[Variation of expression level and activity of coagulation factor ⅩⅢ in acute myeloid leukemia patients].

急性白血病是造血干细胞的恶性克隆性疾病，根据受累的细胞类型，通常可分为急性髓系白血病（AML）和急性淋巴细胞白血病（ALL）。凝血因子ⅩⅢ（FⅩⅢ）是谷氨酰胺转移酶（transglutaminase, TG）家族的一员，催化纤维蛋白单体之间的聚合反应，形成稳定纤维蛋白凝块，在凝血过程中发挥重要作用[1]。FⅩⅢ由2个A亚单位和2个B亚单位结合而成四聚体（FⅩⅢ-A2B2），其中A亚单位（FⅩⅢ-A）主要由骨髓源性细胞合成，以二聚体（FⅩⅢ-A2）形式存在于细胞内，活化后具有TG活性；B亚单位（FⅩⅢ-B）由肝细胞合成，以二聚体（FⅩⅢ-B2）形式存在于血浆中，起着运输和调节FⅩⅢ-A2功能的作用[2]。FⅩⅢ-A2被释放入血浆后，与FⅩⅢ-B2结合形成FⅩⅢ[3]。

FⅩⅢ-A2在单核/巨噬细胞和巨核细胞/血小板中含量丰富[2]。既往研究发现，多种类型的AML（M4、M5）及ALL患者肿瘤细胞内FⅩⅢ-A2抗原水平高于正常细胞[4]–[6]。本研究主要探究初治AML患者FⅩⅢ的变化，包括外周血FⅩⅢ的活性和含量，以及外周血和骨髓单个核细胞内FⅩⅢ-A基因mRNA的表达量，分析FⅩⅢ活性与AML患者出血表现的相关性。

病例与方法

1．病例：选取2016年11月1日至2017年5月14日北京协和医院新诊断为急性髓系白血病的患者。排除以下患者：①有基础凝血功能障碍性疾病；②肝功能受损；③3日内输注过血浆或全血。对照组为8例同期健康体检者。

2．主要试剂与仪器：FⅩⅢ活性测定试剂盒（德国Siemens公司产品），酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒为中国台湾Arigo Biolaboratories公司产品，反转录试剂盒为美国Thermo Fisher公司产品，PCRMix为美国Promega公司产品，定量PCR试剂盒为瑞士Roche公司产品，引物由上海生工生物工程（中国）合成。RT-PCR仪为瑞士Roche公司产品，凝血分析仪为Sysmex CS-5100。

3．标本采集及检测：用真空采血管收集患者外周血（枸橼酸钠抗凝），3 000×g离心10 min，收集上清，分装至离心管中，−80 °C冻存。依据ELISA试剂盒说明书测定FⅩⅢ浓度。

4．FⅩⅢ活性测定：用枸橼酸钠抗凝的真空采血管收集患者外周血，1 500×g离心20 min，收集上清，分装至离心管中，−80 °C冻存。依据FⅩⅢ活性测定试剂盒说明书、利用Sysmex CS-5100凝血仪测定FⅩⅢ活性。

5．单个核细胞内FⅩⅢ mRNA含量测定：用EDTA抗凝的真空采血管收集患者骨髓，利用Ficoll溶液分离单个核细胞，以Trizol溶液提取单个核细胞RNA，−80 °C冻存。用枸橼酸抗凝的真空采血管收集患者外周血，以红细胞裂解液裂解红细胞，离心获得细胞沉淀，以Trizol溶液提取细胞RNA，−80 °C冻存。依据反转录试剂盒说明书利用PCR仪逆转录合成cDNA，−80 °C冻存。合成FⅩⅢ-A基因外显子3（exon3）、外显子14-15（exon14-15）、内参基因PGK-1的引物，引物序列如表1所示。依据定量PCR试剂盒说明书利用RT-PCR仪测定PGK-1、exon3和exon14-15分别对应的临界循环数（threshold cycle, Ct）值，计算exon3和exon14-15分别与PGK-1的Ct差值，即ΔCt值。ΔCt exon3=Ct exon3−Ct PGK-1，ΔCt exon14-15=Ct exon14-15−Ct PGK-1。

表1

FⅩⅢ-A基因exon3、exon14-15和PGK-1的引物序列

引物名称	序列（5′→3′）
PGK-1 F	CAAGAAGTATGCTGAGGCTGTCA
PGK-1 R	CAAATACCCCCACAGGACCAT
FⅩⅢ-A exon3 F	TCACGAGCGTTCACCTGTTC
FⅩⅢ-A exon3 R	CTGCACATAGAAAGACTGCCC
FⅩⅢ-A exon14-15 F	CCTGGATGGTCCTGGAGTAA
FⅩⅢ-A exon14-15 R	AGGGAGTCACTGCTCATGCT

注：exon：外显子；F：上游引物；R：下游引物

6．统计学处理：采用SPSS 22.0进行数据分析。对于连续变量，若两组均符合正态分布，采用独立样本或配对样本t检验比较组间差异；若有一组不符合正态分布，采用独立样本或配对样本的非参数检验比较组间差异。对于离散变量，采用卡方检验比较组间差异。当P<0.05时，认为差异存在统计学意义。

结果

1．患者临床资料：本研究共纳入23例初治AML患者。23例患者中有11例起病时伴有出血表现，主要表现为皮下瘀点、瘀斑，鼻衄，齿龈出血，月经增多等（表2）。

表2

23例急性髓系白血病（AML）患者临床资料（±s）

临床特征	例数(%)
年龄
21～59岁	17(73.91)
≥60岁	6(26.09)
性别
男	13(56.52)
女	10(43.48)
AML类型
M1	2(8.70)
M2	15(65.21)
M3	4(17.39)
M6	2(8.70)
出血表现
有	11(47.83)
无	12(52.17)

2．AML患者外周血FⅩⅢ浓度：23例患者治疗前FⅩⅢ浓度高于对照组[（28.66±16.92）mg/L对（16.55±3.29）mg/L，P=0.029]。对9例患者治疗前和第一程化疗后外周血FⅩⅢ浓度测定的结果显示，治疗后较治疗前明显降低[（18.42±4.74）mg/L对（35.51±19.52）mg/L，t=2.443，P=0.040]。

3．AML患者外周血FⅩⅢ活性：23例患者治疗前、对照组外周血FⅩⅢ活性分别为（72.75±28.98）%、（103.49±13.06）%，治疗前外周血FⅩⅢ活性低于对照组（t=3.195，P=0.003）。9例患者第一程化疗后FⅩⅢ活性高于治疗前[（94.74±17.72）%对（58.98±27.54）%，t=3.845，P=0.005]。

4．AML患者外周血单个核细胞内FⅩⅢ-A基因mRNA的表达：23例初治AML患者中，19例患者测定了外周血单个核细胞内FⅩⅢ-A基因mRNA的含量（以ΔCt exon3和ΔCt exon14-15值表示）。患者治疗前外周血单个核细胞ΔCt exon3和ΔCt exon14-15分别为0.93±2.36、1.53±2.21，对照组分别为1.34±0.69、1.21±0.79。治疗前ΔCt exon3和ΔCt exon14-15分别与对照组相比，差异均无统计学意义（P>0.05）。详见表3。

表3

急性髓系白血病患者外周血单个核细胞内FⅩⅢ-A基因mRNA的表达（±s）

组别	例数	ΔCt exon3	ΔCt exon14-15
治疗前	19	0.93±2.36	1.53±2.21
对照组	8	1.34±0.69	1.21±0.79
t值		0.706	0.574
P值		0.490	0.570

5．AML患者骨髓单个核细胞FⅩⅢ-A基因mRNA的表达：23例初治AML患者中，18例患者治疗前骨髓骨髓单个核细胞FⅩⅢ-A基因mRNA表达，与对照组相比差异均无统计学意义（P>0.05）。详见表4。

表4

急性髓系白血病患者骨髓单个核细胞内FⅩⅢ-A基因mRNA的表达（±s）

组别	例数	ΔCt exon3	ΔCt exon14-15
治疗前	18	2.14±2.50	1.62±2.44
对照组	8	2.99±1.26	2.55±1.31
t值		0.842	0.934
P值		0.408	0.359

6．FⅩⅢ活性与出血表现的关系：外周血FⅩⅢ活性的正常范围为70%~140%，本研究定义FⅩⅢ活性低于70%为活性降低。在11例起病时有出血表现的患者中，仅有5例FⅩⅢ活性降低。分析FⅩⅢ活性与患者出血之间的关系，二者之间无明显相关性（χ2=0.048，P=0.827）。

讨论

FⅩⅢ发现于上世纪40年代，它能稳定纤维蛋白凝块，因此曾被命名为“纤维蛋白稳定因子”[7]，后在国际上被正式命名为FⅩⅢ。FⅩⅢ在凝血过程中发挥重要作用，早在上世纪60年代就有FⅩⅢ缺乏导致严重出血事件的报道[8]。本质上FⅩⅢ是一种谷氨酰胺转移酶[9]，其底物可多达140余种，除纤维蛋白之外，还能催化许多小分子之间的交联[10]。FⅩⅢ在肿瘤、创伤修复、骨代谢和妊娠中可能都发挥重要作用[3]。

有研究发现，在AML-M4和AML-M5患者中，超过50%的肿瘤细胞表达FⅩⅢ-A2[4]。对14例APL患者的研究发现，有10例患者肿瘤细胞内FⅩⅢ-A2的含量升高[6]。对47例B细胞来源的ALL（B-ALL）患者的研究显示，19例患者肿瘤细胞内FⅩⅢ-A2的含量升高[5]。在正常粒细胞或淋巴细胞中几乎不表达FⅩⅢ-A2[4]。这些研究表明，在某些特定类型的急性白血病，患者肿瘤细胞内FⅩⅢ-A2含量升高，但其机制尚不明确。

肿瘤细胞内的FⅩⅢ-A2是否会分泌到细胞外，导致外周血FⅩⅢ浓度或活性发生变化呢？为此，本研究对AML患者外周血FⅩⅢ的浓度和活性以及骨髓和外周血单个核细胞内FⅩⅢ-A基因mRNA的表达进行测定。研究显示，AML患者治疗前外周血FⅩⅢ浓度高于正常对照，治疗后浓度降低。但外周血FⅩⅢ活性测定的结果却与此相反，治疗前FⅩⅢ活性低于正常对照，治疗后活性升高。已知FⅩⅢ-A2仅存在于细胞内，外周血中的FⅩⅢ以FⅩⅢ-A2B2或FⅩⅢ-B2的形式存在[2]。FⅩⅢ-A2是FⅩⅢ的活性单位，正常情况下其活性位点被激活肽所掩盖，凝血酶切除激活肽后，暴露出FⅩⅢ-A2的活性位点从而激活FⅩⅢ[7]。AML患者外周血FⅩⅢ浓度和活性的变化呈负相关，推测可能是急性白血病通过某种机制对FⅩⅢ的活化过程具有一定的抑制作用，导致患者外周血FⅩⅢ抗原水平增加，但总的活性反而降低。其中的机制尚需进一步研究证实。

为进一步明确AML患者治疗前外周血中FⅩⅢ抗原水平增加的原因，我们利用实时定量PCR（qRT-PCR）技术，分别以FⅩⅢ-A基因exon3和exon14-15一段序列作为引物，测定并计算ΔCtexon3和ΔCt exon14-15值。ΔCt值越小，表明细胞内mRNA含量越高[11]。然而，无论是外周血还是骨髓，患者治疗前的ΔCt exon3和ΔCt exon14-15值与对照组相比差异均无统计学意义，表明患者外周血和骨髓单个核细胞内FⅩⅢ-A基因mRNA含量并未增加。AML患者治疗前外周血和骨髓单个核细胞绝大多数为白血病肿瘤细胞，初步推测AML患者FⅩⅢ浓度的升高与外周血或骨髓白血病肿瘤细胞并无明显相关性。AML患者外周血FⅩⅢ浓度升高的原因仍有待进一步阐明。

AML患者起病时常有出血表现，原因包括：①白血病患者恶性细胞大量增殖，抑制骨髓内巨核细胞/血小板生成，外周血血小板数量下降；②白血病引起DIC和（或）纤溶亢进；③白血病细胞对内皮细胞的损伤。本研究发现AML患者外周血FⅩⅢ的活性降低，而FⅩⅢ是一种重要的凝血因子，这可能也是引起出血的原因之一。化疗后缓解的患者FⅩⅢ活性水平恢复正常，可能缘于白血病对FⅩⅢ活化的抑制作用的消除。但分析FⅩⅢ活性与患者出血表现之间的关系，二者之间并未显示明显的相关性，这可能与本研究病例数较少有关，还需今后进一步研究证实。

本研究尚存在某些不足之处。首先，研究纳入的样本量尚偏少；其次，对AML患者FⅩⅢ浓度和活性变化的机制探究略显不足；另外，利用qRT-PCR测定ΔCt值间接反映细胞内FⅩⅢ-A基因mRNA的表达，可能会存在一定误差。在以后的研究中将纳入更多的病例以进一步证实相关结论。

综上所述，初步研究显示，AML患者治疗前外周血FⅩⅢ的抗原水平升高、但活性降低，治疗后的变化则刚好相反，这可能归因于白血病对FⅩⅢ活化过程的抑制作用。白血病细胞可能不是造成外周血FⅩⅢ抗原水平升高的主要来源。AML患者的出血与外周血FⅩⅢ活性之间的关系尚待明确。