22q11.2 deletion detected by in situ hybridization in Mexican patients with velocardiofacial syndrome-like features.

INTRODUCTION: Deletion 22q11.2 occurs in 1:4,000-1:6,000 live births while 10p13p14 deletion is found in 1:200,000 newborns. Both deletions have similar clinical features such as congenital heart disease and immunological anomalies.
OBJECTIVE: We looked for a 22q11.2 deletion in Mexican patients with craniofacial dysmorphisms suggestive of DiGeorge or velocardiofacial syndromes and at least one major phenotypic feature (cardiac anomaly, immune deficiency, palatal defects or development delay).
METHODS: A prospective study of 39 patients recruited in 2012-2015 at the Instituto Mexicano del Seguro Social at Guadalajara, Mexico. The patients with velocardiofacial syndrome-like features or a confirmed tetralogy of Fallot (TOF) or complex cardiopathy were studied by G-banding and fluorescence in situ hybridization (FISH) with a dual TUPLE1(HIRA)/ARSA or TUPLE1(22q11)/22q13(SHANK3) probe, six patients without the 22q11.2 deletion (arbitrarily selected) were tested with the dual DiGeorge II (10p14)/D10Z1 probe.
RESULTS: Twenty-two patients (7 males and 15 females) had the 22q11.2 deletion and 17/39 did not have it; no patient had a 10p loss. Among the 22 deleted patients, 19 had congenital heart disease (mostly TOF). Twelve patients without deletion had heart defects such as TOF (4/12), isolate ventricular septal defect (2/12) or other disorders (6/12).
CONCLUSION: In our small sample about ~56% of the patients, regardless of the clinical diagnosis, had the expected 22q11.2 deletion. We remark the importance of early cytogenetic diagnosis in order to achieve a proper integral management of the patients and their families.

Introduction

The 22q11.2 deletion is a common constitutional imbalance, occurs in 1:4,000-1:6,000 live births, and usually detected by molecular techniques. Ninety percent of these patients have a loss of ∼3 Mb, 8% have a loss of ∼1.5 Mb, and 2% have atypical losses . These patients exhibit various phenotypes and generally are karyotyped because of a clinical suspicion of DiGeorge syndrome, DGS (OMIM 188400), velocardiofacial syndrome, VCFS (OMIM 192430), 22q11.2 deletion syndrome (22q11.2DS) or conotruncal anomaly (OMIM 217095). Indeed, the alternative term CATCH22 (acronym from Cardiac abnormality/Abnormal facies, T cell deficit, Cleft palate and Hypocalcemia) attempts to encompass such a clinical variability. Most patients have a normal karyotype on GTG-bands. Fluorescence in situ hybridization (FISH) is the most used technique for diagnosis because of its high sensitivity and relative low cost . The usual 22q commercial probes target the segment between low copy repeats LCR22A and LCR22B but cannot precise the size of the deletion. Other techniques such as multiplex ligation-dependent probe amplification, array comparative genomic hybridization, and analysis of copy number variation are useful to define the size of the deletion . In addition, 10p13p14 deletions (OMIM 601362) have been related to the so-called DiGeorge-like syndrome that includes similar cardiac and immunological defects , . There are ~23 patients reported with a DiGeorge-like syndrome and a 10p interstitial deletion including 10p13 and/or 10p14 - . Moreover, a single patient with a severe phenotype had concomitant 10p and 22q deletions .

We looked for a 22q11.2 deletion in 39 Mexican patients with craniofacial dysmorphisms suggestive of DGS or VCFS and at least one major phenotypic feature, namely cardiac anomaly, immune deficiency, palatal defects or development delay .

Materials and Methods

Thirty-nine patients with a clinical suspicion of DGS, VCFS, CATCH22, 22q11.2DS or a confirmed diagnosis of tetralogy of Fallot (TOF) or complex cardiopathy were recruited in the 2012-2015 period. All patients include in this study were evaluated by a clinical geneticist and a pediatric cardiologist. Chromosomes were obtained from peripheral blood lymphocyte cultures and stained for GTG-bands (at a resolution of ~400 bands per haploid set) or subjected to FISH with a dual probe TUPLE1(HIRA) spectrum orange/ARSA spectrum green, Vysis®) or TUPLE1 (22q11)/22q13(SHANK3), Kreatech®). Finally, 6/17 cases without 22q11.2 deletion and arbitrarily selected were tested using the locus-specific 10p13p14 dual probe DiGeorge II (10p14/D10Z1) from Kreatech®. We also studied one patient´s parent, i.e., a mother with a heart defect. For each FISH assay, we analyzed at least 10 metaphases and/or 30 interphase nuclei.

This project was approved by our institutional research and ethics committees (R-2012-1305-12) on 02 October 2012.

Results

Twenty-three patients were female and 16 were male; their ages ranged from one month to 21 years and the mean age at ascertainment was ~six years. Among the 39 patients, 31 had heart disease and eight had no heart defect. Except for a single mother with an unspecified cardiopathy, all patients’ parents were seemingly healthy and not further studied. FISH studies showed that 22 (7 males and 15 females) out of 39 patients had the 22q11.2 deletion (Fig. 1).

Figure 1

A partial metaphase after FISH with a dual TUPLE1 red spectrum /ARSA green spectrum probe (Vysis®). The normal 22 chromosome had red and green signals meanwhile the deletion 22q11.2 chromosome lacked the red signal and had only the green one.

All 22 deleted patients had craniofacial dysmorphisms suggestive of DGS or VCFS and at least one major phenotypic feature. A heart anomaly, mainly a conotruncal defect, was documented in 86% (19/22). The conotruncal defects observed in 14/19 patients were TOF (10/14), ventricular septal defect+pulmonary atresia (3/14), and double-outlet right ventricle (1/14). The remaining five patients had a non-conotruncal defect each: atrial septal defect+aortic valve insufficiency, mitral valve prolapse, patent ductus arteriosus, ventricular septal defect+atrial septal defect+overriding aorta, and isolate ventricular septal defect. Eighty-two percent (18/22) had cognitive impairment or development delay: 10/18 intellectual disability, 4/18 learning difficulties, and 4/18 language delay. Palatal abnormalities and immunodeficiency were seen in 23% (5/22) and 14% (3/22), respectively (Table 1). Among the 17 non deleted patients, 12 had heart defects such as TOF (4/12), isolate ventricular septal defect (2/12) or other anomalies (6/12). All six patients without 22q11.2 deletion and tested for a 10p loss were negative. According to specific clinical suspicions, the ratio of patients with a proven 22q11.2 deletion was as follows: 3/5 with DGS, 9/14 with VCFS, 2/5 with CATCH22, 3/7 with 22q11.2DS, 2/3 with TOF, and 3/5 with complex cardiopathy. Three patients without the 22q11.2 deletion had an abnormal G-banded karyotype: 46,XX,r(22)(p12q11.2).ish r(22)(TUPLE1+,ARSA-), 46,XX,rec(22)dup(22q)inv(22)(p11.2q13.2)pat, and 47,XX,+18.

Table 1

Major phenotypic features in 22 Mexican patients with SD22q11.2

Items	n	%
Total deleted patients	22	100
Congenital heart disease	19/22	86
Conotruncal defect	14/19
-TOF	10/14
-VSP + PA	3/14
-DORV	1/14
Non-conotruncal defect	5/19
Cognitive impairment or development delay	18/22	82
Intellectual disability	10/18
Learning difficulties	4/18
Language delay	4/18
Palatal abnormalities	5/22	23
Immunodeficiency	3/22	14

TOF: Tetralogy of Fallot,

VSD: Ventricular septal defect,

PA: Pulmonary atresia,

DORV: Double-outlet right ventricle

Discussion

The relative excess of female patients with the 22q11.2 deletion in this study contrasts with similar sex rates previously reported and even more with the 60% ratio of males in another study . Regardless of the clinical diagnosis, the deletion 22q11.2 was found in 56% of our patients, a figure within the reported range from 6% to 66% . The concomitance rate (86%) of 22q11.2 deletion and heart defect (mainly TOF) found in the present study clearly exceeds previous estimates but agrees with similar findings in a larger sample of Mexican patients and may therefore be a reliable predictor of the deletion in our population , . These data contrast with the low rate of 22q11.2 deletion found in Brazilian patients with unselected heart defects . The lack of 10p13p14 deletions in our study can be ascribed to the rarity of this imbalance, the reduced sample size, and our selection criteria. Indeed, such a deletion should be looked for mainly in patients with atrial septal defect and immunological disorders . Incidentally, two other imbalances diagnosed by G-bands involved the 22 chromosome but had no 22q11.2 deletion. Ring chromosomes similar to the r(22)(p12q11.2) with a distal deletion here described, have been found in more than 60 patients who mainly exhibited intellectual disability, speech delay, seizures, autism, hyperactivity, and microcephaly . Because some of these features overlap with the wide clinical variability of patients with 22q11.2DS, the precise diagnosis can be challenging. Another patient with a rec(22)dup(22q)inv(22)(p11.2q13.2)pat had a 22q13.2→qter duplication, an imbalance seemingly frequent in Mexico. Moreover, our finding of trisomy 18 in one patient confirms that imbalances for other chromosomes can incidentally be diagnosed in some patients with velocardiofacial syndrome like features but who lack the expected 22q11.2 deletion.

Conclusion

We conclude that in our small sample about ~56% of the patients, regardless of the clinical diagnosis, had the expected 22q11.2 deletion. Hence, we remark the importance of early cytogenetic diagnosis in order to achieve a proper integral management of the patients and their families. As for patients without a 22q11.2 or 10p13p14 deletion, they should be analyzed with techniques of higher resolution.

Introducción

La deleción 22q11.2 es un desequilibrio constitucional común, ocurre en 1: 4,000-6,000 nacidos vivos, y generalmente se detecta mediante técnicas moleculares. El 90% de estos pacientes tiene una deleción de ~3 Mb, el 8% de ~1.5 Mb, y el 2% tiene deleciones atípicas .

Estos pacientes presentan fenotipo variable y en general, se les realiza cariotipo por la sospecha clínica del síndrome DiGeorge, DGS (OMIM 188400), síndrome velocardiofacial, VCFS (OMIM 192430), síndrome de deleción 22q11.2 (22q11.2DS) o anomalía conotruncal (OMIM 217095). De hecho, el término alternativo CATCH22 (acrónimo de anormalidad cardíaca / facies anómala, hipoplasia de timo, paladar hendido e hipocalcemia) intenta englobar dicha variabilidad clínica. La mayoría de los pacientes tienen un cariotipo normal con bandas GTG. La hibridación fluorescente in situ (FISH) es la técnica más utilizada para el diagnóstico debido a su alta sensibilidad y bajo costo relativo . Las sondas comerciales comunes de 22q detectan al segmento entre las LCRs (repeticiones de bajo número de copias) LCR22A y LCR22B pero no pueden precisar el tamaño de la deleción. Otras técnicas tales como MLPA (amplificación de sondas dependiente de ligandos múltiples), aCGH (matriz de hibridación genómica comparativa) y análisis de CNVs (variación en el número de copias) son útiles para definir el tamaño de la deleción . Además, las deleciones en 10p13p14 (OMIM 601362) se han relacionado con el síndrome DiGeorge-Like que incluye defectos cardiacos e inmunológicos similares ,. Existen ~23 pacientes reportados con síndrome DiGeorge-like y una deleción intersticial de 10p que incluye 10p13 y / o 10p14 -. Además, un paciente con fenotipo grave tuvo deleciones concomitantes en 10p y 22q .

Nosotros buscamos la deleción 22q11.2 en 39 pacientes mexicanos con dismorfias craneofaciales sugestivas de DGS o VCFS y al menos una característica fenotípica mayor, a saber, anomalía cardíaca, deficiencia inmunológica, defectos palatinos o retraso en el desarrollo .

Materiales y Métodos

Treinta y nueve pacientes con sospecha clínica de DGS, VCFS, CATCH22, 22q11.2DS o con un diagnóstico confirmado de tetralogía de Fallot (TOF) o cardiopatía compleja fueron reclutados en el período del 2012-2015. Todos los pacientes incluidos en este estudio fueron evaluados por un genetista clínico y un cardiólogo pediatra. Los cromosomas se obtuvieron a partir de cultivos de linfocitos de sangre periférica y se tiñeron para bandeo GTG (a una resolución de ~400 bandas por conjunto haploide) o se sometieron a FISH con una sonda doble TUPLE1 (HIRA) espectro orange/ARSA espectro green, Vysis®, o TUPLE1 (22q11)/22q13 (SHANK3), Kreatech®. Finalmente, en 6/17 casos sin deleción 22q11.2 y seleccionados arbitrariamente se usó la sonda dual 10p13p14 específica del locus DiGeorge II (10p14/D10Z1) de Kreatech®. También estudiamos a uno de los padres de un paciente, es decir, una madre con defecto cardíaco. Para cada ensayo de FISH, analizamos al menos 10 metafases y/o 30 núcleos de interfase.

Este proyecto fue aprobado por nuestra institución de investigación y comités de ética (R-2012-1305-12) el 2 de octubre de 2012.

Resultados

Veintitrés pacientes eran mujeres y 16 hombres; sus edades variaron de un mes a 21 años y la edad promedio en la evaluación fue de ~seis años. De los 39 pacientes, 31 tenían alguna cardiopatía y ocho no presentaban ningún defecto cardíaco. A excepción de una madre de paciente con cardiopatía no especificada, todos los progenitores de los pacientes parecían estar sanos por lo que no fueron estudiados. El estudio por FISH mostró 22 (7 hombres y 15 mujeres) de 39 pacientes tenían la deleción 22q11.2 (Figura 1).

Figura 1

Metafase parcial hibridada con una sonda dual TUPLE1 (roja)/ARSA (verde) de Vysis®. El cromosoma 22 normal tiene señales roja y verde mientras que el cromosoma 22 con la deleción en q11.2 carece de la señal roja y sólo presenta la señal verde.

Los 22 pacientes con deleción tenían dismorfias craneofaciales sugestivas del DGS o VCFS y al menos una característica fenotípica mayor. La anomalía cardiaca, principalmente defecto conotruncal, se observó en el 86% (19/22). Los defectos conotruncales observados en 14/19 pacientes fueron TOF (10/14), defecto del septo ventricular + atresia pulmonar (3/14) y doble salida del ventrículo derecho (DSVD) (1/14). Los cinco pacientes restantes tenían un defecto no conotruncal: defecto del septo auricular + insuficiencia de la válvula aórtica, prolapso de la válvula mitral, persistencia del conducto arterioso, defecto del septo ventricular + defecto del septo auricular + cabalgamiento de la aorta y defecto del septo ventricular aislado. El 82% (18/22) tuvo deterioro cognitivo o retraso en el desarrollo: discapacidad intelectual 10/18, dificultades de aprendizaje de 4/18 y retraso del lenguaje. Se observaron anomalías palatinas e inmunodeficiencia en el 23% (5/22) y 14% (3/22), respectivamente (Tabla 1). Entre los 17 pacientes sin deleción, 12 tenían defectos cardíacos como TOF (4/12), defecto del septo ventricular aislado (2/12) u otras anomalías (6/12). Los seis pacientes sin deleción 22q11.2 y evaluados para la deleción en 10p fueron negativos. De acuerdo con las sospechas clínicas específicas, la proporción de pacientes con una deleción comprobada de 22q11.2 fue la siguiente: 3/5 con DGS, 9/14 con VCFS, 2/5 con CATCH22, 3/7 con 22q11.2DS, 2/3 con TOF y 3/5 con cardiopatía compleja. Tres pacientes sin la deleción 22q11.2 tenían un cariotipo anormal: 46,XX,r(22)(p12q11.2).ish r(22)(TUPLE1+, ARSA-), 46,XX,rec(22)dup(22q)inv(22)(p11.2q13.2)pat, y 47,XX,+18.

Tabla 1

Características fenotípicas mayores en 22 pacientes mexicanos con el 22q11.2DS

Característica	n	%
Pacientes con la deleción 22q11.2	22	100
Defecto cardiaco congénito	19/22	86
Defecto conotruncal	14/19
-TOF	10/14
-DSV + AP	3/14
-DSVD	1/14
Otro defecto	5/19
Discapacidad intelectual o retardo en el desarrollo	18/22	82
Discapacidad intelectual	10/18
Dificultad en el aprendizaje	4/18
Retardo en el lenguaje	4/18
Anomalías palatinas	5/22	23
Inmunodeficiencia	3/22	14

TOF: Tetralogía de Fallot,

DSV: Defecto del septo ventricular,

AP: Atresia pulmonar,

DSVD: Doble salida de ventrículo derecho.

Discusión

El exceso de pacientes mujeres con la deleción 22q11.2 en este estudio contrasta con lo reportado en la literatura y aún más con la proporción del 60% de hombres en otro estudio6. Independientemente del diagnóstico clínico, se encontró la deleción 22q11.2 en el 56% de nuestros pacientes, una cifra dentro del rango informado de 6% a 66% . La tasa de concomitancia (86%) de la deleción 22q11.2 y el defecto cardíaco (principalmente TOF) encontrada en el presente estudio supera claramente las estimaciones previas, pero concuerda con hallazgos similares en una muestra más grande de pacientes mexicanos y, por lo tanto, puede ser un predictor confiable de la deleción en nuestra población ,. Estos datos contrastan con la tasa baja de deleción 22q11.2 encontrada en pacientes brasileños con defectos cardiacos no seleccionados . La falta de deleciones en 10p13p14 en nuestro estudio se puede atribuir a la rareza de este desequilibrio, al tamaño reducido de la muestra y a nuestros criterios de selección. De hecho, tal deleción debería buscarse principalmente en pacientes con defecto del septo auricular y trastornos inmunológicos2. Incidentalmente, otros dos desequilibrios diagnosticados por bandas G involucraban al cromosoma 22 pero no tenían deleción 22q11.2. Los cromosomas en anillo similares al r (22)(p12q11.2) con una deleción distal descrita aquí, se han encontrado en más de 60 pacientes que exhibieron principalmente discapacidad intelectual, retraso del habla, convulsiones, autismo, hiperactividad y microcefalia . Ya que algunas de estas características se superponen con la amplia variabilidad clínica de los pacientes con 22q11.2DS, el diagnóstico preciso puede ser un desafío. Otro paciente con un rec(22)dup(22q)inv(22)(p11.2q13.2)pat tuvo una duplicación de 22q13.2→qter, un desequilibrio aparentemente frecuente en México. Además, nuestro hallazgo de trisomía 18 en un paciente confirma que los desequilibrios para otros cromosomas pueden diagnosticarse incidentalmente en algunos pacientes con características similares al síndrome velocardiofacial, pero que carecen de la deleción 22q11.2 esperada.

Conclusión

Concluimos que en nuestra pequeña muestra ~56% de los pacientes, independientemente del diagnóstico clínico, tenían la deleción 22q11.2 esperada. Por lo tanto, destacamos la importancia del diagnóstico citogenético temprano para lograr un manejo integral adecuado de los pacientes y sus familias. Los pacientes sin deleción 22q11.2 o 10p13p14 deben analizarse con técnicas de mayor resolución.