[Expressions and prognostic significance of PTEN and PD-1 protein in patients with classical Hodgkin's lymphoma].

Objective: To elucidate the expression levels of key immune biomarkers, phosphate and tension homology deleted on chromosome ten (PTEN) and programmed cell death protein1(PD-1),of different immune tolerance pathway in classic Hodgkin's lymphoma (CHL) to further determine their clinical role and prognostic significance.
Methods: The clinical features and prognostic factors of 56 CHL patients, who were admitted to the TianJin Medical University Cancer Institute from February 2003 to August 2013, were retrospectively analyzed. PTEN and PD-1 protein expression levels were analyzed by immunohistochemistry, Epstein-Barr virus encoded RNA (EBER) was performed by in situ hybridization assay. Correlations between the expression of biomarkers and clinicopathologic parameters were examined and survival analyses were performed.
Results: This cohort of 56 CHL patients included 34 males and 22 females with a median age of 25 years (ranged from 7 to 71 years). In a univariate analysis, age≥45, IPS score >2, EBER positive, high expression of PTEN protein conferred inferior 5-year OS and 5-year PFS; In a multivariate model, age≥45, IPS score >2, EBER positive, high expression of PTEN protein were identified as the independent adverse prognostic factors for CHL. Conclusions: This study suggested for the first time that PTEN was independent prognostic immune biomarkers in CHL, which provided the novel therapeutic strategy of immune therapy for CHL.

目前经典型霍奇金淋巴瘤（classic Hodgkin's lymphoma, CHL）的发病率呈逐年升高趋势，中晚期、复发及耐药CHL患者的治疗仍然是亟待解决的难题。大量研究发现免疫耐受和免疫逃逸是CHL治疗失败的主要原因[1]–[2]。明确免疫微环境的相关因子对该病的预后价值，进而完善CHL的预后评价体系和为患者选择个体化的治疗是该病的研究热点[3]。在本研究中我们采用免疫组织化学（IHC）法检测预后因子磷酸酶和张力蛋白同源物（PTEN）和程序性细胞死亡受体1（PD-1）在CHL患者中的表达，并结合患者的临床特征和生存状态进行相关性分析，旨在探讨其评估CHL预后的价值。

病例与方法

1．病例：2003年2月至2013年8月天津医科大学肿瘤医院收治的CHL患者为61例，失访5例（8.20%），资料完整的病例为56例。采用2008年WHO淋巴造血系统肿瘤分类标准进行诊断，所有患者均经手术或针吸穿刺活检获得病理组织，经病理学及IHC检测确诊为CHL。

2．IHC法检测PTEN及PD-1表达：石蜡包埋病理标本均按常规处理。采用EnVision二步法进行IHC染色。PTEN抗体购自美国Cell Signaling Technology公司，PD-1抗体购自美国R&D systems公司。每张切片随机选取10个高倍视野，计数阳性细胞数所占百分比。所有染色切片均由2位病理医师双盲法阅片。应用X-Tile软件分析后确定cut-off值，同时参照文献[4]–[5]进行分组：①PTEN表达分组：阳性细胞数<10%为低表达，10%~<40%为中表达，≥40%为高表达；②PD-1表达分组：阳性细胞数<40%为低表达，40%~<80%为中表达，≥80%为高表达[4]–[5]。

3．原位杂交法检测EBV及EBV编码的小mRNA（EBER）：EBER原位杂交试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司，按照说明书进行操作。结果判定：无任何显色定义为阴性表达；阳性表达位于所检测病毒感染的细胞核中，呈棕黄色。

4．治疗及疗效判断：56例患者中22例（39.29%）接受单纯化疗，34例（60.71%）接受放化疗联合的综合治疗。其中48例（85.71%）患者接受以ABVD（多柔比星、博来霉素、长春花碱、达卡巴嗪）为主方案，8例（14.29%）高肿瘤负荷的年轻患者接受BEACOPP（博来霉素、依托泊苷、多柔比星、环磷酰胺、长春新碱、丙卡巴肼、泼尼松）方案，中位疗程数为6（4~8）个。放疗方式包括扩大野放疗（15例）和受累野放疗（19例），中位放疗剂量为36（20~50）Gy。5例（8.93%）患者序贯auto-HSCT。

疗效标准参考霍奇金淋巴瘤NCCN指南（2018年V3）标准进行判断。分为完全缓解（CR）、部分缓解（PR）、疾病稳定（SD）和疾病进展（PD）。

5．随访：采用查阅病历和电话联系的方式进行随访，随访截止时间为2018年3月20日。总生存（OS）时间定义为从疾病确诊至任何原因引起的死亡或随访结束的间隔时间。无进展生存（PFS）时间定义为从初诊至第一次进展、复发或任何原因所致死亡的间隔时间。

6．统计学处理：采用SPSS 22.0软件进行统计学分析，PTEN和PD-1表达与临床指标间的相关性分析采用Spearman检验，PTEN和PD-1表达对于生存影响的最佳cutoff值的选择采用X-Tile生存分析软件[6]。采用Kaplan-Meier方法描述患者生存状态分布，并应用Log-rank检验进行组间比较。采用Cox比例风险模型进行预后因素分析。P<0.05为有统计学意义。

结果

1．患者一般临床特征：56例患者中，男34例，女22例，中位年龄24（7~72岁）。病理分型：结节硬化型26例，混合细胞型22例，富淋巴细胞型7例，淋巴细胞消减型1例；Ann Arbor分期Ⅰ~Ⅱ期者23例，Ⅲ~Ⅳ期者33例；有B症状（发热、盗汗、体重减轻）者16例；IPS评分>2分者8例；有大包块（≥5 cm）者12例；血清LDH升高者16例；β2微球蛋白升高者15例。全部患者标本均进行了EBER检测，检测结果显示EBV阳性率为42.86%（24/56）。

2．疗效：56例患者中，47例（83.93%）获得缓解，其中CR者23例（41.07%），PR者24例（42.86%）；治疗无效（SD+PD）者9例（16.07%）。截止到随访结束有19例（33.93）患者死于SD或PD。

3．PTEN和PD-1表达的相关性及其与临床特征的相关性分析：56例患者中，PTEN阳性者11例（19.64%），PD-1阳性者14例（25.00%）。相关性分析结果显示：PTEN和PD-1表达呈正相关（rs=0.320，P=0.016）（表1）；PTEN表达与Ann Arbor分期（P=0.017）、IPS评分（P=0.022）和有无大包块（≥5 cm）（P=0.010）明显相关，而PD-1仅与有无大包块（≥5 cm）相关（P=0.018）（表2）。

表1

经典型霍奇金淋巴瘤患者PD-1和PTEN表达的相关性分析

变量	例数	PTEN			rs值	P值
		高表达组(11例)	中表达组(27例)	低表达组(18例)
PD-1					0.320	0.016
高表达组	14	6	6	2
中表达组	26	4	16	6
低表达组	16	1	5	10

表2

经典型霍奇金淋巴瘤患者PD-1、PTEN表达与各临床指标间的相关性分析

因素	例数	PD-1表达					PTEN表达
		高表达	中表达	低表达	rs值	P值	高表达	中表达	低表达	rs值	P值
Ann Arbor分期					−0.124	0.363				0.317	0.017
Ⅰ~Ⅱ	23	6	12	5			3	8	12
Ⅲ~Ⅳ	33	8	14	11			8	19	6
IPS评分					0.095	0.488				−0.306	0.022
>2分	8	3	4	1			4	0	4
≤2分	48	11	22	15			7	27	14
大包块(≥5 cm)					−0.315	0.018				-0.342	0.010
有	12	6	1	5			5	1	6
无	44	8	25	11			6	26	12

注：表中只列出PD-1、PTEN与各临床指标间的阳性相关性，而PD-1、PTEN与患者的年龄、性别、组织分型、B症状、EBV编码的小mRNA、LDH、β2-微球蛋白、治疗方式、疗效评价无相关性

4．PTEN和PD-1表达与患者预后的关系分析：中位随访时间为43（5~86）个月，入组患者的5年PFS率为55.6%，5年OS率为77.8%。PTEN高、中、低表达组患者的5年OS率分别为27%、63%、94%（P=0.003），5年PFS率分别为20%、51%、94%（P=0.001），差异均有统计学意义（图1）。PD-1高、中、低表达组患者的5年OS率分别为61%、56%、81%（P=0.485），5年PFS率分别为50%、62%、63%（P=0.526），差异均无统计学意义（图2）。

图1

PTEN表达对经典型霍奇金淋巴瘤患者总生存（A）和无进展生存（B）的影响

图2

PD-1表达对经典型霍奇金淋巴瘤患者总生存（A）和无进展生存（B）的影响

5．影响患者预后的单因素和多因素分析：单因素分析结果显示，年龄（OS：P<0.001，PFS：P=0.021）EBER阳性（OS：P=0.001，PFS：P<0.001）、IPS评分（OS：P=0.018，PFS：P<0.009）和PTEN表达（OS：P=0.001，PFS：P<0.001）是影响患者5年OS和PFS的预后因素（表3）。将上述因素纳入Cox比例风险模型进行多因素分析，结果显示年龄≥45岁、EBER阳性、IPS评分>2分和PTEN高表达是影响CHL患者5年OS和PFS的独立不良预后因素（表4）。

表3

影响经典型霍奇金淋巴瘤患者生存的单因素分析

影响因素	5年总生存		5年无进展生存
	HR(95%CI)	P值	HR(95%CI)	P值
年龄（≥45岁/<45岁）	6.567(2.221～19.416)	<0.001	2.705(1.109～6.598)	0.021
性别	1.408(0.567～3.495)	0.457	1.249(0.523～2.981)	0.612
病理组织分型a	0.739(0.480～1.139)	0.134	0.783(0.536～1.143)	0.378
Ann Arbor分期（Ⅰ～Ⅱ/Ⅲ～Ⅳ期）	1.847(0.743～4.595)	0.179	1.412(0.592～3.368)	0.430
B症状（有/无）	1.287(0.496～3.341)	0.602	1.117(0.436～2.862)	0.815
IPS评分（>2分/≤2分）	2.648(0.851～8.237)	0.018	3.556(1.524～11.626)	0.009
EBER（阳性/阴性）	5.254(1.763～15.653)	0.001	6.477(2.179～19.250)	<0.001
肿块（≥5 cm/<5 cm）	1.634(0.562～3.324)	0.659	1.786(0.663～4.582)	0.782
LDH（升高/正常）	1.206(0.464～3.137)	0.699	0.935(0.366～2.391)	0.887
β2微球蛋白（升高/正常）	2.149(0.852～5.421)	0.096	1.397(0.569～3.430)	0.458
治疗方式（化疗/放化疗）	0.663(0.355～1.236)	0.243	0.358(0.152～0.842)	0.197
疗效评价(CR/PR/SD+PD)	0.698(0.546～5.243)	0.147	0.784(0.436～5.217)	0.098
PD-1表达分组（高/中/低表达组）	1.257(0.744～2.123)	0.485	1.134(0.692～1.856)	0.526
PTEN表达分组（高/中/低表达组）	4.571(1.907～13.724)	0.003	6.212(2.024～15.746)	0.001

注：a病理组织分型包括：结节硬化型、混合细胞型、富淋巴细胞型、淋巴细胞消减型；B症状：发热、盗汗、体重减轻；EBER：EBV编码的小mRNA；LDH正常值为<250 U/L；β2微球蛋白正常值为<2.7 mg/L；CR：完全缓解；PR：部分缓解；SD：疾病稳定；PD：疾病进展；PTEN表达分组：阳性细胞数<10%为低表达，10%~<40%为中表达，≥40%为高表达；PD-1表达分组：阳性细胞数<40%为低表达，40%~<80%为中表达，≥80%为高表达

表4

影响经典型霍奇金淋巴瘤患者生存的多因素分析

影响因素	5年总生存		5年无进展生存
	HR(95%CI)	P值	HR(95%CI)	P值
年龄（≥45岁/<45岁）	10.953(3.257～36.831)	<0.001	3.637(1.426～9.280)	0.007
IPS评分（>2分/≤2分）	3.120(1.233～5.380)	0.026	2.954(1.222～4.098)	0.014
EBER（阳性/阴性）	5.054(1.668～15.313)	0.004	5.656(1.876～17.055)	0.002
PD-1表达分组（高/中/低表达组）	1.257(0.731～2.162)	0.408	1.229(0.743～2.033)	0.421
PTEN表达分组（高/中/低表达组）	1.896(1.047～3.434)	0.035	1.913(1.087～3.367)	0.024

注：EBER：EBV编码的小mRNA；PD-1、PTEN表达分组同表3

讨论

CHL的治疗进展被视为多药联合化疗理念的巨大成功范例，约80%患者可获治愈[7]。然而目前选择一线治疗方案的策略主要基于肿瘤负荷评价，将患者分为早期和进展期，相当一部分患者可能因过度治疗而导致短期或远期不良后果，也可能因治疗不足而导致复发。为了更精确地进行个体化治疗，我们需要更理想的预后生物学标志物帮助进行治疗决策以及预测二线治疗方案的疗效。

越来越多的潜在生物学标志物被报道，包括用于诊断时危险度分层、监测治疗反应以及指导治疗决策的指标，上述生物学标志物的来源涉及Hodgkin/Reed-Sternberg（H/RS）细胞生物学特性、组成肿瘤微环境的众多非肿瘤细胞，以及两者在分子水平的相互作用[8]。在本文中我们着重探讨肿瘤免疫耐受信号通路中的两个重要指标PTEN和PD-1在CHL病理组织中的表达，以及两者的相关性和预后价值。

PD-1作为一个重要的免疫检查点及其通路，参与了抑制性肿瘤微环境的形成，可使肿瘤细胞获得免疫耐受[9]，PD-1抗体在治疗HL中已取得令人瞩目的疗效[10]–[11]，但其表达与CHL临床特征和预后的相关性仍存在争议。PTEN在实体肿瘤和血液肿瘤细胞中均为抑癌蛋白，但是其在肿瘤免疫微环境的表达和预后的关系目前研究尚少[12]。Munn等[13]于2016年报道PD-1上调促使其下游PTEN的磷酸化，进而抑制PI3K和Akt信号通路的活化，上述是实体肿瘤中的重要免疫耐受信号通路，该通路活化后稳定Treg细胞，抑制其向杀伤性T细胞转化，最终抑制肿瘤微环境杀伤性T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用，提示PTEN是肿瘤免疫微环境中一个重要的调节因子[14]。但其在CHL患者中的表达及其与预后的关系尚未见报道。

在本研究中我们发现CHL患者PTEN和PD-1均有不同程度的表达，PTEN和PD-1表达成正相关（P=0.011），再次验证了上述报道。同时，首次报道PTEN表达与Ann Arbor分期、IPS评分和有无大包块（≥5 cm）明显相关，而PD-1仅与有无大包块相关（P值均<0.05）。提示PTEN蛋白的表达可能是CHL患者的一个重要预后指标。而关于EBV与PD-1及配体PD-L1的之间关系较为复杂，有研究者认为EBV感染与PD-L1表达相关，EBV通过EBV编码LMP1蛋白促进肿瘤细胞PD-L1表达[15]。Paydas等[16]对87例CHL患者的研究结果显示PD-1/PD-L1表达与EBV感染无相关性。Chen和Guo[12]采用原位杂交法检测纵隔大B细胞淋巴瘤患者的EBER，结果显示EBV感染与PD-1及配体PD-L1表达并无相关性。我们在本研究中特别检测了所有入组患者的EBER表达，结果与既往大部分报道一致，PTEN、PD-1表达与EBER无相关性。

阻断PD-1/PD-L1通路治疗黑色素瘤[17]、非小细胞肺癌[18]、肾癌[19]等多种实体肿瘤已取得令人鼓舞的疗效，在治疗复发难治性CHL中也显示出肯定的治疗反应[20]。病理组织中高表达PD-L1、PD-1的实体肿瘤患者预后不良[21]–[22]，但目前PD-L1、PD-1的表达和CHL患者的预后研究尚少且结论不统一[16]。我们的研究结果显示PD-1表达水平并不影响CHL患者的5年OS（P=0.485）和PFS（P=0.526），但免疫耐受通路中PD-1下游的PTEN，其表达与CHL患者预后明显相关，提示该指标可能作为判断CHL患者预后的新免疫学标志物；而单因素和多因素分析结果进一步证实年龄≥45岁、EBER阳性、IPS评分>2分和PTEN高表达是影响CHL患者5年OS和PFS的独立不良预后因素。但因本研究为回顾性分析，不能排除因样本量偏少统计结果偏倚的可能，遂准确结论有待进一步增加病例数及开展多中心研究予以证实。

综上，我们发现免疫耐受信号通路相关因子PTEN高表达是影响CHL患者生存的独立不良预后因素，对CHL患者的预后判断有一定作用，该发现在国内外文献中尚未见报道；同时，为CHL的免疫治疗提供了新思路及理论依据。