[14-3-3ζ protein mediates gemcitabine resistance in NK/T-cell lymphoma].

Objective: To explore the molecular mechanisms of 14-3-3ζ in gemcitabine resistance in extranodal NK/T-cell lymphoma, nasal type (ENKTL) .
Methods: The effects of cell proliferation and invasion were detected by cell counting kit-8 (CCK-8) assay and transwell assay. YTS cells were exposed to gradually increased concentrations of gemcitabine to establish gemcitabine-resistant YTS cells (YTS-gem) in vitro. 14-3-3ζ specific siRNA lentiviral vector was transfected into YTS and YTS-gem cells to downregulate 14-3-3ζ expression, and stable transfected cell clones were screened. The protein expression was determined by Western blot.
Results: ①14-3-3ζ expression was significantly up-regulated in gemcitabine resistant YTS-gem cells, comparing with that of YTS cells (P<0.05) . ②The results of CCK-8 and transwell assay showed that downregulation of 14-3-3ζ significantly reduced the cell proliferation and invasion abilities (P<0.05) . ③Downregulation of 14-3-3ζ could restore gemcitabine sensitivity in gemcitabine resistant YTS-gem cells (P<0.05) . ④Western blotting results showed that knockdown of 14-3-3ζ significantly upregulated pro-apoptotic Bax, and downregulated anti-apoptotic Bcl-2, Caspase-3, cleaved caspase-3, Cyclin D1 in gemcitabine-resistant YTS-gem cells (P<0.05) . There was no significant difference in p53 ang P-gp expression levels. Conclusions: 14-3-3ζ was upregulated in gemcitabine resistant YTS cells. Overexpression of 14-3-3ζ promoted cell proliferation and enhanced cell migration. 14-3-3ζ contributed to gemcitabine resistance to ENKTL through anti-apoptosis.

结外NK/T细胞淋巴瘤，鼻型（extranodal NK/T-cell lymphoma, nasal-type, ENKTL）是一类高度侵袭性恶性淋巴瘤，在亚洲多发而西方国家少见（发病率分别为22%和5%），目前尚无标准治疗方案[1]。已有研究证实，以吉西他滨为基础的化疗方案优于传统的以蒽环类药物为基础的CHOP方案（阿霉素、环磷酰胺、长春新碱、泼尼松），明显改善ENKTL的预后，但仍有部分患者疾病进展或短期复发[2]–[4]。耐药的发生可能是导致治疗失败的主要原因之一。已证实，ENKTL对CHOP方案耐药部分归因于淋巴瘤细胞表达P-糖蛋白（P-glycolprotein，P-gp）介导多药耐药[5]–[7]。然而，ENKTL对吉西他滨耐药的分子机制尚不清楚。

在前期研究中，我们发现14-3-3ζ蛋白在以吉西他滨为基础方案的化疗耐药组表达上调[8]，且进一步验证了14-3-3ζ与晚期ENKTL的预后相关[9]。另外，有研究报道14-3-3ζ在多种恶性肿瘤中表达上调[10]–[16]。14-3-3ζ表达上调能够促进肿瘤生长，下调14-3-3ζ表达可抑制肿瘤生长并诱导凋亡[17]–[19]。因此，我们推测14-3-3ζ可能诱导ENKTL对吉西他滨耐药。目前尚无14-3-3ζ诱导ENKTL对吉西他滨耐药机制的研究，探索吉西他滨耐药的分子机制对于提高ENKTL的化疗疗效至关重要。

材料与方法

1．细胞系及主要试剂：人NK/T细胞淋巴瘤细胞系YTS细胞由美国梅奥医学中心Scott Kaufmann教授惠赠。吉西他滨购自江苏豪森药业股份有限公司。抗GAPDH多克隆抗体购自美国Sigma公司，IgG二抗14-3-3ζ、P-gp、Cyclin D1、p53、Bcl-2、Bax、caspase-3、cleaved caspase-3均购自美国Santa Cruz公司。

2．细胞培养和传代：YTS细胞在37 °C、5% CO2条件下培养于含15%胎牛血清的RPMI 1640培养基中，每隔2~3 d传代1次。

3．慢病毒载体构建：合成14-3-3ζ的siRNA靶点：Target 1（376）：5′-GCTAAGAGATATCTGCAAT-3′、Target 2（583）：5′- GGAAATGCAACCAACACAT-3′、Target 3（750）：5′-GGAAATGCAACCAACACAT-3′（GenBank登录号NM_001135700），质粒pMAGic5购自上海生博生物医药科技有限公司。

4．细胞计数：取状态良好且呈对数生长的细胞，收集细胞并离心，弃上清，加入适量完全培养基重悬细胞沉淀，调整细胞密度至1×105/ml，接种于96孔板。将96孔板放置在37 °C恒温培养箱内培养24、48、72、96 h后，各孔加入CCK-8试剂10 µl，混匀后继续培养1 h。使用酶联免疫检测仪测定450 nm处的吸光度，绘制细胞生长曲线。每组设定3个复孔。

5．细胞凋亡检测：取状态良好且呈对数生长的细胞，收集细胞并离心，弃上清，加入适量完全培养基重悬细胞沉淀，调整细胞密度至1×105/ml。24孔板各孔加入细胞悬液500 µl，置于37 °C恒温培养箱内培养48 h。收集细胞并离心，加入Annexin Ⅴ-FITC和PI混匀，室温避光孵育10 min，流式细胞仪检测。

6．Transwell细胞侵袭实验：将细胞悬液加入培养基重悬细胞，调整细胞密度至1×105/ml。取细胞悬液200 µl，加至Transwell小室的上层，Transwell下层加入500 µl含10%胎牛血清的培养基，置于37 °C、5% CO2条件下继续培养24 h。取出小室，PBS清洗后随机选取，显微镜下计数染色细胞数。

7．YTS-gem细胞培养：逐渐增加培养基中吉西他滨浓度诱导YTS细胞耐药，细胞处于对数生长期时，加入起始浓度为2×10−4 µg/ml的吉西他滨，观察细胞形态变化，当出现超过90%的细胞死亡但仍有存活细胞时更换培养液，待细胞增殖至一定密度后重复给予吉西他滨，各药物浓度作用4次。各皿加入1×106个YTS细胞，待细胞状态稳定后，以0.002 µg/ml、0.02 µg/ml、0.2 µg/ml、2 µg/ml、20 µg/ml和200 µg/ml的浓度梯度增加吉西他滨浓度，吉西他滨的终浓度为200 µg/ml，隔日处理细胞并维持该药物浓度，筛选出吉西他滨耐药细胞株。

8．MTT试验：通过MTT试验检测吉西他滨的药物敏感性。取对数生长期细胞，单细胞悬浮液以4×105/ml的密度接种于96孔板，每孔接种180 µl。吉西他滨组每孔加入20 µl不同浓度的吉西他滨，每个浓度设置6个复孔。培养48 h后，加入20 µl MTT，继续培养4 h。弃培养液，每孔加入100 µl DMSO。于摇床上混匀10 min后溶解结晶，测量波长490 nm处的吸光度，取各组吸光度的平均值，计算抑制率并进一步应用直线回归法推算药物作用的半数抑制浓度（IC50）。

9．Western blot：细胞培养48 h后吸去上清液，收集细胞，加入裂解液RIPA缓冲液裂解细胞，提取总蛋白。用15%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白，按照标准方法转移到硝基膜上，阻断后，在4 °C下过夜培养特异性抗体。采用增强化学发光法检测蛋白水平。

10．统计学处理：计量资料以均数±标准差表示，组间数据的比较采用单因素方差分析，正态分布计量资料两两比较采用组间t检验，非正态分布计量资料采用秩和检验（Mann-Whitney），计数资料采用卡方检验或者Fisher's精确检验，应用SPSS 21.0统计软件分析。P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1．建立YTS-gem细胞株：我们成功构建YTS-gem细胞株。YTS细胞和YTS-gem细胞的IC50分别为0.049 µg/ml和1.960 µg/ml。YTS-gem细胞对吉西他滨的耐药指数为40。YTS-gem细胞较YTS细胞生长缓慢，倍增时间分别为51.17 h和41.36 h（表1）。

表1

不同浓度吉西他滨对YTS细胞的生长抑制率（%，±s）

细胞系（样本数）	吉西他滨浓度(µg/ml)
	2×10−4	2×10−3	2×10−2	2×10−1	2×100	2×101	2×102
YTS（6）	13.70±6.25	38.93±5.52	53.30±4.80	58.73±1.20	74.50±4.27	78.53±2.05	83.27±0.67
YTS-gem（6）	9.37±1.01	13.77±1.07	27.87±1.29	36.50±1.49	52.80±2.06	62.47±2.06	74.37±1.07

2．成功构建慢病毒载体及转染细胞：靶点1干扰效率最高，因此选择靶点1构建的慢病毒进行实验。将表达siRNA的质粒pMAGic5转染到YTS细胞和YTS-gem细胞中以下调14-3-3ζ表达。转染24 h后收集细胞，检测细胞中14-3-3ζ的干扰效果。结果显示，YTS细胞和YTS-gem细胞中14-3-3ζ的mRNA水平和蛋白质水平均显著下降（表2）。

表2

YTS细胞和YTS-gem细胞中14-3-3ζ的mRNA、蛋白质水平及凋亡相关蛋白的相对表达水平（±s）

检测项目	YTS细胞			YTS-gem细胞
	对照组	下调14-3-3ζ组	P值	对照组	下调14-3-3ζ组	P值
14-3-3ζ mRNA表达	1.02±0.14	0.57±0.01	<0.001	1.25±0.04	0.33±0.01	<0.001
14-3-3ζ蛋白表达	1.16±0.05	0.74±0.08	0.004	1.50±0.12	0.69±0.15	0.002
P-gp表达	0.40±0.03	0.48±0.08	0.168	0.52±0.05	0.47±0.07	0.361
CyclinD1表达	0.68±0.10	0.48±0.06	0.038	0.75±0.07	0.41±0.04	0.003
Bcl-2表达	0.82±0.07	0.39±0.07	0.002	0.83±0.10	0.38±0.05	0.008
Bax表达	0.79±0.11	0.85±0.10	0.499	0.55±0.33	0.78±0.10	0.042
p53表达	0.91±0.10	1.04±0.12	0.227	0.98±0.12	0.87±0.04	0.232
caspase-3表达	1.10±0.16	0.43±0.04	0.002	1.11±0.25	0.40±0.05	0.008
cleaved caspase-3表达	0.37±0.02	0.27±0.04	0.018	0.32±0.05	0.18±0.01	0.009

3．YTS和YTS-gem细胞中14-3-3ζ的表达差异：应用Western blot法分析YTS和YTS-gem细胞中14-3-3ζ的表达水平。结果显示，与YTS细胞相比，YTS-gem细胞中14-3-3ζ蛋白表达水平显著升高（图1）。

图1

Western blot法检测YTS细胞和YTS-gem细胞中14-3-3ζ蛋白表达水平

1，3：对照组；2，4：14-3-3ζ 干扰组

4．14-3-3ζ对细胞增殖能力的影响：CCK-8法检测结果显示：与对照组相比，14-3-3ζ下调组在转染48、72、96 h后增殖能力显著降低（P<0.05）（图2）。

图2

CCK-8法检测14-3-3ζ下调对YTS细胞（A）和YTS-gem细胞（B）增殖能力的影响（实验重复3次）

5．14-3-3ζ对细胞侵袭能力的影响：细胞侵袭实验结果显示，与对照组相比，14-3-3ζ下调组的穿膜细胞数显著减少（P<0.05）（图3）。

图3

Transwell小室检测14-3-3ζ下调对YTS和YTS-gem细胞侵袭能力的影响（样本数为3）

1、3：对照组；2、4：14-3-3ζ 下调组；aP<0.001，bP<0.05

6．下调14-3-3ζ恢复吉西他滨敏感性：通过siRNA下调14-3-3ζ表达，然后检测细胞对吉西他滨的敏感性。结果显示，下调14-3-3ζ后吉西他滨对YTS-gem细胞的IC50显著降低，而吉西他滨对YTS细胞的IC50在下调14-3-3ζ前后差异无统计学意义（图4）。

图4

MTT法检测14-3-3ζ下调后吉西他滨对YTS和YTS-gem细胞半数抑制浓度（IC50）的影响

1、3：对照组；2、4：14-3-3ζ 下调组；aP<0.001

7．凋亡相关蛋白检测：Western blot法检测P-gp、Cyclin D1、p53、Bcl-2、Bax、caspase-3和cleaved caspase-3的表达水平。结果显示，与YTS-gem细胞相比，下调14-3-3-ζ的YTS-gem细胞中促凋亡蛋白Bax水平显著升高。相反，抗凋亡蛋白Bcl-2、caspase-3、cleaved caspase-3和Cyclin D1的水平显著降低，P-gp和p53的表达水平差异无统计学意义（图5、表2）。

图5

Western blot法检测14-3-3ζ下调前后耐药相关蛋白在YTS和YTS-gem细胞中的表达

1、3：对照组；2、4：14-3-3ζ 下调组

讨论

14-3-3蛋白是一类在人体中高度保守且普遍存在的酸性蛋白家族[15]。在哺乳动物中，14-3-3蛋白家族由7个亚型（β，ε，η，γ，τ，ζ和σ）组成，分别被不同基因编码。14-3-3可以形成同源或异源二聚体，通过结合磷酸化丝氨酸/苏氨酸启动靶蛋白[20]。14-3-3蛋白结合后通过一系列机制调节靶蛋白，包括改变蛋白质结构、影响蛋白质活性或稳定性、促进蛋白质复合物形成和改变蛋白质亚细胞定位等。研究显示，14-3-3蛋白的主要功能是作为桥梁蛋白与其它蛋白质结合，结合后蛋白质被隔绝在细胞质中不能进入细胞核内，进而通过多种机制或途径调节所结合蛋白质的生物学功能。14-3-3蛋白家族的各个亚型主要通过调节肿瘤细胞增殖、侵袭转移、细胞周期、细胞凋亡及细胞信号通路等多种途径参与肿瘤的发生发展[21]–[22]。

14-3-3ζ作为抗凋亡蛋白在多种恶性肿瘤中表达上调且与不良预后相关，我们的研究也发现14-3-3ζ表达升高提示晚期ENKTL患者预后差。另有研究报道，14-3-3ζ表达上调导致多种肿瘤化疗耐药[23]–[26]，下调14-3-3ζ表达可增强肝癌细胞的放疗敏感性[27]，也可恢复耐药弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞系对CHOP方案的敏感性[23]。我们的研究也有类似发现，下调14-3-3ζ表达可恢复YTS-gem细胞对吉西他滨的敏感性。

既往研究发现，14-3-3ζ通过抗凋亡诱导化疗耐药[18],[28]，与我们的研究结果一致。这些结果提示，抑制14-3-3ζ可能是逆转化疗耐药及提高ENKTL对以吉西他滨为基础化疗方案敏感性的方法。由于14-3-3ζ过表达可导致肿瘤生长、凋亡受抑和化疗耐药，14-3-3ζ已被确定为癌症治疗的新型靶分子[29]–[30]。14-3-3ζ抑制剂Difopein已被发现具有较强的诱导胶质瘤细胞凋亡的作用[31]。14-3-3ζ抑制剂也可能对吉西他滨耐药的ENKTL患者有较好的治疗效果。

综上，14-3-3ζ在YTS-gem细胞中表达上调，下调14-3-3ζ可恢复YTS-gem细胞对吉西他滨敏感性。14-3-3ζ通过抗凋亡途径诱导化疗耐药，14-3-3ζ可能是ENKTL的新型治疗靶点。