Evaluation of hydroxyurea genotoxicity in patients with sickle cell disease.

OBJECTIVE: To evaluate the induction of DNA damage in peripheral blood mononuclear cells of patients with sickle cell disease, SS and SC genotypes, treated with hydroxyurea.
METHODS: The study subjects were divided into two groups: one group of 22 patients with sickle cell disease, SS and SC genotypes, treated with hydroxyurea, and a Control Group composed of 24 patients with sickle cell disease who were not treated with hydroxyurea. Peripheral blood samples were submitted to peripheral blood mononuclear cell isolation to assess genotoxicity by the cytokinesis-block micronucleus cytome assay, in which DNA damage biomarkers - micronuclei, nucleoplasmic bridges and nuclear buds - were counted.
RESULTS: Patients with sickle cell disease treated with hydroxyurea had a mean age of 25.4 years, whereas patients with sickle cell disease not treated with hydroxyurea had a mean age of 17.6 years. The mean dose of hydroxyurea used by the patients was 12.8mg/kg/day, for a mean period of 44 months. The mean micronucleus frequency per 1,000 cells of 8.591±1.568 was observed in the Hydroxyurea Group and 10.040±1.003 in the Control Group. The mean frequency of nucleoplasmic bridges per 1,000 cells and nuclear buds per 1,000 cells for the hydroxyurea and Control Groups were 0.4545±0.1707 versus 0.5833±0.2078, and 0.8182±0.2430 versus 0.9583±0.1853, respectively. There was no statistically significant difference between groups.
CONCLUSION: In the study population, patients with sickle cell disease treated with the standard dose of hydroxyurea treatment did not show evidence of DNA damage induction.

INTRODUCTION

Sickle cell disease (SCD) is chronic, with a recessive autosomal pattern, characterized by a point mutation on the gene encoding beta-globin, one of the polypeptide chains of hemoglobin (Hb), which then is denominated hemoglobin S (HbS). This mutation triggers the loss of electrical charges, favoring the polymerization of HbS, conferring fragility and the aspect of a sickle to the red blood cells.[1] Patients with SCD can present with various complications, such as hemolytic anemia, greater susceptibility to infections, painful crises, cardiac, hepatobiliary, ophthalmologic, osteoarticular, urogenital, pulmonary, and neurologic complications, besides severe vaso-occlusive crisis.[1 , 2]

Hydroxyurea (HU) is a drug that inhibits ribonucleotide reductase, approved in 1967 by the Food and Drug Administration (FDA) for the treatment of neoplastic diseases, and in the 1980s, was incorporated as part of the therapy for patients with SCD. The use of HU is considered a significant pharmacologic advancement in the treatment of SCD, presenting with positive results with a reduction in the number of deaths/complications and improvement in the patients’ quality of life.[3] Its beneficial effects in the treatment of SCD include the increased concentration of fetal hemoglobin (HbF) in the red blood cells and improved metabolism of nitric oxide, reducing endothelial interaction, pain episodes, acute thoracic syndrome, hospital admissions, and need for blood transfusions.[4 , 5]

Nevertheless, treatment with HU can lead to known adverse reactions, albeit reversible, such as low neutrophil count, low platelet count, anemia, rash, headache, and occasionally, nausea. There is also evidence as to the long-term risks of treatment with HU, including its effects on fertility and on reproduction.[3]

Hydroxyurea is also known as a genotoxic agent in several in vitro and in vivo trials,[6] leading to a concern as to possible genotoxic damages with mutagenic effects, and increased risk of malignant modifications. Thus, patient monitoring can be used with methodologies for DNA damage evaluation, in order to better understand the genotoxicity of this drug in treatment of SCD.[7]

Assessment of DNA damage can be investigated by the cytokinesis block micronucleus cytome assay (CBMN-cyt) in peripheral blood mononuclear cells (PBMC), which is a widely used method for genotoxicity research. In this study, one can quantify the formation of micronuclei (MN), which are a type of chromosome damage marker that originates from fragments of chromosomes or whole chromosomes. Additionally, nuclear buds (NBUDs), biomarkers of gene amplification, and nucleoplasmic bridges (NPBs), which frequently correspond to dicentric chromosomes, can also be evaluated.[8]

OBJECTIVE

To evaluate the induction of DNA damage by means of cytokinesis block micronucleus cytome assay in peripheral blood mononuclear cells from patients with sickle cell disease SS and SC treated with hydroxyurea.

METHODS

Selection of research subjects

The present study was carried out during the period from August 2015 to January 2018. Patients with SCD seen at the Hemocentro Regional de Governador Valadares da Fundação Hemominas , in the city of Governador Valadares, state of Minas Gerais, were invited to participate. The area of coverage of this blood transfusion center includes the regions of the Vales do Aço, Rio Doce, Mucuri, Jequitinhonha, and part of Zona da Mata. Patients were included in the study after giving their consent by signing the Informed Consent Form (ICF) and/or the Agreement Form (AF), whenever appropriate. Pregnant patients, those who chronically used other medications besides HU, those with positive serology tests for HIV, hepatitis B and C, or who presented with severe hepatic or renal impairment, were excluded, in addition to patients who received blood transfusions within a period of less than 100 days.

Research subjects were divided into two groups; in that, one had 22 patients with SCD genotypes SS and SC, treated with HU (HU Group) and the Control Group, composed of 24 patients with SCD who were not treated with this drug.

The study followed the protocol approved by the Research Ethics Committee of the Universidade Federal de Juiz de Fora (CAAE: 29058814.4.0000.5147, process number 718.344).

Collection of peripheral blood mononuclear cells

From each individual, approximately 5mL of venous blood were withdrawn in tubes containing the anticoagulant EDTA, and then the mononuclear cells were separated and added to conical tubes with 4mL Histopaque®-1077 (Sigma-Aldrich®) and 4mL of whole blood, centrifuged at 400×g, for 30 minutes, at 25º C. The interface range containing mononuclear cells was washed with phosphate buffered saline solution (PBS), and then collected after 10 minutes of centrifugation at 250×g. The resulting pellets were once again suspended in RPMI 1640 medium and transferred to cell culture flasks at the density of 1×10[5] cells/mL.

Evaluation da genotoxicity

The evaluation of genotoxicity was performed by a CBMN-cyt assay, carried out according to the Fenech protocol,[9] will small modifications. The PBMC cells were cultivated in culture flask containing RPMI medium 1640, 20% bovine fetal serum, 0.6% of phytohemagglutinin A (Sigma-Aldrich®), 1% of L-glutamine (Sigma-Aldrich®), and 1% of penicillin-streptomycin (Gibco®), incubated in an oven at a 37°C with 5% carbon dioxide. After 44 hours of incubation, cytochalasin B (Sigma-Aldrich®) was added at 6.0µg/mL concentration, maintaining the cultures incubated for another 28 hours.

After the incubation time, cell collection was performed, transferring the cell suspension to conical tubes and fixating the cells in 3:1 methanol/acetic acid, and adding a hypotonic treatment in a 0.01% citrate solution. The slides were prepared and stained with acridine orange (Sigma-Aldrich®), and analyzed under a fluorescence microscope.

One cell culture was performed for each individual, and from this culture, two slides were prepared; a total of 2,000 binuclear cells were analyzed as to the presence of DNA damage biomarkers (number of binuclear cells with MN, NPBs, and NBUDs). All research slides were analyzed by a single examiner. The results of frequency of biomarkers MN, NPBs, and NBUDs were presented by 1,000 binuclear cells. For each individual, 500 cells were analyzed and classified as mononuclear, binuclear, trinuclear and multinuclear (four or more nuclei) to determine the Nuclear Division Index (NDI).

Statistical analysis

The data obtained were expressed as mean±standard deviation and analyzed by means of the GraphPad Prism® version 6.01 statistics software, applying the paired t test to compare the results among the patients with SCD, SS, or SC treated with HU, and those not treated with the drug. The significance level adopted was p<0.05.

RESULTS

The total number of patients evaluated was 46, with Group HU composed of 22 individuals with SCD (19 SS and 3 SC) treated with HU, in which 12 were male, aged between 6 and 59 years (mean 25.4 years), receiving HU orally at 7.5 to 19.5mg/kg/day (mean 12.8mg/kg/day) between 12 and 82 months (mean 44 months). The Control Group comprised 24 individuals with SCD (14 SS and 10 SC) not treated with HU, in which 15 were male, aged between 4 and 52 years (mean 17.6 years) ( Table 1 ).

Table 1

Age, dose used, and duration of treatment with hydroxyurea in patients with sickle cell disease

Parameter	HU Group*			Control Group*
	n=22			n=24
	Mean	Min.	Max.	Mean	Min.	Max.
Age, years	25.4	6	59	17.6	4	52
HU dose, mg/kg/day	12.8	7.5	19.5
Time of treatment, months	44	12	82

* HU Group corresponded to patients with SS or SC sickle cell disease treated with hydroxyurea, and the Control Group corresponded to patients with SS or SC sickle cell disease not treated with hydroxyurea. HU: hydroxyurea; Min: minimum; Max: maximum.

The DNA damage markers evaluated showed no significant differences between the groups of patients using or not HU ( Figure 1 ; all p>0.05). A mean frequency of MN per 1,000 cells was 8.591±1.568 in the HU Group and 10.04±1.003 in the Control Group. The mean frequency of NPBs per 1,000 cells for the HU Group was 0.4545±0.1707, and 0.5833±0.2078 for the Control Group. The mean of NBUDs per 1,000 cells and the NDI for the HU and Control Groups were 0.8182±0.2430 and 0.9583 ± 0.1853, and 1.744±0.02607 and 1.932±0.02691, respectively.

Figure 1

Evaluation of the genotoxicity effect by means of cytokinesis block micronucleus cytome assay in peripheral blood mononuclear cells of patients with sickle cell disease SS or SC, treated with hydroxyurea (HU Group; n=22) and not treated with this drug (Control Group; n=24). Mean frequency of micronuclei (MN): (A) nucleoplasmic bridges (NPBs); (B) nuclear buds (NBUDs); (C) and Nuclear Division Index (NDI); (D) in binuclear cells (BN). There was no significant difference between the groups studied (p>0.05), according to the paired t test

DISCUSSION

Hydroxyurea is widely used in the clinical management of patients with SCD, but the risks related to their prolonged use are still under evaluation, especially its carcinogenic potential.

The genotoxicity indicators enable assessing the effects of exposures to genetic material that lead to DNA damage, and evaluating gene mutations and chromosome damage. Some genotoxicity evaluation assays comprise chromosome aberrations, sister chromatid exchanges, reverse mutations, comet assay, and analysis of MNs, NPBs, and NBUDs. These analyses, such as the frequency of MNs, NPBs, and NBUDs, applying the CBMN-cyt methodology in human lymphocytes, can help in predictive tests regarding risk of cancer.[8 , 10]

The concerns about the carcinogenic potential of HU are due to this drug also being known as an antineoplastic agent, and there are data in literature in which patients presented with an increase in DNA damage in blood cells.[11 , 12]

There are conflicting reports as to the DNA damage potential in humans exposed to HU. Some studies showed that the substance is genotoxic, while others suggested HU has low in vivo mutagenicity, which emphasizes the need for research about the long-term safety of HU administration.[11 , 13 , 14]

Some studies have shown results in which there was an increase in DNA damage in blood cells of patients treated with HU in comparison with the Control Group. Friedrisch et al.,[14] used the comet assay to analyze peripheral blood leukocytes of 28 patients with SCD treated with HU, and of 28 individuals without SCD, and they found higher levels of DNA damage in the group of patients treated with HU. Nevertheless, in this study by Friedrisch et al.,[14] it is not possible to distinguish if the effects observed result from exposure to HU or due to the disease itself, as suggested by Rodriguez et al.,[7] Moreover, another study presented with data in reference to 293 blood samples of 105 children, in a median of 2 years of HU therapy, in which the exposure to the drug was associated with significantly increased frequencies of MN in reticulocytes, reflecting the chromosome damage that occurred in the erythroblasts.[15]

Nonetheless, the results of the present study showed that in the population of SCD patients evaluated, there was no significant increase in DNA damage in the blood cells of patients treated with HU.

Similar to our findings, some reports in literature indicated treatment conditions in which HU did not lead to induction of DNA damage. Rodriguez et al.,[7] employed the comet assay and found no significant difference in DNA damage between patients with SCD, treated, or not, with HU, with doses ≤30mg/kg/day. Using the CBMN-cyt assay in lymphocytes, Maluf et al.,[16] found a small increase in the number of MN in the group of patients treated with HU, which correlated with duration of treatment and the final HU dose. In our study, in which our patients used HU doses of up to 19.5mg/kg/day, the frequency of MNs, NPBs, and NBUDs was similar between the group of patients treated with HU and the Control Group.

CONCLUSION

The present study pointed out the safety of use of hydroxyurea for a mean period of 44 months, and in doses of up to 19mg/kg/day per patient with sickle cell disease, since there were no significant differences found in the genotoxicity markers between the group of patients with sickle cell disease using the drug or not. Although there is evidence of measurable genotoxicity due to exposure to hydroxyurea in patients, this might be related to specific situations such as elevated doses, long periods of treatment, or age range of patients.

INTRODUÇÃO

A doença falciforme (DF) é crônica, de transmissão autossômica recessiva, caracterizada por mutação pontual no gene, que codifica a betaglobina, uma das cadeias polipeptídicas da hemoglobina (Hb), passando a ser denominada hemoglobina S (HbS). Essa mutação desencadeia a perda de cargas elétricas, favorecendo a polimerização da HbS, conferindo fragilidade e o aspecto de foice às hemácias.[1] Os pacientes com DF podem apresentar diversas complicações, como anemia hemolítica, maior suscetibilidade a infecções, crises dolorosas, complicações cardíacas, hepatobiliares, oftalmológicas, osteoarticulares, urogenitais, pulmonares, neurológicas e quadros graves de crises vaso-oclusivas.[1 , 2]

A hidroxiureia (HU) é um fármaco inibidor da ribonucleotídeo redutase aprovado em 1967 pela Food and Drugs Administration (FDA) para o tratamento de doenças neoplásicas e, na década de 1980, passou a fazer parte da terapia dos pacientes com DF. O uso da HU é considerado um avanço farmacológico importante no tratamento da DF, apresentando resultados positivos com redução no número de óbitos/complicações e melhoria na qualidade de vida dos pacientes.[3] Seus efeitos benéficos no tratamento da DF incluem o aumento da concentração de hemoglobina fetal (HbF) nas células vermelhas do sangue e a melhora do metabolismo do óxido nítrico, reduzindo a interação endotelial, os episódios de dor, a síndrome torácica aguda, as internações hospitalares e a necessidade de transfusões sanguíneas.[4 , 5]

No entanto, o tratamento com HU pode levar a reações adversas reconhecidas, porém reversíveis, como baixa contagem de neutrófilos, baixa contagem de plaquetas, anemia, erupção cutânea, dor de cabeça e, ocasionalmente, náusea. Também há evidências sobre os riscos a longo prazo do tratamento com HU, incluindo seus efeitos na fertilidade e na reprodução.[3]

A HU também é um conhecido agente genotóxico em vários ensaios in vitro e in vivo ,[6] levando a uma preocupação sobre possíveis danos genotóxicos com efeitos mutagênicos e aumento do risco de alterações malignas. Assim, para uma maior compreensão sobre a genotoxicidade desse fármaco quando usado em tratamento de pacientes com DF, pode ser empregado o monitoramento dos pacientes com metodologias de avaliação de danos ao DNA.[7]

A avaliação de danos ao DNA pode ser investigada pelo ensaio de micronúcleo citoma com bloqueio da citocinese (CBMN-cit) em células mononucleares do sangue periférico, sendo um método amplamente utilizado para estudos de genotoxicidade. Neste ensaio, pode-se quantificar a formação de micronúcleos (MN), que são um tipo de marcador de dano cromossômico que tem sua origem a partir de fragmentos de cromossomos ou cromossomos inteiros. Adicionalmente, brotos nucleares (NBUDs - nuclear buds ), biomarcadores de amplificação gênica, e pontes nucleoplásmicas (NPBs - nucleoplasmic bridges ), que frequentemente correspondem a cromossomos dicêntricos, também podem ser avaliados.[8]

OBJETIVO

Avaliar a indução de danos ao DNA por meio do ensaio de micronúcleo citoma com bloqueio da citocinese em células mononucleares do sangue periférico de pacientes com doença falciforme SS e SC tratados com hidroxiureia.

MÉTODOS

Seleção dos sujeitos da pesquisa

O presente estudou foi realizado no período de agosto de 2015 a janeiro de 2018. Foram convidados a participar da pesquisa os pacientes com DF atendidos no Hemocentro Regional de Governador Valadares da Fundação Hemominas, em Minas Gerais. A área de abrangência do hemocentro compreende as regiões dos Vales do Aço, Rio Doce, Mucuri, Jequitinhonha e parte da Zona da Mata. Os pacientes foram incluídos na pesquisa após manifestarem o consentimento pela assinatura de Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) e/ou Termo de Assentimento (TA), quando apropriado. Foram excluídos da pesquisa pacientes gestantes, que faziam uso crônico de outros medicamentos, além da HU, que apresentaram testes sorológicos positivos para HIV, hepatite B e C ou que apresentaram comprometimento hepático ou renal graves, além dos pacientes que receberam transfusão sanguínea em período inferior a 100 dias.

Os sujeitos da pesquisa foram divididos em dois grupos, sendo um de 22 pacientes com DF genótipos SS e SC, tratados com HU (Grupo HU) e o Grupo Controle, composto por 24 pacientes com DF que não eram tratados com o fármaco.

A pesquisa seguiu o protocolo aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal de Juiz de Fora (CAAE: 29058814.4.0000.5147, processo número 718.344).

Obtenção de células mononucleares do sangue periférico

De cada indivíduo, foram coletados aproximadamente 5mL de sangue venoso periférico em tubos contendo EDTA como anticoagulante e, em seguida, foram separadas as células mononucleares, adicionando, em tubos cônicos, 4mL de Histopaque®-1077 (Sigma-Aldrich®) e 4mL de sangue total, centrifugando a 400×g, por 30 minutos, a 25ºC. A faixa de interface contendo células mononucleares foi lavada com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e, a seguir, coletada após 10 minutos de centrifugação a 250×g. Os pellets resultantes foram suspensos novamente em meio RPMI 1640 e transferidos para frascos de cultura celular na densidade de 1×10[5] células/mL.

Avaliação da genotoxicidade

A avaliação da genotoxicidade foi realizada por meio do ensaio CBMN-cit, realizado de acordo com o protocolo de Fenech[9] com pequenas modificações. As células mononucleares do sangue periférico foram cultivadas em frascos de cultura contendo meio RPMI 1640, 20% de soro fetal bovino, 0,6% de fitoemaglutinina A (Sigma-Aldrich®), 1% de L-glutamina (Sigma-Aldrich®) e 1% de penicilina-estreptomicina (Gibco®), incubadas em estufa a 37°C com 5% de dióxido de carbono. Após 44 horas de incubação, foi adicionada a citocalasina B (Sigma-Aldrich®) na concentração de 6,0µg/mL, mantendo as culturas incubadas por mais 28 horas.

Após o tempo de incubação foi realizada a coleta celular, transferindo a suspensão celular para tubos cônicos e fixando as células em metanol/ácido acético 3:1, e adicionando tratamento hipotônico em solução de citrato a 0,01%. As lâminas foram preparadas e coradas com laranja de acridina (Sigma-Aldrich®), tendo sido analisadas em microscópio de florescência.

Para cada indivíduo, uma cultura celular foi realizada e, desta cultura, duas lâminas foram confeccionadas, sendo analisadas 2.000 células binucleadas quanto a presença dos biomarcadores de danos ao DNA (número de células binucleadas com MN, NPBs e NBUDs). Todas as lâminas da pesquisa foram analisadas por um único examinador. Os resultados da frequência dos biomarcadores MN, NPBs e NBUDs foram apresentados por 1.000 células binucleadas. Para cada indivíduo, 500 células foram analisadas e classificadas como mononucleadas, binucleadas, trinucleadas e multinucleadas (quatro ou mais núcleos) para determinação do Índice de Divisão Nuclear (IDN).

Análise estatística

Os dados obtidos foram expressos com média±desvio padrão e analisados por meio do software estatístico GraphPad Prism ® Version 6.01, aplicando o teste t pareado, para comparar os resultados entre os pacientes com DF, SS ou SC tratados com HU, e aqueles não tratados com tal fármaco. O critério de significância utilizado foi de p<0,05.

RESULTADOS

No total, foram avaliados 46 pacientes, com o Grupo HU composto por 22 indivíduos com DF (19 SS e 3 SC) tratados com HU, sendo 12 do sexo masculino, com idade entre 6 e 59 anos (média 25,4 anos), recebendo HU por via oral a 7,5 a 19,5mg/kg/dia (média de 12,8mg/kg/dia) entre 12 e 82 meses (média de 44 meses). O Grupo Controle foi composto por 24 indivíduos com DF (14 SS e 10 SC) não tratados com HU, sendo 15 do sexo masculino, com idade entre 4 e 52 anos (média 17,6 anos) ( Tabela 1 ).

Tabela 1

Idade, dose utilizada e tempo de tratamento com hidroxiureia nos pacientes com doença falciforme

Parâmetro	Grupo HU*			Grupo Controle*
	n=22			n=24
	Média	Min.	Max.	Média	Min.	Max.
Idade, anos	25,4	6	59	17,6	4	52
Dose de HU, mg/kg/dia	12,8	7,5	19,5
Tempo de tratamento, meses	44	12	82

* Grupo HU correspondeu a pacientes com doença falciforme SS ou SC tratados com hidroxiureia, e Grupo Controle correspondeu a pacientes com doença falciforme SS ou SC não tratados com hidroxiureia. HU: hidroxiureia; Min: mínimo; Max: máximo.

Os marcadores de danos ao DNA avaliados não apresentaram diferenças significativas entre o grupo de pacientes usando HU e aqueles sem o uso do fármaco ( Figura 1 ; todos p>0,05). Obteve-se frequência média de MN por 1.000 células igual a 8,591±1,568 no Grupo HU e de 10,04±1,003 no Grupo Controle. A frequência média de NPBs por 1.000 células para o Grupo HU foi de 0,4545±0,1707 e 0,5833±0,2078 para o Controle. A média observada dos NBUDs por 1.000 células e o IDN para os Grupos HU e Controle foram 0,8182±0,2430 e 0,9583 ± 0,1853, e 1,744±0,02607 e 1,932±0,02691, respectivamente.

Figura 1

Avaliação do efeito de genotoxicidade por meio do ensaio de micronúcleo citoma com bloqueio da citocinese em células mononucleares de sangue periférico de pacientes com doença falciforme SS ou SC tratados com hidroxiureia (Grupo HU; n=22) e não tratados com esse fármaco (Grupo Controle; n=24). Frequência média de micronúcleos (MN): (A) pontes nucleoplasmáticas (NPBs); (B) brotos nucleares (NBUDs); (C) e Índice de Divisão Nuclear (IDN); (D) em células binucleadas (BN). Não houve diferença significativa entre os grupos estudados (p>0,05) de acordo com o teste t pareado

DISCUSSÃO

A HU é amplamente utilizada no manejo clínico de pacientes com DF, mas os riscos relacionados ao seu uso prolongado ainda estão sendo avaliados, especialmente seu potencial carcinogênico.

Os indicadores de genotoxicidade permitem avaliar os efeitos de exposições ao material genético que levem à lesão no DNA, e à avaliação de mutações gênicas e danos cromossômicos. Alguns ensaios de avaliação de genotoxicidade compreendem aberrações cromossômicas, troca de cromátides irmãs, mutações reversas, ensaio cometa, e análise de MNs, NPBs e NBUDs. Essas análises, como a da frequência de MNs, NPBs, NBUDs, aplicando a metodologia CBMN-cit em linfócitos humanos, pode auxiliar em exames preditivos para risco de câncer.[8 , 10]

As preocupações sobre o potencial carcinogênico da HU devem-se a este fármaco também ser um conhecido agente antineoplásico, e há dados da literatura em que os pacientes apresentaram aumento de danos ao DNA em células sanguíneas.[11 , 12]

Existem relatos conflitantes sobre o potencial de dano ao DNA em humanos expostos à HU. Alguns estudos mostraram que a substância é genotóxica, enquanto outros sugerem que a HU tem baixa mutagenicidade in vivo , o que enfatiza a necessidade de pesquisas sobre a segurança a longo prazo da administração da HU.[11 , 13 , 14]

Alguns estudos mostraram resultados em que houve aumento de danos ao DNA em células sanguíneas de pacientes tratados com a HU em comparação com o Grupo Controle. Friedrisch et al.,[14] usaram o ensaio cometa para analisar leucócitos do sangue periférico de 28 pacientes com DF tratados com HU, e de 28 indivíduos sem DF, e encontraram maiores níveis de danos no DNA no grupo de pacientes tratados com HU. Entretanto, neste estudo de Friedrisch et al.,[14] não é possível distinguir se os efeitos observados são decorrentes da exposição à HU ou decorrentes da própria doença, como sugerido por Rodriguez et al.[7] Adicionalmente, outro estudo apresentou dados referentes a 293 amostras de sangue de 105 crianças, em uma mediana de 2 anos de terapia com HU, na qual a exposição ao fármaco foi associada a frequências significativamente aumentadas de MN em reticulócitos, que refletem os danos cromossômicos que ocorreram nos eritroblastos.[15]

Entretanto, os resultados do presente estudo mostraram que na população de pacientes com DF avaliada não houve aumento significativo de danos ao DNA nas células sanguíneas dos pacientes tratados com a HU.

Semelhante aos nossos achados, alguns relatos na literatura indicam condições de tratamento em que a HU não levou à indução de danos ao DNA. Rodriguez et al.,[7] utilizando teste de cometa, não encontraram diferença significativa nos danos ao DNA entre pacientes com DF, tratados ou não tratados com HU, em doses ≤30mg/kg/dia. Utilizando o ensaio do CBMN-cit em linfócitos, Maluf et al.,[16] encontraram pequeno aumento no número de MN no grupo de pacientes tratados com HU, correlacionado com o tempo do tratamento e a dose final de HU. Em nosso estudo, em que os pacientes utilizaram doses de HU de até 19,5mg/kg/dia, a frequência de MNs, NPBs, NBUDs foi semelhante entre o grupo de pacientes tratados com HU e o Grupo Controle.

CONCLUSÃO

O presente estudo apontou para a segurança do uso da hidroxiureia em um período médio de 44 meses, e em doses de até 19mg/kg/dia por pacientes com doença falciforme, uma vez que não foram encontradas diferenças significativas nos marcadores de genotoxicidade entre o grupo de pacientes com doença falciforme usando ou não o fármaco. Embora existam evidências de genotoxicidade mensurável devido à exposição à hidroxiureia em pacientes, esta pode estar relacionada a situações específicas como doses elevadas, longos períodos de tratamento ou faixa etária dos pacientes.