[Targeting BCMA in multiple myeloma using chimeric antigen receptor-engineered T cells].

Objective: To construct the BCMA-CAR using the B-cell maturation antigen (BCMA) specific ligand APRIL as antigen binding region and to validate the effect of BCMA-CAR modified T cells (BCMA-CAR-T) on myeloma cells.
Methods: The BCMA-CAR was constructed using the BCMA specific ligand APRIL as antigen binding domain and 4-1BB as the costimulatory domain. The specific cytotoxicity against BCMA(+) myeloma cell lines and primary multiple myeloma (MM) cells in vitro were evaluated. In addition, BCMA(+) myeloma xenograft mouse model was established to assess the anti-tumor effect of BCMA-CAR-T cell therapy in vivo.
Results: BCMA-CAR-T cells could specifically kill BCMA(+) myeloma cell lines (For BCMA-CAR-T cells, BCMA(+) cells are almost undetectable in the E∶T ratio of 1∶4) and MM patients' bone marrow mononuclear cells (the proportion of residual cells in BCMA-CAR-T and vector-T groups was 16.0% vs 66.85%, P=0.003) with significant degranulation (CAR-T and vector-T cells cocultured with MM1.S, H929 and U266 had degranulation levels of 33.30% vs 5.62%, 16.97% vs 2.95% and 25.87% vs 2.97%, respectively, P<0.001) and cytokines release (P<0.01) in vitro. In a human BCMA(+) myeloma xenograft mouse model, BCMA-CAR-T cells could significantly prolong the survival of mice (The median survival time of mice treated with BCMA-CAR-T and vector-T cells was 87.5 days and 67.5 days, respectively, P<0.001) .
Conclusion: The ligand-based BCMA-CAR-T cells could be a promising strategy for BCMA(+) multiple myeloma treatment.

多发性骨髓瘤（MM）是以骨髓中异常浆细胞大量积聚并伴不同程度骨质破坏为特征的血液系统恶性肿瘤[1]。虽然蛋白酶体抑制剂和免疫调节剂已显著改善患者的生存期[2]，但大多数患者仍会出现耐药、复发、难治等情况[1],[3]。因此，探索治疗MM的新方法十分必要。

B细胞成熟抗原（BCMA）高度特异地表达于骨髓瘤细胞系和MM患者的肿瘤细胞表面，调节B细胞成熟及分化[4]。BCMA并不表达于CD34+造血干细胞或大多数正常组织细胞表面[5]，因此，BCMA已成为MM免疫治疗策略的理想靶点[6]–[7]。BCMA存在两个特异性配体，其中增殖诱导配体（APRIL）是较B细胞活化因子（BAFF）更特异、与BCMA亲和力更强的配体[8]。

嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor，CAR）由胞外的特异性抗原结合区、铰链区、跨膜区和胞内信号转导区构成[9]–[10]。近年来的研究报道了以BCMA的特异性单链抗体可变区片段（scFv）[11]或二聚体形式的APRIL[12]为抗原结合区而构建的BCMA-CAR-T治疗MM的作用。

本研究中我们以APRIL的单体形式为抗原结合区构建了一种新的BCMA-CAR结构并制备BCMA-CAR-T细胞。功能实验证明此BCMA-CAR-T细胞能特异性杀伤BCMA+骨髓瘤细胞，且能明显延长骨髓瘤小鼠的生存期。

材料与方法

一、患者骨髓标本

实验涉及的骨髓单个核细胞（BMMNC）来源于4例MM患者的骨髓标本（表1），通过Ficoll-Paque密度离心法分离而得。所有患者均为中国医学科学院血液病医院住院患者并签署知情同意书。

表1

4例多发性骨髓瘤患者基本情况

例号	年龄（岁）	性别	样本	CD138+（%）	BCMA+（%）	BCMA+（SFI）
1	61	女	骨髓	18.90	69.30	5.05
2	62	女	骨髓	9.63	44.00	4.80
3	52	女	骨髓	4.70	23.40	4.06
4	60	男	骨髓	5.15	5.89	1.31

注：BCMA：B细胞成熟抗原；SFI：特定荧光强度

二、BCMA-CAR慢病毒载体的构建

在健康供者外周血单个核细胞中以PCR方式扩增APRIL的胞外区片段，PCR过程中使用的前向引物和后向引物序列分别为：5′-CTAGCTAGCGCAGTGCTCACCCAAAAACA-3′和5′-CCGGAATTCCAGTTTCACAAACCCCAGGA-3′。将成功扩增的APRIL胞外区序列通过酶切和连接反应克隆到实验室前期已构建的pCDH-CD8α-4-1BB-CD3ζ-绿色荧光蛋白（GFP）质粒中[13]，以构建pCDH-BCMA-CAR-GFP表达载体质粒，同时以pCDH-GFP载体质粒为空白对照。将pCDH-GFP或pCDH-BCMA-CAR-GFP表达载体质粒与包装质粒（美国Invitrogen公司产品）及聚乙烯亚胺（美国Polysciences公司产品）共同转染293T细胞以制备重组慢病毒颗粒。含有慢病毒的上清液于更换培养液后24和48 h收集，于4 °C中50 000×g超速离心90 min，以KBM581淋巴细胞培养液（美国Corning公司产品）重悬慢病毒颗粒，分装后于−80 °C储存备用。

三、细胞培养

293T细胞培养于含10%胎牛血清（美国Biowest公司产品）的DMEM培养液（美国Gibco公司产品）中；骨髓瘤细胞系MM1.S、NCI-H929细胞和白血病细胞系K562细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液（美国Gibco公司产品）中；骨髓瘤细胞系U266细胞培养于含15%胎牛血清的RPMI 1640培养液中。

四、人T细胞的富集和转染

利用RossetteSep T细胞富集液（加拿大STEMCELL Technologies公司产品）和Ficoll淋巴细胞分离液（天津市灏洋生物制品科技有限责任公司产品）从健康供者外周血中分离和富集CD3+T细胞，并通过APC/Cy7标记的小鼠抗人CD3抗体（美国Biolegend公司产品）于流式细胞分析仪（美国BD公司产品）中检测T细胞纯度。T细胞以1×106/ml的密度于含5%胎牛血清、100 IU/ml人重组IL-2因子（美国R&D公司产品）和人T细胞激活因子CD3/CD28磁珠（美国Gibco公司产品）的淋巴细胞培养液中培养和刺激24 h后，直接转染BCMA-CAR或者空载体慢病毒和8 µg/ml聚凝胺（美国Sigma公司产品），并于37 °C中1 800 r/min离心90 min。每两天更换一次T细胞培养液并维持细胞密度3×105/ml。

五、BCMA-CAR蛋白的检测及CAR-T细胞表型分析

通过流式细胞术检测和分析CAR-T细胞表面CAR蛋白的表达及细胞表型。T细胞于慢病毒颗粒感染后的96 h收集，并于流式细胞分析仪中检测GFP的表达率以分析CAR-T细胞的阳性率。通过PE/Cy7标记的小鼠抗人CD4抗体、PerCP-Cy5.5标记的小鼠抗人CD8抗体、PE标记的小鼠抗人CCR7抗体和Pacific Blue标记的小鼠抗人CD45RA抗体（均购自美国Biolegend公司）标记T细胞，于流式细胞分析仪中检测不同亚型T细胞的比例[14]。

六、BCMA-CAR-T细胞的体外功能实验

本实验选用BCMA+骨髓瘤细胞系NCI-H929、MM1.S和U266细胞作为阳性靶细胞，BCMA−的K562细胞作为阴性靶细胞；选用BCMA-CAR-T细胞和空载组T细胞（vector-T）为效应细胞。

1．BCMA-CAR-T细胞与骨髓瘤细胞系共培养：T细胞与靶细胞按照一定的效靶比（1∶4、1∶8、1∶16和1∶32）共培养于含5%胎牛血清的淋巴细胞培养液中，24 h和48 h后分别收集共培养体系中的细胞并通过APC标记的小鼠抗人BCMA抗体（美国Biolegend公司产品）和APC/Cy7标记的小鼠抗人CD3抗体检测共培养体系中T细胞和靶细胞的比例。BCMA阳性细胞的比例代表靶细胞的残余比例，从而反映BCMA-CAR-T细胞对骨髓瘤细胞系的杀伤作用。

2．BCMA-CAR-T细胞与原代骨髓瘤细胞共培养：T细胞与MM患者来源的原代细胞以1∶4的效靶比共培养48 h，流式细胞术检测共培养体系中BCMA+细胞的残余比例。

3．脱颗粒实验：T细胞与靶细胞以1∶1的效靶比，共培养于含50 IU/ml人重组IL-2因子和PE标记的小鼠抗人CD107a抗体（美国Biolegend公司产品）的培养液中（总体系为200 µl），1 h和4 h后分别加入莫能霉素（美国Sigma公司产品）和APC/Cy7标记的小鼠抗人CD3抗体并进行流式细胞术检测，分析CD3+GFP+T细胞中CD107a阳性T细胞的比例。

4．ELISA法检测细胞因子释放情况：收集T细胞与靶细胞以1∶4的效靶比共培养48 h后的上清液，通过ELISA法检测上清液中干扰素-γ（IFN-γ）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素2（IL-2）的分泌情况。

七、小鼠骨髓瘤模型的构建及BCMA-CAR-T细胞治疗

从中国医学科学院实验动物所购得12只6~8周龄雌性NOD/SCID小鼠，200 cGy照射后经尾静脉接种MM1.S细胞（1×107/只）。接种MM1.S细胞后的第14天，按照小鼠体重将其随机分为两组，于第14、21和28天分别经尾静脉注射BCMA-CAR-T细胞或vector-T细胞（5×106/只）进行治疗。每周测量小鼠体重，观察小鼠发病情况并记录小鼠总生存期。小鼠发病症状包括腹泻、后肢瘫痪和体重减轻。对死亡小鼠进行解剖并取心、脾、肺、肾和骨髓进行流式细胞术分析和组织病理学检查。本实验中所有动物实验均经北京协和医学院动物保护和使用委员会批准。

八、统计学处理

所有统计学处理均采用GraphPad Prism 6.01软件完成。结果以均值±标准差表示，组间比较采用t检验，生存曲线采用Kaplan-Meier分析。P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1．BCMA-CAR慢病毒载体构建：本实验成功构建了以单体形式的APRIL胞外区片段为抗原结合区、4-1BB为共刺激分子、GFP为标记基因的BCMA-CAR慢病毒表达载体，通过GFP测得BCMA-CAR慢病毒感染人T细胞的效率为50%~60%。采用锥虫蓝染色和细胞计数方式，测得BCMA-CAR-T和vector-T细胞在慢病毒感染后2周内可增殖1 000倍以上（图1A）。BCMA-CAR-T细胞组和vector-T细胞组中CD4+和CD8+T细胞比例差异无统计学意义（CD4+ T细胞比例：39%对35%，P=0.15；CD8+T细胞比例：54%对59%，P=0.10）（图1B）。以CCR7和CD45RA为表面标记，检测和分析BCMA-CAR-T和vector-T细胞中记忆性T细胞亚群（Tcm、Tem、Temra和naive T细胞）的比例。结果显示，与vector-T细胞相比，BCMA-CAR-T细胞组的效应性记忆T细胞（Tem，CCR7−CD45RA−）比例较vector-T细胞组高（P=0.04）（53.9%对34.7%，图1C）。

图1

BCMA-CAR-T细胞的构建及亚型分析

A：锥虫蓝染色和细胞计数检测CAR-T和vector-T细胞增殖倍数。B：BCMA-CAR-T和vector-T细胞中CD4+和CD8+T细胞比例。C：BCMA-CAR-T和vector-T细胞中记忆性T细胞亚群比例。Tcm：中央记忆型T细胞，CCR7+CD45RA−；Tem：效应记忆型T细胞，CCR7−CD45RA−；Temra：终末分化效应记忆型T细胞，CCR7−CD45RA+；naive T：初始T细胞，CCR7+CD45RA+。aP<0.05

2．BCMA-CAR-T细胞对BCMA+骨髓瘤细胞系具有特异性杀伤作用：选用BCMA+骨髓瘤细胞系NCI-H929、MM1.S和U266细胞作为阳性靶细胞，BCMA−的K562细胞系作为阴性靶细胞，并通过流式细胞术检测细胞表面BCMA的表达情况（图2A）。BCMA-CAR-T细胞和vector-T细胞分别与骨髓瘤细胞系共培养48 h。对于BCMA-CAR-T细胞组，当效靶比为1∶4和1∶8时，BCMA+细胞几乎检测不到；当效靶比低至1∶16时，仅有30%的BCMA+靶细胞存活；而与K562细胞共培养的体系中，BCMA-CAR-T细胞组和vector-T细胞组中靶细胞比例随时间变化不大（图2B）。

图2

BCMA-CAR-T细胞对BCMA+骨髓瘤细胞系的特异性细胞毒作用

A：流式细胞术检测骨髓瘤细胞系MM1.S、NCI-H929、U266和白血病细胞系K562表面BCMA的表达，对应的同型异构体为阴性对照。B：BCMA-CAR-T细胞对BCMA+骨髓瘤细胞系和BCMA−K562细胞的杀伤作用。共培养48 h，效靶比为1∶4、1∶8、1∶16和1∶32。C：T细胞与靶细胞以1∶4的效靶比共培养48 h后，ELISA法检测细胞因子IFN-γ、IL-2和TNF-α的释放水平。D：流式细胞术检测脱颗粒过程中CD3+GFP+ CD107a+T细胞的比例。aP<0.05，bP<0.01，cP<0.005，dP<0.001

采用ELISA法检测共培养上清液中细胞因子的释放情况。与BCMA+骨髓瘤细胞系共培养的上清液中，BCMA-CAR-T细胞组释放的IFN-γ、TNF-α和IL-2水平较vector-T细胞组显著升高，而这些因子在T细胞与K562细胞共培养的上清液中几乎检测不到（图2C）。

检测共培养体系中T细胞表面CD107a分子的表达情况[15]。与BCMA+骨髓瘤细胞系以1∶1的效靶比共培养5 h后，BCMA-CAR-T细胞表面CD107a的表达较vector-T细胞组显著升高（两组细胞与MM1.5、H929和U266细胞共培养的脱颗粒水平分别为33.30%对5.62%、16.97%对2.95%、25.87%对2.94%，P值均<0.001）（图2D）。

3．BCMA-CAR-T细胞能延长骨髓瘤小鼠的生存期：将MM1.S细胞通过尾静脉接种至NOD/SCID小鼠（1×107/只），成功构建骨髓瘤小鼠模型。在移植后第14、21、28天，BCMA-CAR-T和vector-T组小鼠分别给予T细胞（5×106/只）治疗。在T细胞治疗后的第14天，BCMA-CAR-T和vector-T细胞治疗组小鼠体重均无明显变化（图3A），提示CAR-T细胞治疗的安全性。随着疾病的进展，MM1.S细胞接种后第42天，vector-T治疗组小鼠体重显著降低（BCMA-CAR-T和vector-T细胞治疗组小鼠平均体重分别为21.63 g和18.68 g）（图3A）。流式细胞术和组织病理学检查显示，所有移植小鼠在疾病发展末期均出现浸润性骨髓瘤，骨髓、脾脏、肾脏甚至心脏均可见BCMA+细胞广泛浸润（图3B、图3C）。BCMA-CAR-T细胞治疗组小鼠的中位生存期（87.5 d）较vector-T细胞治疗组（67.5 d）显著延长（P<0.001）（图3D）。

图3

BCMA-CAR-T细胞对骨髓瘤小鼠体重、BCMA+细胞、生存期的影响及主要脏器病理改变

A：MM1.S细胞接种后小鼠体重变化曲线；B：流式细胞术检测浸润性骨髓瘤小鼠骨髓、脾脏、肾脏中BCMA+细胞比例；C：骨髓瘤小鼠骨髓、脾脏、肾脏和心脏的组织病理学检查显示骨髓瘤细胞大量浸润（HE染色，高倍）；D：T细胞治疗后骨髓瘤小鼠Kaplan-Meier生存期曲线

4．BCMA-CAR-T细胞对BCMA+原代骨髓瘤细胞具有显著细胞毒作用：将BCMA-CAR-T细胞和vector-T细胞分别与4例MM患者来源的BMMNC共培养。流式细胞术检测4例患者BMMNC表面CD138和BCMA的表达情况（表1、图4A）。BCMA-CAR-T细胞对BCMA+原代肿瘤细胞的杀伤作用优于vector-T细胞（肿瘤细胞残余比例16.00%对66.85%，P=0.003）（图4B），并伴随更为强烈的脱颗粒效应（图4C）和细胞因子释放（图4D）。

图4

BCMA-CAR-T细胞对BCMA+原代骨髓瘤细胞的细胞毒作用

A：流式细胞术检测4例多发性骨髓瘤患者（P1~P4）骨髓单个核细胞中CD138+细胞表面BCMA的表达，对应的同型异构体为阴性对照。SFI：特定荧光强度，SFI达到或超过1.30为BCMA阳性。B：BCMA-CAR-T细胞对原代骨髓瘤细胞的杀伤作用。T细胞与靶细胞以1∶4的效靶比共培养48 h。C：流式细胞术检测T细胞与原代骨髓瘤细胞1∶1共培养5 h后CD3+GFP+CD107a+T细胞比例。D：BCMA-CAR-T和vector-T细胞与原代骨髓瘤细胞1∶4共培养48 h后ELISA法检测共培养上清液中IFN-γ、TNF-α和IL-2的分泌情况。aP<0.01，bP<0.05，cP<0.001，dP<0.005

讨论

MM是一种起源于骨髓中恶性浆细胞的血液系统肿瘤，常伴有多发性溶骨性病理改变、贫血、高钙血症、肾脏损伤等症状。由于恶性肿瘤是一种克隆性疾病，随着时间的推移，肿瘤细胞内部会形成多种亚克隆，所以肿瘤细胞的遗传和表型异质性常常出现在同一患者体内[16]。因此近几年来，T细胞治疗等方法已被应用于血液系统恶性肿瘤患者，以获得更好的疗效和降低治疗相关死亡率。

在本研究中，我们以BCMA的天然特异性高亲和力配体分子APRIL为抗原识别区、4-1BB为共刺激分子构建了一种新的靶向BCMA的第二代CAR。尽管APRIL以同源三聚体的形式与BCMA结合[17]，本实验以APRIL的单体分子形式构建抗原识别区，制备CAR-T细胞，研究其对MM细胞的特异性杀伤作用。体外共培养实验中，BCMA-CAR-T细胞对BCMA阳性的骨髓瘤细胞系NCI-H929、MM1.S和U266均有显著而特异的杀伤效果，并伴随强烈的脱颗粒效应及IFN-γ、TNF-α和IL-2等细胞因子释放，而对BCMA表达阴性的K562细胞系无明显的杀伤作用。同时，BCMA-CAR-T细胞对MM患者来源的BCMA+肿瘤细胞也具有杀伤作用。小鼠体内移植实验显示，BCMA-CAR-T细胞治疗接种MM1.S细胞的NOD/SCID小鼠可以显著延长小鼠的生存期，且在治疗过程中无明显的不良反应，提示BCMA-CAR-T细胞治疗是安全的。Lee等[12]构建了一种以APRIL的同源二聚体为抗原结合区的靶向BCMA和TACI的第三代CAR结构，并研究其治疗MM的作用。本实验中设计的BCMA-CAR较Lee等构建的CAR结构更简单，感染效率高，且在低效靶比的情况下仍能发挥强大的抗肿瘤作用，这意味着本实验中以单体形式的APRIL胞外区为抗原识别区的BCMA-CAR能在低剂量的条件下有效地靶向结合并杀伤BCMA阳性的MM细胞，从而减少治疗相关不良反应。

BCMA作为近几年来治疗MM的靶点备受关注，许多以scFv为抗原结合区的BCMA-CAR-T细胞治疗正在进行临床前和临床研究，并显示出有效的抗MM作用[11],[18]。Friedman等[18]以scFv为抗原识别区构建BCMA-CAR-T细胞，与靶细胞共培养时效靶比高达10∶1；而Bu等[19]设计的以scFv为抗原结合区的BCMA-CAR-T细胞，以较低的效靶比1∶4进行共培养时也能有效杀伤BCMA+细胞。由于以特异性抗体为抗原结合区的CAR-T细胞识别的抗原表位及与抗原的亲和力不同，CAR-T细胞对靶细胞的杀伤效果存在较大的差异。然而，APRIL是BCMA的天然特异性高亲和力配体，以APRIL为抗原结合区构建的CAR-T细胞在低效靶比情况下仍能展现出强大的杀伤效应，且能显著延长BCMA阳性骨髓瘤小鼠的生存期。

本实验构建的以单体形式的APRIL为抗原结合区的BCMA-CAR-T细胞对BCMA阳性的肿瘤细胞具有显著而强大的杀伤作用。然而该CAR-T细胞用于治疗MM患者的效果可能会受以下因素影响：患者骨髓微环境中的APRIL会与BCMA-CAR-T细胞表面的APRIL竞争性结合肿瘤细胞表面的BCMA从而阻断CAR-T细胞与肿瘤细胞的结合，并最终降低CAR-T细胞的治疗效果；MM患者体内APRIL水平较健康人显著升高[20]，而BCMA-CART细胞表面的抗原结合区APRIL与BCMA的亲和力与血液循环中的APRIL相近，故BCMA-CAR-T细胞不具有与MM细胞优先结合和发挥杀伤作用的优势。为改善BCMA-CAR-T细胞临床应用的效果，将其与APRIL拮抗剂联合使用或使用亲和力更强的结构作为抗原结合区而优化CAR设计可能是一种有效的方法。

此外，本研究中BCMA-CAR-T细胞与BCMA+细胞共培养时伴随显著的细胞因子释放，可能会导致一些严重的治疗相关不良反应，尤其是细胞因子释放综合征（CRS）——CAR-T细胞治疗中最严重的短期不良反应，为CAR-T细胞治疗带来很大的风险[21]。最近，Staedtke等[22]发现，可通过降低血液循环中儿茶酚胺的水平控制CRS的程度。然而到目前为止，仍无具体的临床指南指导CRS的管理，在临床实践中应用CAR-T细胞治疗时应从小剂量开始输注，并逐渐增加剂量，同时运用预防手段、支持治疗和IL-6受体拮抗剂以控制CRS[23]。

综上，以APRIL为抗原识别区构建的BCMA-CAR-T细胞能有效而特异性地靶向和杀伤BCMA阳性的MM细胞，显著延长BCMA阳性的MM小鼠的生存期，提示BCMA是治疗MM的有效靶点，以APRIL为抗原结合区构建的CAR-T细胞能发挥强大的抗MM作用。