遗传学改变结合在一起进行危险度分层[2]，将AML患者分为低、中、高危组，其中伴有TP53基因突变的AML属于高危AML。已有研究证实尽管TP53突变在AML患者中的发生率较低，但具有重要的预后价值[3]。我们应用靶向NGS技术检测265例新诊断AML患者的TP53基因异常情况，并分析伴TP53基因异常AML患者的临床特征及预后，现报道如下。

病例与方法

1．病例资料：2010年1月至2019年1月于上海长海医院血液科确诊的有初诊NGS数据的AML患者共265例。男150例，女115例，中位年龄46（16~75）岁。按照WHO（2016）标准[4]进行诊断和分型，其中AML微分化型6例（2.3%），AML不成熟型19例（7.1%），AML成熟型78例（29.4%），急性粒-单核细胞白血病84例（31.7%），急性单核细胞白血病59例（22.3%），纯红细胞白血病8例（3.0%），急性巨核细胞白血病1例（0.4%），非特指AML 8例（3.0%），骨髓增生异常综合征（MDS）相关AML 2例（0.8%）。采用ELN标准[2]对患者进行危险度分层，其中低危组62例（23.4%），中危组127例（47.9%），高危组76例（28.7%）。

2．染色体核型分析：骨髓标本经G显带法分析染色体核型，根据《人类细胞遗传学国际命名体制（ISCN2013）》[5]描述核型异常。可分析的染色体核型共258例（97.4%）。

3．靶向二代测序分析：取初诊患者骨髓液3~4 ml，提取细胞内DNA制备全基因组文库，采用Ion Torrent测序平台对血液恶性疾病相关的基因突变进行目标区域PCR富集和高通量平行测序，平均测序深度3000×，灵敏度1%。检测AML、MDS、骨髓增殖性肿瘤相关的210个基因突变。测序后原始检测变异结果（Variant Call Format）使用CCDS、人类基因组数据库（HG19）、dbSNP（v138）、1000 genomes、COS-MIC、PolyPhen-2等数据库进行变异结果注释，并通过自建数据库和方法筛选致病性基因突变位点。

4．治疗方案：诱导方案包括IA [去甲氧柔红霉素（IDA）+阿糖胞苷（Ara-C）]、DA（柔红霉素+Ara-C）、地西他滨联合CAG（阿克拉霉素+Ara-C+G-CSF）及其他方案。获得部分缓解（PR）患者采用原方案再诱导，未缓解（NR）者换用其他方案。采用中等剂量Ara-C巩固化疗。缓解期患者根据个人意愿以及供者、经济和身体状况等因素，在巩固化疗4个疗程内进行异基因造血干细胞移植，移植方案参见文献[6]–[7]。265例患者中接受治疗者261例，208例（78.5%）接受IA、DA等“3+7”方案诱导治疗，31例（11.7%）接受“地西他滨+CAG”方案诱导治疗，21例（8.1%）接受其他化疗方案，1例（0.4%）采用中医药治疗，1例（0.4%）未治疗转院，3例（0.9%）早期死亡。其中化疗后接受异基因造血干细胞移植者78例（29.4%）。

5．随访：所有病例随访至2019年5月31日，随访资料来源于住院病例、门诊病例及电话随访记录。中位随访时间为40（1~114）个月。无复发生存（RFS）时间：获得完全缓解（CR）患者，从CR之日至复发或CR状态下死亡或随访截止的时间。总生存（OS）时间：患者从诊断至死亡或随访截止的时间。

6．统计学处理：全部统计分析均利用SPSS 25.0统计软件完成。非正态分布的计量资料采用Mann-Whitney U检验，数据以中位数（范围）表示；分类资料采用卡方检验或Fisher精确概率法进行差异性分析；影响RFS和OS的因素采用Kaplan-Meier生存分析法并进行Log-rank检验，P<0.2的因素进入Cox回归模型进行多因素分析。P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1．TP53基因异常检出率：265例初发AML患者中20例（7.5%）伴有TP53基因改变，中位突变频率（VAF）为47.7%（0.9%~84.8%），其中MDS相关AML1例、AML微分化型2例、AML成熟型6例、急性粒-单核细胞白血病5例、急性单核细胞白血病和纯红细胞白血病各3例。

2．TP53基因突变位点分布及共突变情况：20例TP53基因突变患者，17例为错义突变，1例为无义突变，2例为移码（缺失）突变。23种突变位点中，16个（69.6%）突变位于DNA结合结构域（第5~8号外显子），出现频率较高的突变位点分别有密码子248、175、220、216、273和306。其他突变位点详见图1。伴有TP53基因异常患者的平均基因突变个数与无TP53基因异常组差异无统计学意义（6.2个对6.4个，P=0.700）。伴有TP53基因异常的患者中发生频率较高的其他基因突变分别为CSMD1、ARID1B、PRS15、DNMT3A、CCDC168、IDH1、RAD21、KDM6B、KMT2D、PTPN11、RUNX1、NRAS、USH2A、NF1、TET2，VAF均≥15%，不同组别的基因突变频率详见表1。

图1

20例急性髓系白血病患者TP53基因突变位点分布

蓝色示移码（缺失）基因突变，绿色示错义突变，红色示无义突变

表1

伴TP53基因异常急性髓系白血病患者其他共发生基因突变频率

通路	突变基因（例数，频率）
肿瘤抑制因子	TP53（20，100%）、WT1（2，10%）
染色质修饰因子	ARID1B（4，20%）、BCOR（2，10%）、ASXL1（2，10%）、SETBP1（1，5%）、ALK（1，5%）、BCORL1（1，5%）、DHX30（1，5%）、EP300（1，5%）、POT1（1，5%）
DNA甲基化	DNMT3A（4，20%）、IDH1（3，15%）、TET2（3，15%）、IDH2（1，5%）
蛋白质复合物	RAD21（3，15%）、SMC3（3，15%）、SMC1A（1，5%）
组蛋白甲基化	KDM6B（3，15%）、SETD2（2，10%）、NPM1（2，10%）、NSD2（1，5%）
信号通路	PTPT11（3，15%）、NRAS（3，15%）、NF1（3，15%）、MACF1（2，10%）、ETNK1（2，10%）、ATM（2，10%）、KRAS（2，10%）、TRAF3（1，5%）、FLT3-ITD（1，5%）、SH2B3（1，5%）、KIT（1，5%）、PDGFRB（1，5%）、MSH6（1，5%）、JAK2（1，5%）
转录因子	RUNX1（3，15%）、CEBPA（2，10%）、RB1（1，5%）、IKZF1（1，5%）、CUX1（1，5%）、NR3C1（1，5%）
剪接因子	SRSF2（2，10%）、DHX30（1，5%）
黏附因子	FAT1（2，10%）
其他	CSMD1（4，20%）、RPS15（4，20%）、CCDC168（4，20%）、USH2A（3，15%）、PCLO（2，10%）、FBXW7（1，5%）、NUMB（1，5%）、ROBO3（1，5%）、ROBO1（1，5%）、DNAH2（1，5%）、RRL10（1，5%）

3．伴TP53基因异常患者的临床特征：伴有TP53基因异常组患者的中位年龄为52（26~72）岁，显著高于无TP53基因异常组患者的45（14~75）岁（P=0.008）。TP53基因异常组与无异常组相比，其年龄分布、初诊外周血白细胞计数、骨髓原始细胞比例、复杂核型比例差异均有统计学意义（P值均<0.05）。TP53基因异常与无异常组患者临床特征的比较详见表2。

表2

TP53基因异常组与无异常组急性髓系白血病（AML）患者临床特征比较

临床特征	异常组（20例）	无异常组（245例）	P值
男［例（%）］	14（70.0）	136（55.5）	<0.001
年龄［岁，M（范围）］	45（16～75）	53（26～72）	0.006
WHO（2016）分型［例（%）］
AML微分化型	2（10.0）	4（1.6）	0.017
AML不成熟型	0（0）	19（7.8）	<0.001
AML成熟型	6（30.0）	72（29.4）	0.877
急性粒-单核细胞白血病	5（25.0）	79（32.3）	0.273
急性单核细胞白血病	3（15.0）	56（22.8）	0.149
纯红细胞白血病	3（15.0）	5（2.0）	0.001
急性巨核细胞白血病	0（0）	1（0.4）	1.000
非特指AML	0（0）	8（3.3）	0.245
MDS相关AML	1（6.0）	1（0.4）	0.038
WBC［×109/L，M（范围）］	3.2（0.4～97.8）	14.8（0.5～276.3）	0.044
HGB［g/L，M（范围）］	75（40～133）	85（31～204）	0.749
PLT［×109/L，M（范围）］	55（3～134）	44（4～561）	0.728
LDH［U/L，M（范围）］	271（131～1524）	295（61～3204）	0.708
骨髓原始细胞［M（范围）］	0.337（0.200～0.675）	0.672（0.200～0.980）	<0.001
染色体核型［例（%）］
复杂核型	10（50.0）	18（7.3）	<0.001
非复杂核型	9（45.0）	221（90.2）	<0.001
缺失	1（5.0）	6（2.4）	0.442
诱导缓解化疗方案［例（%）］
“3+7”方案	15（75.0）	193（78.8）	0.502
地西他滨+CAG	4（20.0）	27（11.0）	0.765
其他	1（5.0）	25（10.2）	0.179
诱导治疗疗效［例（%）］
1个疗程内CR	12（60.0）	151（61.6）	0.772
2个疗程内CR	3（15.0）	50（20.4）	0.352
其他	5（25.0）	44（18.0）	0.228
是否接受移植［例（%）］			0.765
否	13（65.0）	165（67.3）
是	7（35.0）	80（32.7）
复发［例（%）］			0.648
否	14（70.0）	164（67.0）
是	6（30.0）	81（33.0）
死亡［例（%）］			0.013
否	7（35.0）	128（52.2）
是	13（65.0）	117（47.8）
随访时间［月，M（范围）］	20（12～38）	36（1～114）	0.144

注：MDS：骨髓增生异常综合征；CR：完全缓解；CAG：阿克拉霉素+阿糖胞苷+G-CSF

4．生存分析：截至2019年5月31日，死亡130例（49.1%），伴有TP53基因异常组死亡13例（65.0%），无TP53基因异常组死亡117例（47.8%）。伴有TP53基因异常组患者的中位OS时间为14.1 [（95%CI 6.78~21.42）]个月，无TP53基因异常组患者中位OS时间为31.4[（95%CI 13.20~49.59）]个月（P=0.029）（图2），两组的2年累积复发率分别为37.0%和28.4%（P=0.652）。76例高危组AML患者中，伴TP53基因异常组患者的中位OS时间为14.1 [（95%CI6.78~21.42）]个月，无TP53基因异常组患者中位OS时间为14.6[（95%CI 5.32~23.87）]个月（P=0.710），两组差异无统计学意义。20例伴TP53基因异常AML患者中，1例早期死亡，15例接受“3+7”治疗方案，12例获CR，其中5例（33.3%）接受异基因造血干细胞移植；4例接受“地西他滨+CAG”方案治疗，均获CR，其中2例（50.0%）接受造血干细胞移植。接受“地西他滨+CAG”方案诱导治疗患者的中位OS时间为30.0（95%CI 27.35~39.84）个月，较“3+7”方案组的12.5（95%CI 5.80~19.19）个月显著延长（P=0.018）。19例伴TP53基因突变患者接受治疗，16例（84.0%）诱导化疗获得缓解，12例接受化疗治疗，中位OS时间12.5（95%CI 2.77~22.22）个月，7例接受异基因造血干细胞移植，中位OS时间17.4（95%CI 9.76~25.04）个月（P=0.200），两者差异无统计学意义，可能与TP53突变例数、移植例数偏少有关。

图2

伴或不伴TP53基因异常的急性髓系白血病患者的总生存曲线

5．预后因素分析：本组1例TP53突变AML患者VAF小于2%，未经治疗早期死亡，故对VAF大于2%的基因进行预后相关分析，TP53、DNMT3A、USH2A基因突变与更短的OS时间显著相关（P<0.05，表3）。此外，单因素分析发现初发WBC、染色体核型、缓解后治疗方案是影响预后的因素（表3）。将P<0.2的因素纳入Cox回归多因素分析模型，结果表明TP53、DNMT3A、USH2A基因异常和初发WBC>12.45×109/L是影响患者OS的独立预后不良因素（表4）。

表3

影响伴TP53基因异常急性髓系白血病患者总生存的单因素分析

因素	HR	95%CI	P值
性别（男/女）	1.380	0.969～1.966	0.074
年龄（≥46岁/<46岁）	1.384	0.981～1.954	0.064
WBC（≥12.5×109/L/<12.5×109/L）	1.836	1.296～2.600	0.001
HGB（≥85 g/L/<85 g/L）	0.892	0.631～1.261	0.519
PLT（≥44×109/L/<44×109/L）	1.201	0.851～1.694	0.298
LDH（≥290 U/L/<290）U/L	1.104	0.781～1.559	0.576
骨髓原始细胞（≥0.642/<0.642）	0.980	0.693～1.387	0.912
突变基因
CSMD1	1.061	0.645～1.746	0.816
ARID1B	1.180	0.724～1.921	0.506
RPS15	1.082	0.567～2.063	0.812
DNMT3A	1.808	1.192～2.743	0.005
CCDC168	1.043	0.641～1.697	0.867
NRAS	0.831	0.533～1.296	0.414
TP53	1.883	1.056～3.357	0.014
FLT3	1.344	0.897～2.045	0.173
CEBPA	0.921	0.577～1.470	0.730
TET2	1.115	0.710～1.751	0.636
NPM1	0.991	0.615～1.596	0.969
KMT2D	0.948	0.637～1.434	0.801
USH2A	1.379	0.960～1.980	0.082
PCLO	0.959	0.640～1.435	0.837
IDH1	1.092	0.615～1.936	0.764
RUNX1	1.089	0.636～1.866	0.756
RAD21	0.780	0.381～1.595	0.496
KDM6B	0.859	0.501～1.473	0.581
PTPT11	0.909	0.444～1.860	0.794
NF1	0.649	0.265～1.586	0.342
染色体核型（复杂/非复杂）	1.926	1.139～3.257	0.014
诱导方案（“3+7”/“地西他滨+CAG”）	0.754	0.444～1.281	0.297
缓解后治疗方案（化疗/移植）	1.748	1.177～2.596	0.006
完全缓解（1个疗程/2个疗程）	0.690	0.391～1.217	0.200

表4

影响伴TP53基因异常急性髓系白血病患者总生存的多因素分析

因素	HR	95%CI	P值
性别（男/女）	1.193	0.742～1.917	0.467
年龄（≥46岁/<46岁）	1.108	0.693～1.771	0.668
WBC（≥12.5×109/L/<12.5×109/L）	2.088	1.297～3.361	0.002
DNMT3A	2.735	1.591～4.700	0.001
TP53	1.837	0.612～3.858	0.035
FLT3	1.113	0.604～2.051	0.732
USH2A	1.667	1.031～2.697	0.037
染色体核型（复杂/非复杂）	1.877	0.798～4.441	0.149
缓解后治疗方案（化疗/移植）	0.609	0.363～1.021	0.060
完全缓解（1个疗程/2个疗程）	1.378	0.774～2.454	0.277

讨论

人类TP53基因定位于17号染色体短臂，编码p53蛋白，主要作用是修复DNA损伤、细胞周期调控等，是重要的抑癌基因[8]。在所有人类肿瘤中，TP53基因突变率约5%~80%[9]–[10]，在实体肿瘤中的突变率可高达48%，在AML中的突变率较低，约12.7%，MDS中的突变率为5%~10%，而在治疗相关AML中高达30%[11]–[12]。TP53的突变主要为错义突变，出现在体细胞DNA结合结构域，突变位点有密码子248、273、175、245。本研究中，TP53基因异常主要为基因突变，其总发生率为7.5%，绝大部分为错义突变，突变位点及密码子与文献报道基本一致[13]。Leung等[14]研究指出伴TP53突变的AML中常见其他基因突变为BCOR（19%）、RUNX1（16%）、NOTCH1（16%）、NRAS（11%）、ASXL1（11%）和BCORL1（11%）。国内黄慧君等[3]研究发现伴TP53突变的MDS常见突变基因为U2AF1、SF3B1等，但VAF均<20%。本研究发现伴TP53突变的AML患者常见突变基因为CSMD1、ARID1B、PRS15、DNMT3A、CCDC168、RUNX1、NRAS、USH2A等，涉及表观遗传和信号转导通路，这与我中心使用的靶向NGS基因谱涵盖的基因较多有关，还需要全国多中心、更大规模的数据来加以验证。

本研究发现，高危组AML伴或不伴TP53突变者预后均不良。伴TP53突变的AML患者的不良预后主要与高龄、原始细胞比例低、复杂核型及治疗相关AML有关[15]–[20]，且高龄和复杂核型是此类患者的独立不良预后因素[15],[21]–[22]。TP53突变几乎可在所有FAB亚型中发生，其中M6伴有TP53突变的比例较高，为25%~36%[15],[23]。本研究TP53突变也与M6具有显著相关性（P=0.015）。伴TP53突变的AML患者对传统化疗反应较差，中位生存时间5~9个月[24]，本组患者中位生存时间（14.1个月）较无TP53异常组（31.4个月）明显缩短（P=0.029）。19例接受治疗的TP53异常AML患者中，移植组中位生存时间较化疗组有所延长（17.4个月对12.5个月，P=0.200），但两者差异无统计学意义，可能与移植例数较少有关。国内常春康等[25]研究地西他滨在TP53突变的MDS中的疗效，发现MDS患者TP53基因突变率为12.7%，地西他滨在15例伴TP53突变的MDS患者中的诱导缓解率高达66.7%。同时，Welch等[26]研究地西他滨在116例AML患者中的诱导治疗反应，证实21例伴TP53突变的AML患者的诱导治疗反应率明显优于TP53野生型患者（100%对41%，P<0.001）。本研究中，4例患者诱导治疗使用以地西他滨为基础的联合化疗方案，均获得CR，其中位生存时间长于传统的“3+7”方案（30.0个月对12.5个月，P=0.018），由于病例数较少，这一生存期延长趋势还需积累更多病例，尤其是多中心、随机对照临床研究加以验证。

TP53突变常见于复杂核型且作为不良预后的独立预测因素[27]，Wong等[17]和Lindsley等[28]研究表明TP53突变频率与复杂核型、治疗相关性AML相关，随着年龄的增长而升高，在AML中的预后差。本研究结果表明，复杂核型、传统“3+7”方案诱导化疗、常规化疗等因素明显影响TP53基因突变患者的整体生存期，这与Welch等[26]的报道相近，结果提示对于伴有TP53基因突变的AML患者可采用更加积极的治疗手段，如首选以地西他滨为基础的化疗方案，治疗获CR后应尽量创造条件进行造血干细胞移植，以改善患者的OS。本研究中，伴TP53基因突变的CR患者进行造血干细胞移植的中位生存期较化疗患者无显著延长，提示此类患者预后较差，也与本队列中伴有TP53基因异常的病例数较少有关。本组病例尚不能分析不同类型TP53异常对患者治疗敏感性以及生存情况的影响，有待扩大病例数后进一步研究。