Concordance analysis between different methodologies used for identification of oral isolates of Candida species.

BACKGROUND: The yeasts species determination is fundamental not only for an accurate diagnosis but also for establishing a suitable patient treatment. We performed a concordance study of five methodologies for the species identification of oral isolates of Candida in Colombia.
METHODS: Sixty-seven Candida isolates were tested by; API® 20C-AUX, Vitek®2 Compact, Vitek®MS, Microflex® and a molecular test (panfungal PCR and sequencing). The commercial cost and processing time of the samples was done by graphical analysis.
RESULTS: Panfungal PCR differentiated 12 species of Candida, Vitek®MS and Microflex® methods identified 9 species, and API® 20C-AUX and Vitek®2 Compact methods identified 8 species each. Weighted Kappa (wK) showed a high agreement between Panfungal PCR, Vitek®MS, Microflex® and API® 20C-AUX (wK 0.62-0.93). The wK that involved the Vitek®2 Compact method presented moderate or good concordances compared with the other methods (wK 0.56-0.73). Methodologies based on MALDI TOF MS required 4 minutes to generate results and the Microflex® method had the lowest selling price.
CONCLUSION: The methods evaluated showed high concordance in their results, being higher for the molecular methods and the methodologies based on MALDI TOF. The latter are faster and cheaper, presenting as promising alternatives for the routine identification of yeast species of the genus Candida.

Introduction

The genus Candida consists of a group of ubiquitous yeasts with diverse characteristics. The best-known species in the group is Candida albicans, as it is the main species related to most yeast infections in humans, however, an increase in the number of infections caused by species different from C. albicans has been observed. These emerging species have become more important, since some have profiles of resistance to commonly used antifungal drugs, especially azoles and echinocandins . Based on the above, the correct identification of yeasts of the genus Candida is one of the greatest challenges at present, because this could delay the establishment of suitable treatment in patients with invasive fungal infections. For this reason, it is necessary to have fast and accurate tests for identification of clinical isolates .

Currently, there are several methodologies for the identification of yeasts, some using chromogenic medias such as CHROMagar™ Candida, that allow a presumptive identification of the most common and relevant clinical species (C. albicans and C. tropicalis). It is important to know that many authors emphasize the importance of complementing such identification with other phenotypic tests that allow species confirmation . Similarly, there are commercial systems such as API® 20 C AUX or Vitek® 2 Compact system for the identification of yeasts, using methodologies that are based on biochemical identification. They have the disadvantage that they can generate misidentification due to the lack of experience of the laboratory technician in the interpretation of results, and with some frequency these systems are not able to differentiate species with similar biochemical profiles, because some emergent species are not included in their databases . Mass spectrometry, based on the matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight (MALDI TOF) methodology, has emerged as a valuable method for the identification of microorganisms, and with good performance in the identification of yeasts, for its speed and precision , . For these reasons, this technology has been used more frequently in clinical laboratories, the commercial systems Microflex® (Bruker Daltonics GmbH, Leipzig, Germany) and Vitek® MS (bioMérieux, Marcy, L'Etoile, France) being the most popular , .

Other methodologies employ molecular techniques based on the sequencing of nucleic acids, which has been used as a reference method to make comparisons with other identification tests, because it provides more accurate identification , . Additionally, sequencing techniques permit the identification of cryptic species such as C. orthopsilosis, C. nivariensis, or C. bracarensis with high precision, which frequently exhibit resistance to antifungal agents . As a limitation, the use of DNA sequencing techniques is limited to laboratories with special spaces, has equipment requirements, and requires highly trained personnel .

Considering that there are few studies that have analyzed the concordance of yeasts identification methods of, the principal aim of this study was to evaluate the concordance between five different methods, based on biochemical testing, mass spectrometry and DNA sequencing, that are used for the identification of yeasts of the genus Candida.

Materials and Methods

Population and study site

Oral rinses were obtained during the 2014 from 98 healthy adult individuals attending at the Universidad Antonio Nariño dental clinics, located in nine Colombian cities (Armenia, Bogota, Bucaramanga, Cucuta, Ibagué, Neiva, Palmira, Popayan and Villavicencio). These individuals did not have known systemic disease, although some had localized pathological processes. Samples from patients with systemic disease and from patients receiving antibiotic, antifungal or corticosteroid treatment in the last 6 months were excluded from the analyses.

Isolates

Mouthwashes were immediately submitted to the Laboratory of the Medical and Experimental Mycology Unit, at the Corporación para Investigaciones Biológicas (CIB) in Medellín, Colombia. Samples were processed using Sabouraud Dextrosa™ agar with antibiotics (BD™, reference 210950) and with CHROMagar™ Candida (CHOMagar Microbiology, Paris, France) , which allowed verification of the possibility of mixed infections by several species of Candida from the primary cultures. The cultures were incubated at 25° C for 20 days, with weekly readings to evaluate the type of growth. The recovered isolates (n= 67) were stored in sterile distilled water at 4° C and in a medium composed of skim milk (BD™, reference 232100) at -20° C.

Identification of yeast

Identification of the isolates was performed using the following methodologies: 1) CHROMagar™ Candida (CHOMagar Microbiology, Paris, France). 2) API® 20 C AUX (bioMérieux, Marcy, L'Etoile, France). 3) Vitek® 2 Compact automated system (bioMérieux, Inc., Hazelwood, MO, USA). 4 and 5) Mass spectrometry based on the MALDI TOF MS (matrix assisted laser desorption / ionization) technique in Vitek® MS (bioMérieux, Marcy, L'Etoile, France) and Microflex® (Bruker Daltonics GmbH, Leipzig, Germany). 6) Polymerase Chain Reaction (PCR) Panfungal and sequencing.

Methodologies used for the identification of yeasts

1. CHROMagar™ Candida: After surface growth on this medium, the color of each of the colonies was checked to classify them according to the following characteristics: C. albicans/dubliniensis complex colonies showed medium to light green color, C. tropicalis blue colonies, and other species presented pink or light to dark lilac color, or their natural cream color , .

2. API® 20 C AUX: Testing was performed following the manufacturer's recommendations (bioMérieux, Marcy-l'Etoile, France) . After the incubation period (48 h at 25° C), panels were checked visually. The numerical profile obtained for each isolate was interpreted using the ApiwebTM software (bioMérieux, reference: 40 011).

3. Vitek® 2 Compact: The inoculum was prepared in 3 mL of 0.45% saline solution, using a pure culture of no more than 24 h growth. The suspension was adjusted to a McFarland turbidity range of 1.8-2.2 using the DensiCheck®. The final inoculum was automatically dispensed into the kit identification cards (YST, reference: 21343), and incubated using the Vitek® 2 Compact equipment (bioMérieux, Durham, NC). The final identification was classified as follows: "excellent," "very good," "good," "acceptable," or "with low discrimination," depending on confidence level and percentage of discrimination for each identification provided by the equipment’s software .

4. MALDI TOF MS: This was done using two commercial platforms; the Vitek® MS equipment (bioMérieux, Marcy, L'Etoile, France) and the Microflex® (Bruker Daltonics GmbH, Leipzig, Germany) Biotype Library 3.0. The methodological details corresponding to each commercial method are described below.

4.1 Vitek® MS: A single pure colony (growth 24-72 h) was deposited in a single well of the Vitek® MS plate. Cells were lysed with 0.5 μL of 25% concentration formic acid (Ref: 411072) and allowed to dry at room temperature (1-2 min). After drying, 1 μL of the CHCA matrix (bioMérieux, Marcy, L'Etoile, France, reference: 411071) was added. Tests were performed after the final mixture was completely dry. The peak spectrum was analyzed using the MS-ID server (MS-ID [CE / IVD] database) .

4.2 Microflex®: Isolates grown for no more than 24 h at 37( C were tested by direct extraction methodology in plate or by extraction with formic acid. For direct extraction, a single colony was deposited directly in the MALDI TOF plate, allowed to dry at room temperature; after dry, 1 μL of 100% concentration formic acid was added, and then was covered with 1 μl of HCAA matrix (α-cyano-4 hydroxycinnamic acid - HCCA). After drying for a second time at room temperature, the treated samples were analyzed using the Biotyper machine and the final mass spectra were analyzed using the FlexControl software (version 3.0) and the MALDI Biotyper RTC. Strains that had a low score in the direct test identification or in which the identification was not possible were extracted with formic acid, following the manufacturer's instructions (Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Germany) . Each sample was served in duplicate to verify the reproducibility.

5. Panfungal PCR and sequencing: The D1/D2 region of the 28S rRNA gene was amplified, following the international guidelines for molecular identification of fungi . The ITS 1-4 (Internal Transcribed Spacer) region was also amplified for the identification of cryptic species in Candida parapsilosis and Candida glabrata isolates . Genomic DNA was extracted from isolated colonies grown on Sabouraud agar using the QIAamp DNA mini kit (QIAGEN, Germantown, MD), following the manufacturer's recommendations. Molecular markers were amplified using primers and protocols previously described for the D1/D2 and ITS 1-4 regions , . Amplified products from the D1/D2 region (~ 600 bp) and the ITS region 1-4 (600-900 bp) were shipped to Macrogen laboratories (Maryland, USA) for sequencing. Editing and aligning of sequences were performed using the Sequencher 5.0 software (Gene Code Corporation). A search was made to establish similarity/homology in two databases: the NCBI (BLAST) (National Biotechnology Information Center, Washington, DC) and the CBS-KNAW (Fungal Diversity Center).

Methodological design and statistical analysis

Variables analyzed in this study were summarized by calculating both absolute and relative frequencies. A concordance analysis was performed to evaluate the agreement between different methods used for yeast identification. The Weighted Kappa (wK) values and their respective 95% confidence intervals (95% CI) were calculated. The concordance analysis was performed in two ways, as follows: The first analysis was done by regrouping the results obtained by the API® 20 C AUX, Vitek® 2 Compact, Vitek® MS, Microflex® and panfungal PCR and sequencing, in the following three categories of results: C. albicans/dubliniensis, C. tropicalis, and Candida spp different than Candida albicans/dubliniensis/tropicalis. This regrouped result was done to compare the five previous mentioned methodologies against the CHROMagar™ Candida. The second analysis compared the results of the API® 20 C AUX, Vitek® 2 Compact, Vitek® MS, Microflex® and panfungal PCR and sequencing, and in this second analysis the panfungal PCR and sequencing method was selected as the reference methodology. In addition, a cost/turnaround time results analysis was performed, using the sale price of the service and the turnaround time (excluding the times of the pre-analytical and post-analytical phases) from local laboratory providers in the city of Medellín, Colombia. Information was collected through telephone calls or email. Interpretation was performed using graphic analysis of the two variables (cost and turnaround time). Statistical analyses were performed using the statistical package STATA 8.0® and graphics using Microsoft Excel 2010® software.

Ethics

The protocol was approved by the ethical committees of the Universidad Antonio Nariño, Armenia - Quindío, Colombia.

Results

Sixty-seven Candida isolates were recovered from 98 oral rinses (68% positivity). In the initial analysis using the CHROMagar™ Candida the 67 isolates were classified as follows: 39 (58%) isolates as C. albicans/dubliniensis, 4 (6%) as C. tropicalis and 24 (36%) isolates such as Candida different than Candida albicans/dubliniensis/tropicalis. The first concordance analysis to compare the CHROMagar™ Candida against the other five methodologies (regrouped results) gave the following Weighted Kappa (wK) results: vs API® 20 C AUX = 1.00 (95% CI= 1.00-1.00); vs Vitek® 2 Compact = 0.87 (95% CI= 0.75-0.96); vs Vitek® MS= 0.92 (95% CI= 0.80-0.99); vs Microflex® = 0.97 (95% CI= 0.94-1.00); and vs panfungal PCR and sequencing = 0.98 (95% CI= 0.95-1.00).

In the results of yeast identification, excluding the CHROMagar™ Candida results, it was observed that Panfungal PCR and sequencing was the method that identified the largest number of species (n= 12), following by Mass spectrometry methods, Vitek® MS and Microflex®, which identified 9 different Candida species each, and finally the biochemical methods API® 20 C AUX and Vitek® 2 Compact, which identified 8 different Candida species each. The description of the species identified by each methodology is summarized in Figure 1.

Figure 1

Distribution of species classified according to the identification methodology.

The second concordance study showed a high concordance between the results obtained with Panfungal PCR and sequencing, Vitek® MS, Microflex® and API® 20 C AUX, these results were grouped into the good and very good categories. The wK that involved the Vitek® 2 Compact method were characterized by moderate or good results compared with the other methods (Panfungal PCR and sequencing, Vitek® MS, Microflex® and API® 20 C AUX). A detailed analysis of the concordances and discordances comparing all the methods is given in Table 1. Values of wK observed and their respective 95% CI are summarized in Figure 2.

Table 1

Comparison of concordances and discrepancies of the API® 20 C AUX, Vitek® 2 Compact, Vitek® MS and Microflex® against the reference method Panfungal PCR and sequencing.

	Reference method	API® 20 C AUX		Vitek® 2 Compact		Vitek® MS		Microflex®
	Panfungal PCR and sequencing (n)	C (n)	D (n)	C (n)	D (n)	C (n)	D (n)	C (n)	D (n)
C. albicans	35	33	2	34	1	33	2	35	0
C. parapsilosis	12	12	0	10	2	12	0	12	0
C. dubliniensis	6	2	4	6	0	5	1	5	1
C. glabrata	4	4	0	2	2	4	0	3	1
C. tropicalis	2	2	0	2	0	2	0	2	0
C. intermedia	2	0	2	0	2	2	0	1	1
C. guilliermondii	1	1	0	0	1	1	0	1	0
C. lusitaniae	1	0	1	1	0	1	0	1	0
C. haemulonii	1	0	1	1	0	1	0	1	0
C. lipolytica	1	0	1	0	1	0	1	0	1
C. fermentati	1	0	1	0	1	0	1	0	1
Pichia kluyveri	1	0	1	0	1	0	1	0	1
Total	67	54	13	56	11	61	6	61	6

n: número

C: concordances,

D: discrepancies

Figure 2

Concordance analysis of five methodologies for the identification of oral isolates of Candida species.

To confirm that the previous methods did not fail to detect species of the complex Candida parapsilosis and Candida glabrata, a PCR and sequencing analysis of the ITS 1-4 region was performed, determining no presence of cryptic species.

The analysis of costs/turnaround time results showed that the methods based on the MALDI TOF technology (Microflex® and Vitek® MS) required less time to generate a result (4 minutes), and in addition, the Microflex® method had the lower commercial cost (13 US Dollars). The panfungal PCR and sequencing was the method that required most time to generate a final report (3 days) and had the highest commercial value (86 USD). The analysis that compares the costs and turnaround time results for the tests evaluated in this report is summarized in Figure 3.

Figure 3

Results of the cost/turnaround time analysis.

Discussion

This study evaluated five different methodologies for the identification of clinical isolates of the Candida genus obtained from oral rinses. In general, we observed good concordance between the CHROMagar™ Candida and the other five methodologies evaluated in this study. The Vitek® 2 Compact method had the lowest agreement and the highest agreement was observed with the API® 20 C AUX. It is important to mention that use of CHROMagar™ Candida allows for identification of the presence of multiple species in the same clinical sample and gives a presumptive identification of the associated Candida species , .

Most of the five methods analyzed showed high concordances grouped into good and very good categories. Previous studies have shown that phenotypic methods, based on biochemical tests such as the API® 20 C AUX and the Vitek® 2 Compact system, are the most used in clinical laboratories , . In this study, it was observed that these two methods had the lowest capacity to differentiate Candida species and also presented lower values of wK, especially when comparing the Vitek® 2 Compact method with the other methodologies. Other authors have reported that these methods may present discrepancies in identifying less common Candida species and especially those that are closely related , . In addition, the accuracy of these methods is greatly reduced if the laboratory technician does not perform the additional tests required for the identification.

In our study, Panfungal PCR and sequencing was able to identify species such as Candida fermentati and Candida haemulonii, which are emerging species, recently classified as species complex, that are difficult to identify by conventional methods and whose identification can become a challenge, because these species have not been included in the databases of most of the different identification systems available , . In addition, some of these emerging species have shown a decrease in sensitivity to antifungal agents, and consequently, this increases the difficulty in the management of patients with invasive Candida infections - . In our study, none of the methodologies analyzed, except for Panfungal PCR and sequencing, had the ability to identify Candida lipolytica (n= 1), Candida fermentati (n= 1) and Pichia kluyveri (n= 1), species that have been reported mainly for industrial use, but, also have the capacity to behave as pathogens in humans according to host conditions , - .

The methodologies based on MALDI TOF (Microflex® and Vitek® MS) presented high concordance compared with the reference method, panfungal PCR and sequencing. The analysis of concordance between these two technologies showed a very good agreement, due to the fact that both systems identified the same number of species, but not all of them corresponded to the same species, since there were inconsistencies in the identifications in 6 of the 67 analyzed isolates. There are several platforms of MALDI TOF, and differences will depend on the libraries of mass spectra and the algorithms of identification that each platform has , . In this study the Microflex® was able to identify all the isolates at species level. When using the Vitek® MS spectrometer, three major discordances were observed (this platform was not able to determine the final identification at species level in three isolates), when compared with the reference method, affecting its wK value. Many studies have shown that these techniques are faster and more accurate in the identification of yeasts from crops, which has a high relevance in terms of time and costs , , .

The panfungal PCR and sequencing advantage is that this technique allows the identification of cryptic species or complex species, but it is recommended to combine the amplification of the D1/D2 region with other targets in the ITS region , . In this report, although the presence of cryptic species of Candida parapsilosis and Candida glabrata were not observed, it is important to use methodologies that are able to detect them, mainly due to the emergence of species that are difficult to manage , , . In addition, this technique would be the best option, despite its cost, for those identifications that are doubtful or where other methodologies have low discriminatory power.

When we analyzed the costs and turnaround time results, we could determine that the methods based on the MALDI TOF technology (Microflex® and Vitek® MS) were the ones that offered the least time for results, as previously reported, and when comparing this methodology with other conventional methods, our results also reflected a reasonable and competitive cost . It should be noted that this technology allows precise results, surpassing the conventional identification techniques , . This technology has shown great potential for fast and accurate identification, and this finding demonstrates the need to make its methodologies more available.

It is important to mention that delays can occur in the generation of results, as a result of factors that are not inherent to the methodology or external, such as the day that the isolation arrives in the laboratory, the viability of the isolate, the need for additional extraction steps, the days designated in the laboratory for sample processing, the availability of laboratory personnel, or turnaround time for sequencing analysis. Changes in some of these factors can make a significant difference when delivering a timely outcome and it would help to implement changes at the laboratory level to improve the different processes.

The present study was limited to the evaluation of Candida species isolated from oral mucosa. Although it was possible to show a wide variety of species identified between the different methods, it would be pertinent for future investigations to carry out the same evaluation in other clinical specimens. In addition, the cost and time analysis was only carried out in the city of Medellín, Colombia. In Colombia the number of laboratories that offer molecular methods or MALDI TOF technology is limited, which may increase the costs of these tests in a significant way, mainly due to the exclusivity of the service.

Conclusion

It is necessary to implement identification methods that facilitate access to fast and reliable results, but at the same time, help to optimize the economic resources once those are implemented in the daily routine. In this work, it was shown that the systems based on the MALDI TOF technology, despite being methodologies that initially required a substantial economic investment, proved to be fast, economical (commercial value of the test) and precise, which are presented as promising alternatives for the routine identification of yeasts of the Candida genus. For those laboratories not able to access molecular or mass spectrometry tests, the use of automated tests could be a good alternative if the laboratorian technician follows the specification provided by the manufacture, and pays special attention to those results that involve uncommon species or discrepant characteristics presented in the isolate (morphology, susceptibility patter and other additional taxonomy keys).

Introducción

Los hongos del género Candida son un grupo de levaduras ubicuas y con características muy diversas. Una de las especies más conocida es Candida albicans ya que es la principal especie relacionada en la mayoría de infecciones causadas por levaduras, sin embargo, actualmente se ha observado un incremento de las infecciones causadas por especies diferentes, anteriormente menos comunes, pero que hoy en día han adquirido mayor importancia, ya que algunas presentan perfiles de sensibilidad disminuida y resistencia a los antimicóticos de uso habitual, en especial a los azoles y equinocandinas . Con base en lo anterior, la correcta identificación de levaduras del género Candida es uno de los retos más grandes existentes en la actualidad, en especial, porque esto pudiera retrasar la instauración de un adecuado tratamiento en el paciente, particularmente, en el manejo de las infecciones fúngicas invasoras. Para esto, se hace necesario contar con pruebas que sean rápidas y precisas para la identificación oportuna de levaduras de interés clínico .

Actualmente, existen diversas metodologías para la identificación de levaduras, algunas emplean medios cromogénicos como el CHROMagarTM Candida que permiten tener una identificación presuntiva de una manera rápida, logrando identificar especies de importancia clínica como C. albicans, C. tropicalis y C. krusei, sin embargo, muchos autores resaltan la importancia de complementar esta identificación con otras pruebas fenotípicas que permitan la confirmación a especie . De igual manera, existen sistemas comerciales como el API® 20 C AUX o el sistema Vitek® 2 Compact utilizados para la identificación de estas levaduras, los cuales están basados en pruebas bioquímicas. Tienen la desventaja que pueden proporcionar identificaciones erróneas por la falta de experiencia del laboratorista al interpretar los resultados y, con alguna frecuencia estos sistemas no son capaces de diferenciar especies con perfiles bioquímicos similares y existe la limitante de la inclusión oportuna de especies emergentes en sus bases de datos . La espectrometría de masas, basada en la metodología MALDI TOF (de sus siglas del inglés: matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight), ha surgido como un método valioso para la identificación de microorganismos en general, y con un buen desempeño para la identificación de levaduras, por su rapidez, precisión y bajo precio de venta de servicio ,. Por tales motivos, esta tecnología ha comenzado a emplearse con mayor frecuencia en nuestro medio, siendo los sistemas comerciales Microflex® (Bruker Daltonics GMBH, Leipzig, Alemania) y Vitek® MS (bioMérieux, Marcy, L’Etoile, Francia) los más populares ,.

Otras de las metodologías utilizadas son las técnicas moleculares basadas en la secuenciación de ácidos nucléicos, las cuales han sido empleadas como método de referencia para hacer comparaciones frente a otras pruebas de identificación debido a que proporcionan una identificación más precisa ,. Adicionalmente, las técnicas de secuenciación permiten identificar especies crípticas como C. metapsilosis, C. orthopsilosis, C. nivariensis, C. bracarensis, que exhiben frecuentemente resistencia a los antifúngicos que comúnmente son empleados contra estos patógenos . La PCR panfungal y secuenciación tiene como limitante la complejidad para ser implementadas en un laboratorio ya que requiere espacios físicos, equipamiento especial y personal altamente entrenado .

Con todo lo expuesto anteriormente, y teniendo en cuenta que son escasos los estudios que analizan la concordancia de los métodos empleados para la identificación de levaduras y la importancia médica que tiene conocer los agentes causales de las diferentes infecciones causadas por Candida spp, el objetivo de este estudio fue evaluar la concordancia entre cinco diferentes métodos, tanto convencionales como moleculares y de espectrometría de masas, empleados para la identificación de levaduras del género Candida.

Materiales y Métodos

Población y sitio de estudio

Se incluyeron muestras de enjuague bucal que se obtuvieron a partir de 98 individuos adultos sanos durante el año 2014 que asistieron a las clínicas odontológicas de la Universidad Antonio Nariño, ubicadas en 9 ciudades colombianas (Armenia, Bogotá, Bucaramanga, Cúcuta, Ibagué, Neiva, Palmira, Popayán y Villavicencio). Estos individuos no tenían enfermedad sistémica conocida aunque, algunos tenían procesos patológicos localizados que no produjeron alteración sistémica.

Las muestras provenientes de pacientes con enfermedad sistémica y de aquellos que estuvieron recibiendo tratamiento farmacológico con antibióticos, antifúngicos o corticoesteroides en los últimos 6 meses se excluyeron de los análisis.

Aislamientos

Los enjuagues bucales se remitieron de manera inmediata al Laboratorio de la Unidad de Micología Médica y Experimental de la Corporación para Investigaciones Biológicas (CIB) en Medellín, Colombia. Las muestras se sembraron en agar Sabouraud Dextrosa™ con antibióticos (BD™, referencia 210950) y en medio CHROMagarTM Candida (CHOMagar Microbiology, Paris, Francia) , lo que permitió verificar desde los cultivos primarios, la posibilidad de tener infecciones mixtas por varias especies de Candida. Los cultivos fueron incubados a 25° C por 20 días, con lecturas semanales para evaluar la positividad de los mismos. Los aislamientos recuperados (n= 67) fueron almacenados en agua destilada estéril a 4° C y en medio de congelación en leche “Skim milk” (BD™, referencia 232100) a -20° C.

Identificación de las levaduras

La identificación del género y la especie de los aislamientos fue realizada utilizando las siguientes metodologías: 1) CHROMagarTM Candida (CHOMagar Microbiology, París, Francia). 2) API® 20 C AUX (bioMérieux, Marcy, L’Etoile, Francia). 3) Sistema automatizado Vitek® 2 Compact (bioMérieux, Inc., Hazelwood, MO, USA). 4) y 5) Espectrometría de masas basada en la técnica de MALDI TOF MS (desorción/ionización láser asistida por matriz) en los equipos Vitek® MS (bioMérieux, Marcy, L’Etoile, Francia) y Microflex® (Bruker Daltonics GMBH, Leipzig, Alemania). 6) Reacción en Cadena de Polimerasa (PCR) Panfungal y secuenciación.

Metodologías empleadas para la identificación de las levaduras

1. CHROMagarTM Candida: Después del crecimiento en este medio se verificó el color de cada una de las colonias para clasificarlas de acuerdo a las siguientes características: las colonias del complejo C. albicans/dubliniensis presentaron un color de verde claro a mediano, las de C. tropicalis, de azul verdoso a azul metálico y las demás especies presentaron un color de rosado pálido o lila claro a oscuro, o bien su color crema natural en este medio ,.

2. API® 20 C AUX: La prueba se realizó siguiendo las recomendaciones del fabricante (bioMérieux, Marcy, L’Etoile, Francia) . Despúés del período de incubación (48 horas a 25° C) los paneles se inspeccionaron visualmente. El perfil numérico obtenido para cada aislamiento se interpretó utilizando el software Apiweb TM (bioMérieux, referencia: 40 011).

3. Vitek® 2 Compact: el inóculo de trabajo fue preparado en 3 mL de solución salina al 0,45% a partir de un cultivo puro de no más de 24 h de crecimiento. La suspensión se ajustó a una escala de turbidez de McFarland entre 1,8 - 2,2, empleando el equipo DensiCheck®. El inóculo final fue dispensado automáticamente en las tarjetas de identificación del kit (YST, referencia: 21343), y se incubó utilizando el equipo Vitek® 2 Compact (bioMérieux, Durham, NC). La identificación final fue clasificada de la siguiente manera: “excelente”, “muy bueno”, “bueno”, “aceptable” o “con baja discriminación”, según el nivel de confianza y el porcentaje de discriminación para cada identificación proporcionada por el software del equipo .

4. MALDI TOF: Se realizó utilizando dos plataformas comerciales en los equipos Vitek® MS (bioMérieux, Marcy, L’Etoile, Francia) y Microflex® (Bruker Daltonics GMBH, Leipzig, Alemania). Los detalles metodológicos de cada método comercial se describen a continuación:

4.1 Vitek® MS: Una sola colonia pura (crecimiento entre 24-72 h) se depositó en un solo pocillo de la placa del Vitek® MS. Las células se lisaron con 0,5 μL de ácido fórmico al 25% (Referencia: 411072) y se dejarón secar a temperatura ambiente (1-2 min). Después del secado, se adicionó 1 μL de la matriz CHCA (bioMérieux, Marcy, L’Etoile, Francia, Referencia: 411071). Las pruebas se realizaron después de que la mezcla final estaba completamente seca. El listado de picos resultantes de la adquisición se analizó utilizando el servidor MS-ID, en el que se compararon los picos de la muestra con los espectros contenidos en la base de datos MS-ID (CE/IVD) incluido en MylaTM (.

4.2 Microflex®: Partiendo de cultivos con no más de 24 h de crecimiento a 37º C, se realizó la identificación mediante la metodología de transferencia con extracción directa extendida en placa o mediante extracción con ácido fórmico. Para la extracción directa, se tomó una sola colonia y se realizó una capa muy delgada del microorganismo en la placa de acero MALDI, se dejó secar a temperatura ambiente, se adicionó 1 μL de ácido fórmico al 100% y se cubrió con 1 μL de matriz HCAA (α-cyano-4 hydroxycinnamic acid - HCCA) dejando secar a temperatura ambiente. Para aquellas cepas que presentaron un score bajo en la identificación, o en las cuales no fue posible una identificación, se les realizó extracción con ácido fórmico, la cual se hizo siguiendo las instrucciones del fabricante (Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Alemania) con algunas modificaciones. Cada muestra fue servida por duplicado con el fin de verificar la reproducibilidad. Los perfiles fueron visualizados con el software FlexControl (versión 3.0) y el MALDI Biotyper RTC .

5. PCR Panfungal y secuenciación: La región D1/D2 de la subunidad del complejo de genes rRNA 28S se amplificó siguiendo directrices internacionales para la identificación molecular de hongos . También se amplificó la región ITS 1-4 (Internal Transcribed Spacer) para la identificación de especies crípticas en aislamientos de Candida parapsilosis y Candida glabrata . El DNA genómico se extrajo de colonias aisladas cultivadas en agar Sabouraud usando el mini kit QIAamp DNA (QIAGEN, Germantown, MD), siguiendo las recomendaciones del fabricante. Los marcadores moleculares fueron amplificados utilizando los cebadores y protocolos previamente descritos para las regiones D1/D2 y la ITS 1-4 (19, 20).

Los productos amplificados de la región D1/D2 (~ 600 pb) y de la región ITS 1-4 (600 - 900 pb) fueron enviados a Macrogen (Maryland, EE.UU.) para la secuenciación bidireccional de Sanger. El software Sequencher 5.0 (Gene Code Corporation) se usó para editar y alinear las secuencias. Se realizó una búsqueda para establecer similitud/homología en dos bases de datos: el NCBI (BLAST) (Centro Nacional de Información de Biotecnología, Washington, DC) y el CBS-KNAW (Centro de Diversidad Fúngica).

Diseño metodológico y análisis estadístico

Las variables analizadas en este trabajo fueron resumidas mediante el cálculo de frecuencias absolutas y relativas. Los diferentes métodos para la identificación de levaduras evaluados fueron comparados mediante un análisis de concordancia, con el cálculo del índice de Kappa ponderado (Kp) y sus respectivos intervalos de confianza del 95% (IC 95%). El análisis de concordancia fue realizado de dos formas: la primera fue reagrupando los resultados de los métodos API® 20 C AUX‚ Vitek® 2 Compact‚ Vitek® MS y Microflex® y PCR Panfungal y secuenciación en las siguientes tres categorías de resultados: C. albicans/dubliniensis, C. tropicalis y Candida diferente a Candida albicans/dubliniensis/tropicalis, lo anterior se hizo con el objetivo de comparar las metodologías de identificación con el método de tamizaje CHROMagarTM Candida. El segundo análisis comparó los resultados finales de los métodos API® 20 C AUX‚ Vitek® 2 Compact‚ Vitek® MS y Microflex® y PCR panfungal y secuenciación, donde se tomó como método de referencia la PCR panfungal y secuenciación. Adicionalmente, fue realizado un análisis local de costos y tiempos necesario para el reporte de resultados, en el cual se analizaron las variables de precio de venta del servicio al público y el tiempo de procesamiento de la prueba para la entrega de resultados (excluyendo los tiempos de la fase pre-analítica y pos-analítica), la información analizada fue recolectada mediante contacto telefónico o vía correo electrónico con las diferentes instituciones que realizan alguna de estas metodologías en la ciudad de Medellín, Colombia. La interpretación se realizó mediante el análisis gráfico de las dos variables (costos y tiempo). Los análisis estadísticos fueron realizados utilizando el paquete estadístico STATA 8.0® y los gráficos mediante el Software Microsoft Excel 2010®.

Responsabilidades éticas

El protocolo fue aprobado por los comités de ética de la Universidad Antonio Nariño, Armenia-Quindío, Colombia.

Resultados

Sesenta y siete aislamientos del género Candida spp recuperados a partir de 98 enjuagues bucales fueron analizadas en el laboratorio (68% de positividad). Al realizar el análisis inicial utilizando el medio CHROMagarTM Candida, los 67 aislamientos se clasificaron como: 39 (58%) aislamientos de C. albicans/dubliniensis, 4 (6%) aislamientos de C. tropicalis y 24 (36%) aislamientos como Candida diferente a Candida albicans/dubliniensis/tropicalis. El primer análisis de concordancia comparando el CHROMagarTM Candida con las otras cinco metodologías (resultados reagrupados), arrojaron los siguientes resultados del Kappa ponderado (Kp): vs API® 20 C AUX = 1.00 (IC 95% = 1.00 - 1.00); vs Vitek® 2 Compact = 0.87 (IC 95% = 0.75 - 0.96); vs Vitek® MS = 0.92 (IC 95% = 0.80 - 0.99); vs Microflex® = 0.97 (IC 95% = 0.94 - 1.00) y vs la PCR panfungal y secuenciación = 0.98 (IC 95% = 0.95 - 1.00).

Al analizar los resultados teniendo en cuenta cada una de las metodologías utilizadas para la identificación de levaduras (excepto el CHROMagarTM Candida), se observó que la PCR panfungal y secuenciación, fue el método que logró diferenciar el mayor número de especies (n=12). Los métodos basados en espectometria de masas, Vitek® MS y Microflex®, identificaron nueve especies diferentes de Candida y finalmente, los métodos bioquímicos API® 20 C AUX y Vitek® 2 Compact, lograron identificar ocho especies diferentes de Candida cada uno. La descripción de las especies identificadas por metodología, se resumen en la Figura 1.

Figura 1

Distribución de las especies de levaduras clasificadas según el método de identificación

El segundo estudio de concordancia mostró una concordancia alta entre los resultados obtenidos con los métodos PCR panfungal y secuenciación, Vitek® MS, Microflex® y API® 20 C AUX, concordancias agrupadas en las categorías buena y muy buena. Los Kp que involucraron el método Vitek® 2 Compact, presentaron concordancias moderadas o buenas frente a los otros métodos (PCR panfungal y secuenciación, Vitek® MS, Microflex® y API® 20 C AUX). El análisis de las concordancias y discordancias comparando todos los métodos se encuentran resumidas en la Tabla 1. Los valores de Kp observados y sus respectivos IC del 95%, se encuentran resumidos en la Figura 2.

Tabla 1

Comparación de concordancias y discordancias de los métodos API® 20 C AUX, Vitek® 2 Compact, Vitek® MS y Microflex® con el método de referencia PCR panfungal y secuenciación.

	Método de referencia	API® 20 C AUX		Vitek® 2 Compact		Vitek® MS		Microflex®
	PCR panfungal y secuenciación (n)	C (n)	D (n)	C (n)	D (n)	C (n)	D (n)	C (n)	D (n)
C. albicans	35	33	2	34	1	33	2	35	0
C. parapsilosis	12	12	0	10	2	12	0	12	0
C. dubliniensis	6	2	4	6	0	5	1	5	1
C. glabrata	4	4	0	2	2	4	0	3	1
C. tropicalis	2	2	0	2	0	2	0	2	0
C. intermedia	2	0	2	0	2	2	0	1	1
C. guilliermondii	1	1	0	0	1	1	0	1	0
C. lusitaniae	1	0	1	1	0	1	0	1	0
C. haemulonii	1	0	1	1	0	1	0	1	0
C. lipolytica	1	0	1	0	1	0	1	0	1
C. fermentati	1	0	1	0	1	0	1	0	1
Pichia kluyveri	1	0	1	0	1	0	1	0	1
Total	67	54	13	56	11	61	6	61	6

n: número

C: concordancias,

D: discrepancias

Figura 2

Análisis de concordancia de cinco metodologías para la identificación de aislamientos orales de especies de Candida.

Para corroborar que los métodos anteriores no dejaron de detectar especies de los complejos Candida parapsilosis y Candida glabrata, se complementó con una PCR y secuenciación de la región ITS 1-4, determinando que, en los complejos de Candida parapsilosis (n=12) y Candida glabrata (n=4), no se identificaron especies crípticas.

El análisis de costos y tiempo de procesamiento de la pruebas para generar resultados, demostró que los métodos basados en la tecnología MALDI TOF (Microflex® y Vitek® MS) requirieron menos tiempo para la generación de resultados (4 minutos), además, el método Microflex® presentó menor valor comercial (13 Dólares Americanos). La PCR panfungal y secuenciación, fue el método que requirió más tiempo para la entrega de resultados (3 días) y presentó el mayor valor comercial (86 USD). El análisis que compara las metodologías diagnósticas con base en los costos comerciales y el tiempo de procesamiento hasta la obtención de resultados, se resume en la Figura 3.

Figura 3

A Resultados del análisis del costo/tiempo de respuesta. USD: Dólares Americanos. Análisis del tiempo de respuesta: esta variable excluye retrasos eventuales dentro de la fase pre-analítica y pos-analítica.

Discusión

Este estudio evaluó cinco metodologías diferentes para la identificación de aislamientos clínicos del género Candida obtenidos de enjuagues bucales. En general, observamos una buena concordancia entre CHROMagar ™ Candida y las otras cinco metodologías evaluadas en este estudio. El método Vitek® 2 Compact tuvo la concordancia más baja y la mayor fue observada con el API® 20 C AUX. Es importante mencionar que el uso de CHROMagar ™ Candida permite la identificación de la presencia de múltiples especies en la misma muestra clínica y proporciona una identificación presuntiva de las especies de Candida asociadas ,.

La mayoría de los cinco métodos analizados demostraron concordancias altas agrupadas en las categorías buena y muy buena. Estudios previos han demostrado que los métodos fenotípicos, basados en pruebas bioquímicas como el API® 20 C AUX y el sistema Vitek® 2 Compact, son los más empleados en los laboratorios clínicos ,. En este trabajo se observó que estos dos métodos fueron los que presentaron menor capacidad para diferenciar especies del género Candida y también presentaron menores valores de Kp, en especial, cuando se comparó el método Vitek® 2 Compact con las otras metodologías evaluadas. Otros autores han reportado que estos métodos pueden presentar discrepancias para identificar especies del género Candida menos comunes y aquellas especies estrechamente relacionadas ,. Por otra parte, la exactitud de estos métodos se reduce en gran medida si los laboratorios no realizan las pruebas adicionales requeridas para la identificación de perfiles fenotípicos que ayuden a discernir entre las especies con discriminaciones bajas o que presenten dificultades en la identificación.

En nuestro estudio se identificaron por PCR panfungal y secuenciación, especies como Candida fermentati y Candida haemulonii, que son especies emergentes, clasificadas recientemente dentro de complejos de especies que tienen dificultad de identificarse por los métodos convencionales y cuya identificación se puede convertir en un gran desafío cuando estas cepas no han sido incluidas en las bases de datos de los diferentes sistemas de identificación ,. Además, algunas de estas especies emergentes han mostrado una disminución de la sensibilidad a los agentes antifúngicos, y en consecuencia, esto aumenta la dificultad en el tratamiento de los pacientes con infecciones invasivas por Candida. ,. En nuestro trabajo, ninguna de las metodologías analizadas, con excepción de la PCR panfungal y secuenciación, tuvo la capacidad de diferenciar las especies de Candida lipolytica (n= 1), Candida fermentati (n= 1) y Pichia kluyveri (n= 1), especies que si bien han sido reportadas principalmente para el uso a nivel industrial, también tienen la capacidad de comportarse como verdaderos patógenos en humanos de acuerdo con las condiciones del hospedero ,-.

Las metodologías basadas en MALDI TOF (Microflex® y Vitek® MS) presentaron una alta concordancia en comparación con el método de referencia, PCR panfungal y secuenciación. El análisis de concordancia entre estas dos tecnologías mostraron una concordancia muy buena, debido a que ambos sistemas fueron capaces de identificar el mismo número de especies pero no todas correspondieron a las mismas especies, ya que se obtuvieron incongruencias en las identificaciones en 6 de los 67 aislamientos analizados. Existen varias plataformas de MALDI TOF, las cuales presentan diferencias que van a depender de las bibliotecas de espectros de masas y de los algoritmos de identificación que tenga cada casa comercial ,. En nuestro estudio el Microflex® fue capaz de identificar todos los aislamientos a nivel de especie. Cuando se empleó el espectómetro Vitek® MS, se observaron tres discordancias mayores (esta plataforma no fue capaz de determinar la identificación final a nivel de especie en tres aislamientos), cuando se comparó con el método de referencia, lo cual afecto su valor de Kp. Muchos estudios han permitido determinar que estas técnicas son más rápidas y más precisas en la identificación de las diferentes levaduras a partir de cultivos, lo que tiene una alta relevancia a nivel de tiempo y costos de procesamiento ,,.

La ventaja de la PCR panfungal y secuenciación radica en que esta técnica permite identificar especies crípticas o complejos de especies, pero se recomienda combinar la amplificación de la región D1/D2 con otros blancos en la región ITS -. En este trabajo, aunque no se observó la presencia de especies crípticas de Candida parapsilosis y Candida glabrata, es importante tener en cuenta la importancia de emplear metodologías que sean capaces de detectarlas, debido principalmente a la emergencia de especies con perfiles de sensibilidad de difícil manejo ,,. Además, sería la mejor opción, a pesar de su costo, para aquellas identificaciones que por otras metodologías generen identificaciones dudosas o con bajas discriminaciones.

Al realizar el análisis referente a los costos y al tiempo para la generación de resultados a nivel local, se pudo determinar que los métodos basados en la tecnología MALDI TOF (Microflex y Vitek® MS) fueron los que ofrecieron menores tiempos para la identificación de levaduras, como ha sido reportado en estudios previos, y al comparar esta metodología con los métodos convencionales, nuestros resultados reflejaron un costo muy razonable y competitivo en nuestro medio comparado con las demás técnicas . Cabe resaltar que esta tecnología permite resultados precisos, superando a las técnicas de identificación convencionales ,. Esta tecnología ha demostrado un gran potencial para una identificación rápida y precisa, y este hallazgo demuestra la necesidad de hacer que sus metodologías estén más disponibles.

Es importante mencionar que pueden ocurrir retrasos en la generación de resultados, debido a factores que no son inherentes al proceso, sino que dependen en gran parte de factores externos, como el día que llegue el aislamiento para su proceso, la viabilidad de los aislamientos, el requerimiento o no de un paso adicional de extracción, los días designados para el procesamiento de muestras, la disponibilidad de personal del laboratorio o el tiempo de respuesta para el análisis de las secuencias. Cambios en algunos de estos factores y conductas pueden marcar una gran diferencia a la hora de la entrega de un resultado oportuno y ayudarían a generar cambios a nivel de los laboratorios para mejorar los diferentes procesos.

El presente estudio se limitó a evaluar especies de Candida aisladas de mucosa oral y aunque se pudo evidenciar una gran variedad de especies identificadas entre los diferentes métodos, sería pertinente para futuras investigaciones realizar la misma evaluación de métodos en otras muestras clínicas. Adicionalmente, el análisis de costos y tiempos solo fue realizado en la ciudad de Medellín, Colombia. En Colombia, es limitado el número de laboratorio que ofrecen como servicio diagnóstico métodos moleculares y por tecnología MALDI TOF, lo cual puede incrementar de forma significativa los costos de estas pruebas, debido principalmente a la exclusividad del servicio.

Conclusión

Es necesario implementar métodos de identificación que faciliten el acceso a resultados rápidos y confiables, pero que, a su vez ayuden a optimizar el recurso económico una vez sean implementadas en la rutina diaria. En este trabajo se evidenció que los sistemas basados en tecnología MALDI TOF, a pesar de ser metodologías que inicialmente requerían una inversión económica sustancial, demostraron ser rápidos, económicos (valor comercial de la prueba) y precisos, que se presentan como alternativas prometedoras para la identificación rutinaria de levaduras del género Candida. Para aquellos laboratorios que no pueden acceder a pruebas moleculares o de espectrometría de masas, el uso de pruebas automatizadas podrían ser una buena alternativa si el analista del laboratorio sigue las especificaciones proporcionadas por el fabricante y presta especial atención a los resultados que involucran especies poco comunes o características discrepantes en el aislamiento (morfología, patrón de susceptibilidad y otras claves taxonómicas adicionales).