[Effect of endothelial cell-targeted soluble Notch ligand hD1R protein on the proliferation of acute myeloid leukemia cells].

Objective: To evaluate the effects of endothelial cell-targeted soluble Notch ligand hD1R protein on the proliferation of acute myeloid leukemia (AML) cells.
Methods: The expression levels of Notch1, Notch2, Notch3, Notch4, Hes1 in bone marrow CD34(+) cells from 24 cases of untreated AML (AML group) and 9 healthy controls (control group) were determined by real time quantitative polymerase chain reaction (PCR) . Recombinant hD1R protein was first induced and purified. Bone marrow CD34(+) cells were co-cultured on human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) supplemented with a cocktail containing 5 types of human cytokines (5GF) and soluble hD1R. The cultured cells were tested under different culture conditions including PBS group (PBS replaces HUVEC) , hD1R group, 5GF group, GSI group (hD1R plus GSI) . Proliferation and apoptosis of cultured cells were also analyzed. Real time quantitative PCR was used to test the expression levels of Hes1 and Bcl-2 in cultured cells.
Results: The expression levels of Notch1 and Hes1 in primary AML patients were significantly lower, and Notch4 expression was higher compared to the control group (P<0.05) . Cell counting showed a remarkable decrease of AML cells number in the culture with hD1R compared with that in the PBS group[ (0.74±0.13) ×10(5) vs (2.16±0.21) ×10(5), P<0.01]. FACS analysis showed that the percentage of AML cells was (18.48±2.51) % in apoptosis, which was higher than that of control cells (3.19±0.58) % after co-culture with hD1R. AML cells in the hD1R group underwent significantly increased apoptosis compared with those in the PBS one (P<0.05) . Moreover, apoptosis of AML cells in the GSI group was lower than that in the hD1R one (P<0.05) . Apoptosis in the PBS group also decreased compared with that in the 5GF one (P<0.05) . Finally, hD1R up-regulated Hes1 expression and inhibited Bcl-2 one in the AML cells.
Conclusion: hD1R effectively activated Notch signaling and down-regulated Bcl-2 mRNA in AML cells, which lead to cell apoptosis.

近年来，随着联合化疗和造血干细胞移植技术的发展，急性髓系白血病（AML）的疗效有了明显改善，但仅有35%~40%成年患者可获得长期生存，多数患者最终出现耐药、复发[1]–[2]。因而深入研究其发病机制并寻找有效的治疗方法十分必要。

Notch信号通路是进化上高度保守的信号途径，介导相邻细胞间的信号转导[3]。造血细胞与造血微环境的基质细胞分别表达Notch受体和配体，激活Notch信号通路，对细胞增殖分化起着重要作用[4]。研究显示Notch信号通路的异常与多种血液系统的恶性肿瘤如淋巴瘤、白血病等发病相关[5]–[6]。我们在前期的研究中构建表达了一种新型内皮细胞靶向的可溶性融合蛋白hD1R，由人Notch配体Delta-like1（hDll1）的截短体即hDll1第127~225位氨基酸和血管内皮细胞靶向蛋白质基序RGD组成。其中RGD是以精氨酸（R）-甘氨酸（G）-门冬氨酸（D）为核心的多肽，可以特异识别血管内皮细胞表面的整合素分子，从而将与之融合的蛋白分子锚定于血管内皮细胞表面。同时我们也建立了以hD1R蛋白结合人脐静脉内皮细胞（HUVEC）及外源性生长因子为基础的共培养体系[7]–[8]。本研究中我们在共培养体系的基础上，观察了hD1R蛋白对AML细胞增殖的影响，为AML的治疗提供实验依据。

对象与方法

一、研究对象

以2015年12月至2016年6月在我院初诊的24例AML患者为研究对象，其中男14例，女10例，中位年龄45（18~65）岁。AML患者同时采用FAB和WHO标准进行分型诊断[9]，其中M1 1例，M2 4例，M3 2例，M4 4例，M4E 2例，M5 4例，慢性髓性白血病急变期4例，骨髓增生异常综合征转白血病3例。以9例白细胞或血小板计数略低，但骨髓象未见异常者为对照，男5例，女4例，中位年龄43（20~54）岁。本研究得到患者及对照者知情同意并获得医院医学伦理委员会审批通过。

二、主要试剂与仪器

PrimeScript RT Reagent kit、SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ为日本TaKaRa公司产品，TRIzol为美国Invitrogen公司产品，Human CD34 MicroBead Kit、MS分选柱为德国Miltenyi Biotec公司产品，重组人干细胞因子（SCF）、TPO、Flt-3配体（FL）、IL-6、IL-3为美国Peprotech公司产品，人淋巴细胞分离液为碧云天生物技术有限公司产品，StemSpan™无血清培养液为加拿大Stemcell公司产品，M199、胎牛血清（FBS）为美国Gibco公司产品，γ-分泌酶抑制剂（GSI）、内皮细胞生长添加剂（ECGS）、Ⅱ型胶原酶为美国Sigma公司产品，FITC anti-human CD34、FITC anti-IgG为美国Biolegend公司产品，Annexin Ⅴ-FITC细胞凋亡检测试剂盒为美国Biotech公司产品。

三、实验方法

1．重组hD1R融合蛋白诱导表达及纯化：表达载体pET32a-hD1R由空军军医大学遗传与发育教研室馈赠。蛋白纯化检验参照我们的前期研究[10]。

2．HUVEC的分离、培养：具体实验步骤参照我们的前期研究[7]–[8]。

3．人骨髓CD34+细胞分离、培养：采集患者及对照者骨髓15 ml，肝素抗凝，样品采集后在4 h内分选。用淋巴细胞分离液（1.077 g/ml）分离单个核细胞。按照Human CD34 MicroBead Kit说明书进行分选。获得CD34+细胞，冻存于−80 °C用于后续实验。

将冻存的CD34+细胞解冻复苏，用StemSpan™无血清培养液重悬，接种于含HUVEC作为支持细胞的6孔板中培养，细胞密度为1×105/ml，并加入5种重组人生长因子（5GF）：TPO（20 ng/ml）、SCF（120 ng/ml）、FL（50 ng/ml）、IL-6（5 ng/ml）、IL-3（5 ng/ml），置于37 °C、饱和湿度、5% CO2的培养箱中培养，培养48 h后，收集悬浮细胞，经锥虫蓝染色法计算细胞活率，采用流式细胞术进行活细胞绝对计数。分别将AML组和对照组细胞按以下不同培养条件分组观察：①HUVEC+5GF+hD1R+CD34+细胞共同培养（hD1R组）；②HUVEC+5GF+PBS+CD34+细胞共同培养（PBS组）；③5GF+CD34+细胞共同培养（5GF组）；④HUVEC+5GF+hD1R+GSI+CD34+细胞共同培养（GSI组）。在培养过程中使用hD1R的工作浓度为2.5 µg/ml，使用GSI的工作浓度为10 µmol/L。

4．实时定量PCR检测基因mRNA水平：将CD34+细胞在不同培养条件下培养48 h后，收集悬浮细胞，加TRIzol裂解细胞，按试剂说明提取细胞总RNA，用实时定量PCR检测相关基因的mRNA水平。实时定量PCR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司设计并合成。引物序列见表1。实时定量PCR条件：95 °C预变性30 s，95 °C变性30 s，60 °C延伸34 s，共进行45个循环。每个样本设3个复孔，以GAPDH作为内参照。实验结果用ABI 7500软件进行分析，采用2−ΔΔCt法表示。

表1

引物序列

基因	引物序列（5′→3′）		产物长度(bp)
	上游引物	下游引物
GAPDH	CTTTTGCGTCGCCAGCCGAG	CCAGGCGCCCAATACGACCA	90
Notch1	GCCAGAGTGGACAGGTCAGT	ACACACACGCAGTTGTAGCC	120
Notch2	CAGGCAGGATTTGATGGAGT	GGCACAAGCAAGAGAAGGAG	115
Notch3	TGGCGCCTCTTCAACAACA	ATCCCAGCCGCACTCCTC	189
Notch4	TGCCTCTGCCCCTCTGGT	TGGCCTTGTCTTTCTGGTCCT	106
Hes1	ACGACACCGGATAAACCAAA	CCGCGAGCTATCTTTCTTCA	147
Bcl-2	CCTGTCGATGACTGAGTACC	GAGACAGCCAGGAGAAATCA	128

5．流式细胞术检测细胞凋亡率：收集体外培养48 h后悬浮细胞，流式液洗涤细胞。每管5×105细胞，加入所需流式抗体或70%乙醇的固定液重悬细胞，4 °C孵育30 min，洗涤细胞2次，用300 µl流式液或400 µl PI溶液重悬细胞（PI溶液：PI 50 µg/ml，RNaseA 100 µg/ml，TritonX-100 0.2%），上BD FACS Calibur™流式细胞仪检测细胞凋亡率，将AnnexinⅤ+细胞定义为凋亡细胞。Cellquest软件分析结果。

四、统计学处理

实验数据以±s表示，采用SPSS19.0软件进行统计分析，两组间比较采用t检验，组间差异采用方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1．骨髓CD34+细胞Notch受体mRNA表达：通过实时定量PCR检测Notch受体mRNA在AML患者骨髓CD34+细胞的表达，结果显示AML组Notch1 mRNA的表达水平明显低于对照组（t=3.33，P=0.005），而Notch2、Notch3 mRNA的表达水平与对照组比较差异无统计学意义（P值均>0.05）。AML组Notch4 mRNA的表达水平较对照组升高，差异有统计学意义（t=2.15，P=0.045）。Notch信号靶基因Hes1 mRNA的表达水平AML组较对照组明显减低，差异有统计学意义（t=3.81，P=0.002）（表2）。

表2

Notch受体mRNA在急性髓系白血病（AML）患者骨髓CD34+细胞中的表达水平（±s）

组别	例数	Notch1	Notch2	Nocth3	Nocth4	Hes1
AML组	24	0.87 ± 0.17	1.41 ± 0.22	0.46 ± 0.09	0.58± 0.07	0.37± 0.06
对照组	9	1.99 ± 0.29	2.31 ± 0.41	0.53 ± 0.11	0.33 ± 0.09	0.83± 0.11
t值		3.33	1.94	0.49	2.15	3.81
P值		0.005	0.076	0.624	0.045	0.002

2．重组Notch配体hD1R蛋白对AML患者骨髓CD34+细胞增殖的影响：CD34+细胞在不同条件下培养48 h后，收集悬浮细胞、计数。结果显示在hD1R培养条件下，AML组细胞数较起始细胞数减少约20%，而对照组细胞数较起始细胞数增加1倍以上。在PBS培养条件下，AML组细胞数与对照组比较差异无统计学意义。AML组细胞在hD1R培养条件下较PBS条件下细胞数明显减少，差异有统计学意义（P<0.01）（表3）。其次，在hD1R培养条件下加入Notch信号通路的阻断剂GSI（GSI组）后，AML组细胞数较hD1R培养条件下明显增加（P<0.05），提示GSI可以逆转hD1R对AML细胞的作用。此外，我们也观察HUVEC对AML细胞增殖的影响，在仅有5种生长因子培养条件下（5GF组），AML组细胞数与仅有HUVEC联合5种生长因子（PBS组）相比明显减低（P<0.05）。对照组细胞在不同培养条件下增殖的情况：hD1R组较PBS组细胞数明显增加，加用GSI后，明显抑制了hD1R的扩增作用，与我们前期的结果是一致的（表3）。

表3

不同培养条件下骨髓CD34+细胞增殖情况（×105/ml，±s）

组别	例数	起始细胞数	hD1R组	PBS组	5GF组	GSI组
AML组	24	1.00	0.74±0.13	1.55±0.19a	1.10±0.10	1.47±0.14b
对照组	9	1.00	2.16±0.21	1.36±0.11b	1.01±0.05	1.41±0.15b
t值			5.70	1.10	0.82	0.28
P值			0.005	0.323	0.458	0.790

注：AML：急性髓系白血病。hD1R组：人脐静脉内皮细胞（HUVEC）+五种人源性生长因子（5GF）+hD1R+CD34+细胞；PBS组：HUVEC+5GF+PBS+CD34+细胞；5GF组：5GF+CD34+细胞；γ-分泌酶抑制剂（GSI）组：HUVEC+5GF+hD1R+GSI+CD34+细胞。与hD1R组比较，aP<0.01，bP<0.05

3．细胞凋亡分析：hD1R培养条件下AML组细胞凋亡率明显高于对照组（t=5.94，P=0.009），在PBS、5GF培养条件下AML组与对照组细胞凋亡率差异无统计学意义（表4，图1）。在hD1R培养条件下加入GSI后AML组细胞凋亡率与对照组比较差异无统计学意义。AML组细胞不同培养条件组比较，hD1R组细胞凋亡率明显高于PBS组，加用GSI后，细胞凋亡率明显降低，差异有统计学意义（P值均<0.05）。此外，我们也观察了HUVEC对AML细胞凋亡的影响，在5GF组AML细胞凋亡率较PBS组明显升高（P=0.035）。最后，我们也观察对照组细胞在不同培养条件下凋亡情况：hD1R组与PBS组比较差异有统计学意义（P=0.034），加用GSI后，细胞凋亡率增加，hD1R组与GSI组比较差异有统计学意义（P=0.040）。PBS组较5GF组凋亡率虽有减低，但差异无统计学意义（P=0.080）（表4）。

表4

不同培养条件下骨髓CD34+细胞凋亡情况（%，±s）

组别	例数	hD1R组	PBS组	5GF组	GSI组
AML组	24	18.48±2.51	4.17±0.69a	6.93±0.67a	4.13±0.46a
对照组	9	3.19±0.58	5.53±0.68a	7.27±0.75	5.22±0.57a
t值		5.94	1.41	0.33	1.37
P值		0.009	0.217	0.753	0.230

注：AML：急性髓系白血病。hD1R组：人脐静脉内皮细胞（HUVEC）+五种人源性生长因子（5GF）+hD1R+CD34+细胞；PBS组：HUVEC+5GF+PBS+CD34+细胞；5GF组：5GF+CD34+细胞；γ-分泌酶抑制剂（GSI）组：HUVEC+5GF+hD1R+GSI+CD34+细胞。与hD1R组比较，aP<0.05

图1

不同培养条件下急性髓系白血病细胞凋亡的典型流式分析图

hD1R组：人脐静脉内皮细胞（HUVEC）+五种人源性生长因子（5GF）+hD1R+CD34+细胞；PBS组：HUVEC+5GF+PBS+CD34+细胞；5GF组：5GF+CD34+细胞；γ-分泌酶抑制剂（GSI）组：HUVEC+5GF+hD1R+GSI+CD34+细胞

4．实时定量PCR法检测细胞内Hes1 mRNA表达：为了解hD1R是否激活AML细胞内的Notch信号通路，我们采用实时定量PCR法检测了在不同培养条件下培养48 h后AML组细胞内Hes1mRNA的表达水平。hD1R组、PBS组、GSI组Hes1 mRNA的表达水平分别为7.36±0.69、0.81±0.32、1.54±0.50，hD1R组明显高于PBS组（t=12.18，P=0.000）。在hD1R组培养条件下加入GSI可明显抑制Notch信号通路下游基因Hes1的表达。提示hD1R通过靶向结合在HUVEC表面，可有效激活AML细胞内的Notch信号。

5．实时定量PCR法检测细胞内Bcl-2 mRNA表达：为了解hD1R激活AML细胞内Notch信号促进细胞凋亡的原因，我们采用实时定量PCR法检测了在不同培养条件下培养48 h后AML细胞内抗凋亡基因Bcl-2 mRNA的表达水平。hD1R组、PBS组AML细胞内Bcl-2 mRNA的表达水平分别为0.28±0.07、0.72±0.14，hD1R组明显低于PBS组（t=2.77，P=0.028）。提示hD1R激活AML细胞内的Notch信号通路，下调了抗凋亡基因Bcl-2 mRNA的表达水平，促进AML细胞凋亡。

讨论

在造血系统中，Notch信号通路通过造血微环境中细胞间的相互作用控制细胞命运。除了在生理条件下精确调控细胞的增殖、分化外，在血液肿瘤细胞中，Notch信号的异常激活起着不同的抑癌和促癌作用[11]。研究显示，Notch信号首先被证实可促进人类T淋巴母细胞白血病的发生发展[5]。Notch受体突变也被证实在成熟B细胞白血病及淋巴瘤发病中起重要作用[6],[12]。然而，Notch信号在AML中的作用却颇有争议。Tohda等[13]研究显示Notch-Jagged信号途径异常导致细胞过度自我更新，促进AML的发生。而Yan等[14]报道Notch1过表达可以抑制K562细胞的增殖。因而，Notch信号在AML中的作用还有待进一步明确。

在本研究中我们用实时定量PCR法检测了对照组和初发AML患者骨髓CD34+细胞Notch受体及相关分子的表达。首先研究显示Notch信号相关分子在对照组细胞都有表达，提示Notch信号参与调控正常造血干/祖细胞（HSPC）的生理学特性。其次，在初发AML细胞Notch1~4受体均有表达，但Notch信号通路下游基因Hes1的表达却是降低的，提示初发的AML细胞尽管有Notch受体表达，但Notch信号并无异常激活，相对静默，从而揭示Notch信号对AML细胞在体内生长的生理抑制作用。这与Lobry等[15]及Kannan等[16]的研究结果是一致的。此外，在AML细胞Notch4受体的表达明显上调，大量研究证实Notch4受体优先表达于血管内皮细胞，在AML细胞高表达，可能与异常的血管生成信号转导有关，导致AML患者骨髓中新生血管增加，满足细胞恶性增殖的营养需求[17]–[18]。

在上述研究的基础上，我们用前期研究中构建表达的一种新型内皮细胞靶向的可溶性Notch配体hDlR融合蛋白，分析了激活Notch信号对AML细胞的影响。由于Notch受体和配体都是细胞表面膜蛋白，只有将Notch配体表达在细胞表面或固相化在培养介质表面上才能有效激活Notch信号[19]。由此，我们前期的研究将hDlR蛋白靶向锚定在具有活力的HUVEC表面，可达到有效激活Notch信号的作用。同时我们建立了以hDlR蛋白结合HUVEC及外源性生长因子为基础的共培养体系，对脐血HSPC进行共培养，起到了最佳的扩增作用[7]–[8]。而且Butler等[20]的研究也表明内皮细胞对Notch依赖的造血干细胞（HSC）自我更新和再生起关键作用，也支持了我们的结果。在本研究中，我们仍采用上述的共培养体系，观察了hDlR蛋白对AML患者和正常对照骨髓CD34+细胞的作用。研究发现hDlR蛋白明显促进了正常对照细胞的增殖，这与我们前期的结果是一致[7]–[8]。此外，hDlR蛋白可明显激活AML细胞内的Notch信号，下调抗凋亡基因Bcl-2的表达，抑制了AML细胞的增殖，促进了凋亡。在临床实践中，AML患者的骨髓中，AML细胞和残余的正常HSPC互相竞争的结果决定了患者的临床表现和疾病进程，若能在对AML细胞治疗的同时，高选择性增加体内残余的正常细胞，将在一定程度上降低并发症相关的死亡率。我们的研究为AML治疗提供了新的思路。

近来，骨髓血管龛倍受关注，骨髓血管内皮细胞与AML细胞紧密的交互作用，为AML细胞幸存提供了有利的保护环境，也是AML复发、耐药的重要原因[21]–[23]。在本研究中，我们用PBS代替hDlR蛋白，在仅有HUVEC和生长因子的培养条件下，AML细胞较5GF组有明显增殖，且细胞凋亡也明显减少，表明HUVEC对AML细胞增殖有明显的支持作用，与上述观点是一致的。但在加用了hDlR蛋白后，AML细胞发生了明显凋亡，主要考虑AML细胞内Notch信号的激活，下调抗凋亡基因Bcl-2表达，促进了AML细胞凋亡。我们的前期研究结果显示hDlR蛋白主要抑制HUVEC出芽及管腔形成的能力，抑制新生血管的生成[10]。但对于本研究中体外采用的融合HUVEC（confluent HUVEC），我们尚未观察到hDlR蛋白对其明显的作用。关于hDlR蛋白对AML患者骨髓血管龛的作用，我们还在进一步研究中，这也将成为AML治疗新的靶点。

综上所述，我们的研究结果支持了在AML细胞尚无Notch信号通路的异常改变，激活AML细胞Notch信号，促进细胞凋亡。改良的Notch配体hDlR蛋白对AML细胞有抑制作用，为进一步临床应用提供了实验依据。