Clinical and mutational spectrum of Colombian patients with Pelizaeus Merzbacher Disease.

CASE
PRESENTATION: Pelizaeus Merzbacher Disease (PMD) is an X-linked developmental defect of myelination that causes childhood chronic spastic encephalopathy. Its genetic etiology can be either a duplication (or other gene dosage alterations) or a punctual mutation at the PLP1 locus. Clinically, it presents with developmental delay, nystagmus and, spasticity, supported by neuroimaging in which the defect of myelination is evident. We present a series of seven Colombian patients diagnosed with this leucodystrophy, describing their genotypic and phenotypic characteristics and heterogeneity. CLINICAL
FINDINGS: All patients included were male, 6 months to 16 years of age. Mean age at onset of symptoms was 8 months. Mean age at diagnosis was 5 years 5 months, being classic PMD most frequently diagnosed, as compared to the connatal phenotype. All cases had a primary diagnosis of developmental delay on 100%, and in 28.7% of cases, early onset nystagmus was described. 85.7% of patients had spasticity, 71.4% cerebellar signs, 57.0% hypotonia, and 28.5% had an abnormal movement disorder. Only three patients were able to achieve gait, though altered. In the two patients who had a diagnosis of connatal PMD maturational ages in danger zones according to the WHO Abbreviated Scale of Psychosocial Development were documented. All cases had abnormalities in neuroimages. MOLECULAR ANALYSIS AND
RESULTS: Molecular studies were used in the majority of the cases to confirm the diagnosis (85.7 %). For two cases molecular confirmation was not considered necessary given their affected male brothers had already been tested. PLP1 gene dosage alterations (duplications) were found in 28.5 % of the patients (two siblings), whereas three different single nucleotide variants were detected. CLINICAL RELEVANCE: According to these findings, as authors we propose the diagnostic algorithm in Colombian population to begin on a high clinical suspicion, followed by paraclinical extension, moving on to the molecular confirmation by using approaches to simultaneously sequence the PLP1 gene in order to detect point mutations and in/dels and performing a copy number variation analysis for the detection of gene dosage alterations.

Introduction

Pelizaeus Merzbacher Disease (PMD) is a chronic pediatric leukoencephalopathy caused by disorders of the axonal myelination and the myelin metabolism in the oligodendrocytes, reported for the first time on 1885 by doctor Friedrich Pelizaeus and revisited on 1910 by Ludwig Merzbacher . Its genetic etiology affects the expression of the Proteolipidic Protein type 1 , , varying from hemizygous mutations to gene dosage alterations of the PLP1 (Xq22). Given the location of the causal gene, PMD is inherited in a X-linked recessive manner3.

Although clinical manifestations are heterogeneous , , the most relevant neurological signs are nystagmus, developmental delay, spasticity, along with neuroimaging supporting aberrant myelination of the Central Nervous System (CNS) compromising primarily the periventricular white matter, with a tigroid striation pattern that responds to the conservation of myelinated islets, and also an alteration of the N-acetyl aspartate and choline profiles on the brain magnetic resonance spectroscopy , .

Unlike other leukodystrophies in which there is a period of normal cortical myelination an then comes a disruption resulting in the lost of myelin sheaths (demyelination), PMD has, from the beginning, an abnormal or low production of this very important protein (hypomyelination), due to a damage on the PLP1 gene coding for the Protelipidic Protein type 1 that interferes with the oligodendrocyte synthesis of fully functional myelin sheaths and probably also affects the peripheral function of myelinated axons , .

PMD corresponds to a larger group of neurological phenotypes known as PLP1 related disorders, all being allelic diseases: Connatal PMD, Classic PMD, Nule Syndrome (NS), Complicated Hereditary Spastic Paraplegia type 2 (SPG2) and Uncomplicated Spastic Paraplegia type 2, ranging in a wide variety of clinical manifestations which variability is not yet completely understood , .

In general, PLP1 gene duplications result in a classical form of PMD, nonsense mutations in either form of SPG2 and connatal form of PMD, and other monoallelic mutations have been related to less circumscribed clinical phenotypes . Patients suffering from a connatal form of PMD, the most severe phenotype, have histopathological studies revealing complete absence of myelination in the brain, explaining the rapid clinical deterioration and suggesting tan death of these patients may respond to nervous conduction alterations in brain control centers. There’s also a phenotype of patients with clinical and radiological traits almost identical to those in PMD, with no PLP1 mutations detected, classified as PMD like (PMDL) syndrome .

Frequently, the connatal form of PMD is expressed during the first weeks of life, through key findings in the clinical neurological examination, that include pendular nystagmus, hypotonia and laryngeal stridor; later in life, seizures and sever motor deficits appear, and hypotonia turns to weakening limb spasticity; affected patients may never walk . Verbal language is limited, but patients understand simple orders and can follow them. Affected individuals with the connatal form of PMD die in infancy, usually secondary to respiratory or deglutition complications, such as bronchoaspiration .

Classic PMD is characterized in the first stages of disease by nystagmus, hypotonia and tremor in male affected patients, joint progressively by ataxia and spastic quadriparesis in the school age. Motor impairment of the limbs is less severe tan that presented in the connatal form, and patients can frequently achieve walking even if requiring special aids, and have better control of voluntary movement of the upper limbs , . Classic PMD affected males also have improved cognitive development, with acceptable speech. Survival rates in this patients have been described to be up to the seventh decade of life.

On the other hand, NS patients suffer from a less harmful condition also caused by large deletions or damaging mutations resulting in loss of PLP1 protein product. As the phenotype is thought to be less severe than the other forms of PMD, some case series have even considered NS to be another variant of Complicated SPG2 . Interestingly, it has been described NS affected individuals to have a multifocal demyelinating neuropathy , sometimes being the only clinical feature of the syndrome; NS patients do not present with nystagmus, their spastic paraplegia is mild, affecting primarily the lower limbs, and ataxic compromise may vary. Another differential diagnosis to consider is SPG2, an allelic disorder to PMD and NS, consisting of an heterogeneous constellation of clinical phenotypes primarily characterized by weakening and progressive lower limb spasticity during the first decade of life, with previous normal motor development. Patients can also have nystagmus, optic atrophy, dysarthria, ataxic features and variable range of intellectual disability; however, symptoms appear to be less compromising tan those presenting in classic PMD. Most of mutations detected on individuals diagnosed with SPG2 are missense . Also, it is worth mentioning that SPG2 affected males can reproduce, while there are no reports of PMD affected males who have descendants .

This article describes seven Colombian individuals with clinical, paraclinical and molecular diagnosis of PMD, through phenotype and gene variant characterization.

Ethical approval

Written informed consent was obtained from patient’s parents / legal guardians for publication of this report. Copies of the written consents are available for review by the Editors of this journal and are kept within the clinical records of each patient.

This study was approved by the ethics committee of the Faculty of Medicine of Universidad Nacional

Case series presentation

Seven individuals ages 6 months to 16 years (4 probands, 3 male relatives of the probands), diagnosed clinically, paraclinically and molecularly as Pelizaeus Merzbacher patients, attended in different medical care centers in Colombia (Fig. 1). They underwent clinical evaluations, neuroimaging (i.e. brain MRI), electro diagnosis (evoked visual and auditory potentials, electromyography, neural conduction velocity tests, computerized testing of gait), biochemical testing (i.e. blood and urine amino acids) and genetic testing (karyotyping, deletion/duplication analysis of PLP1 or whole gene sequencing of PLP1, targeted mutation studies). Also, we applied the PMD functional disability scoring system and the WHO Abbreviated Scale of Development to assess the degree of developmental retardation and disability on our patients .

Figure 1

Pedigrees of families of the participant individuals. Note that patients are cited on the tables with their assigned pedigree numbers.

Methodologies used for the genetic testing of PLP1 gene were either multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA) using SALSA P022 A1 or B1 and P071 kits (MRC-Holland), which tested for deletions or duplications, whole gene sequencing by Sanger method for the detection of point mutations or small in/dels, or QT-PCR to confirm the presence of family mutations. In order to evaluate the impact of the molecular alterations detected, we used software as PolyPhen - 2 v.2.1 (http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/), HumVar model (http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2) and SIFT (http://sift.jcvi.org) to predict pathogenic or benign changes on the PLP1 proteic product, having as reference sequence the one published under the entry NM_000533.3 (NCBI RefSeq, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore) in the NCBI public databases.

Results

All patients were male, 6 months to 16 years of age, one of them died by the age of 5 due to complications of a respiratory infection. Mean age of onset of symptoms was 8 months, presenting with developmental delay on 100% of the cases and early onset nystagmus in 28.7%. Mean age at diagnosis was 5 years 5 months, being classic PMD most frequently diagnosed, in five cases, whereas the connatal phenotype was only present in two of the patients, (28.5%).

In our sample, two patients had history of cerebral palsy, being an actual comorbidity in only one of them. It is worth saying that all patients exhibited some level of speech delay or learning difficulties, and that only two were going to school.

In the physical examination, 57.0% of the patients had horizontal nystagmus while the others had the classic rotatory phenotype; none of them had oculomotor palsy or optic nerve atrophy; three individuals had any degree of sensorineural hearing loss. 57.0% showed signs of hypotonia, 28.5% an abnormal movement disorder, 71.4% any cerebellar signs, 85.7% any degree of spasticity, annotating that only three achieved gait with evident difficulties.

As for the two patients who had diagnosis of connatal PMD, it was documented both had experienced swallowing or deglutory disorders, history of seizures, microcephaly (in just one of them) and maturational ages in danger zones according to the WHO Abbreviated Scale of Psychosocial Development (WHO Abbreviated Scale of Psychosocial Development, https://www.unicef.org/bolivia/integrated_local_development_1480.htm).

When testing them for the PMD functional disability scoring system, all seven individuals had any level of disability, being moderate in 57.0% of the patients (10 to 20 points) or severe in 28.5% (under 10 points); it was not possible to evaluate the score on one patient given his very young age (Clinical endpoints shown in Table 1).

Table 1

Results from the clinical evaluation of patients with Pelizaeus Merzbacher Disease.

Clinical features	1. III - 1	1. III - 2	3. III - 7	2. III - 2	2. III - 1	4. V - 2	3. III - 6
Age at onset	2 yr.	14 ms.	6 ms.	5 yr.	1 yr.	6 ms.	0 ms.
Age at diagnosis	5 yr 11 ms.	2 yr y 8 ms.	1.5 yr.	9 yr.	12 yr.	7 yr.	3 ms.
First symptoms	No head support or crawling.	DD. Nystagmus.	Hypotonia. DD.	DD.	DD.	No head support or crawling.	Laryngeal stridor. Nystagmus.
DD/ID	(+)	(+)	(+)	(+)	(+)	(+)	(+)
Nystagmus	Horizontal.	Horizontal.	Rotatory.	Rotatory.	Rotatory.	Horizontal.	Horizontal.
Language alteration	(+)	(+)	(+)	(+)	(+)	(+)	NA.
Spasticity	(+)	(+)	(+)	(+)	(+)	(+)	(-)
Walking	(-)	(-)	(-)	(+)	(+)	(+)	NA.
Swallowing issues	(-)	(-)	(+)	(-)	(-)	(-)	(+)
Hypotonia	(-)	(+)	(+)	(-)	(-)	(+)	(+)
Dysmetria/ Dysdiadochokinesia / Ataxia	(+)	(+)	(-)	(+)	(+)	(+)	(-)
PMD disability scoring system	8 PTS.	11 PTS.	2 PTS.	14 PTS.	18 PTS.	13 PTS.	NA.
WHO ASC	72 PTS.	94 PTS.	29 PTS.	115 PTS.	86 PTS.	100 PTS.	25 PTS.

Yr: Year. Ms: Months. DD: Developmental delay. ID: Intellectual disability. NA: Not applicable. PTS: Points. WHO ASC: World Healt Organization Abbreviated Scale of Development. (+): Present. (-): Absent.

Neuroimaging of patients with classic PMD showed evidence of T2 hyperintensities both diffuse or periventricular in the supratentorial withe matter. Other encephalic structures such as the brainstem, basal nuclei and cerebellum showed no abnormalities. In the connatal form affected individuals, we also observed hypo intensities of the basal nuclei and grey matter atrophy. 42.8% of the patients presented abnormal evoked auditory potentials and 28.5% abnormal evoked visual potentials; only one patient had abnormal neuro conduction velocities en another one had high levels of Mio inositol when tested for brain spectroscopic patterns.

Molecular studies were used in the majority of the cases to confirm the diagnosis. For two cases molecular confirmation was not considered necessary given their affected male brothers had already been tested. PLP1 gene dosage alterations (duplications) were found in 28.5% of the patients (two siblings), whereas three different single nucleotide variants were detected: c.140T>C (p.I47T), a missense variant classified as pathogenic, and two previously unreported alterations, the c.609C>T (p.Q99X) nonsense variant in two patients, and in one patient the c.152T>A (p.F51Y) missense variants. Laboratory endpoints are shown in Table 2.

Table 2

Results from the paraclinical evaluation of patients with Pelizaeus Merzbacher Disease.

Paraclinical evaluation	1. III - 1	1. III - 2	3. III - 7	2. III - 2	2. III - 1	4. V - 2	3. III - 6
Connatal absence or myelin on MRI	(-)	(-)	(+)	(-)	(-)	(-)	(+)
MRI Hyperintensities localization	SC. PV.	Diffuse.	Diffuse.	PV.	PV / PaV.	PV. / PaV.	Diffuse.
Cerebral Spectroscopy	RP.	Normal patterns.	PV white matter irregular signal on T2.	Normal patterns.	Normal patterns.	PV posterosuperior white matter irregular signal on T2.	Normal patterns.
Auditory Evoked Potentials.	Auditory desynchrony. Type A tympanometry.	Auditory desynchrony vs. Auditory neuropathy. Severe compromise of physiological thresholds.	Normal patterns.	Normal patterns.	Normal patterns.	Normal patterns.	Normal patterns.
Visual Evoked Potentials.	Retrocorneal functional disorder.	Diffuse compromise of retinocorial pathways with axonal lost pattern.	Normal patterns.	Normal patterns.	Normal patterns.	Normal patterns.	RP.
NCV	Normal patterns.	Peroneal axonal neuropathy.	RP.	Normal patterns.	Normal patterns.	Normal patterns.	RP.
EMG	Normal patterns.	Normal patterns.	RP.	Normal patterns.	Normal patterns.	Normal patterns.	RP.
As worth spasticity index	UL 2 / IL 4.	UL 2 / IL 3.	UL / IL 4.	UL 1+ / IL 2.	UL 1+ / IL 1+.	RB 1+ / LB 1.	NA.
PLP1 molecular analysis	Complete duplication.	Complete duplication.	c.140T>C (p.I47T) hemizygous.	c.609C>T (p.Q99X) hemizygous.	c.609C>T (p.Q99X) hemizygous.	c.152T>A (p.F51Y) hemizygous.	c.140T>C (p.I47T) hemizygous.

(+): Present. (-): Absent. MRI: Cerebral magnetic resonance imaging. NA: Not applicable. SC: Subcortical. PV: Periventricular. PaV: Paraventricular. RP: Results pending. NCV: Nerve conduction velocities. EMG: Electromyography. UL: Upper Limbs. IL: Inferior limbs.

Discussion

We present one of the first Latin-American series of patients with clinical diagnosis and molecular confirmation of Pelizaeus Merzbacher disease, being the classical form more frequent than the connatal form in the evaluated patients.

Developmental delay associated with nystagmus was key to diagnosis, both present in 100% of the cases. Along with the high clinical suspicion, supporting neuroimaging and molecular analysis permit an appropriate genetic counselling.

Connatal form of PMD is less frequent and far more severe than the classic phenotype. In our study, it is to note patients with the connatal form showed worse scores of disability (High severity scores in the PMD Disability Scoring System) and more pronounced developmental delay, and those continue to worsen until their deaths.

Diagnosis can be mistaken primarily with SPG2, also caused by mutations on the PLP1 gene, differing on signs such as autonomic dysfunction and characteristic paraplegia. NS, a variant of the PMD spectrum, presents as a periphery demyelinating neuropathy. Among other differential diagnosis we can count Krabbe disease, Canavan disease, other leukodystrophies and cerebral palsy. Connatal form of PMD is more severe than the classical form, a verifiable fact in our series, and with a reported expectancy of life lower than the first decade of life.

Point mutations were more frequently found, disregarding previous reports where >50% of PLP1 alterations are duplications. Case series have reported point mutations as the etiology of PMD related phenotypes in nearly 30% of male affected patients, yet we report them to be present in 71.5% of our cases and cannot rule out a signature genetic background for Latin-American patients with PMD, despite simple size (Scheme of mutations found in Figure 2).

Figure 2

Schematic view of mutations found in our patients and previously reported mutations affecting PLP1 protein.

PLP1 gene is located in chromosomal region Xq22, with a 17 kb length, 7 exons and 6 introns. Exon 1 only transcribes the start codon, while exons 2, 3, 4, and 5 encode the hydrophobic domains and the hydrophilic chains of the protein. C-terminal transmembrane domain is encoded by exons 6 and 7. Besides the C-terminal hydrophilic domain, exón 7 contains the 3’UTR , . PLP1 is further translated into the proteolipid protein 1 (PLP1), a 276 aminoacid peptide, or the isoform called DM20, which loses 35 residues inside its intracellular loop. Both PLP1 and DM20 are highly hydrophobic membrane proteins, accounting for up to 50% of compact myelin proteins in the central nervous system of the adult . PLP1/DM20 exact way of functioning has not been described precisely to date; however, it is clear they are needed for assembly and stability of the myelin sheath, and as before mentioned, PLP1 mutations have been widely studied as cause of PMD and SPG2. Studying male affected patients and animal models has led us to defy PLP1/DM20 actively participate in the synthesis of myelin intraperiod line, myelin compaction, myelin sheath adhesion to oligodendrocyte membrane, etc. A wide range of mutations in PLP1 has been described, recurrently detecting a whole gene duplication as the most frequent alteration , , .

Mutation c.140T>C found in our patients with the connatal form of the disease has already been reported by Hoffmann et al. in patients with classic PMD . Grossi et al. , reported a similar mutation in a patient with a classic phenotype, an exon 2 microduplication (c.134_140dup7) that caused a frameshift (p.Ile47IlefsX4) and resulted in a truncated protein product, 4 amino acids downstream . We believe it is important to establish the biochemical functionality of I47 position on the myelin proteolipidic protein to evaluate its impact on the connatal phenotype of PMD disease, given that there are not functional studies to this date that prove in vitro or in vivo effects.

Nonsense mutation c.609C>T (p.Q99X) and missense mutation c.152T>A (p.F51Y) have not been previously reported as causes of PMD disease, but both their SIFT and PolyPhen scores suggest they are damaging (0.82 and 0.98 Polyphen scores respectively). This variants express as a compromise of two functional domains of the PLP1 protein: c.609C>T (p.Q99X) affects the cytoplasmic domain while c.152T>A (p.F51Y) affects an extracellular topological domain , .

In a smaller percentage of cases triplications and other dosage alterations in the PLP1 gene have been reported, and less than 2% of cases so far reported have shown a complete or partial deletion of the gene - .

Conclusions

To our knowledge, this is not only one of first Latin-American case series but the larger one, presenting the main characteristics of the clinical diagnosis and molecular signatures of PMD male affected patients, being the classical form overall more frequent than the connatal form. Both patients with the connatal form of the disease had severe disability scores and poor vital prognosis, despite having the chance of an earlier diagnosis.

According to our results, we propose that for our population the diagnostic algorithm begins on a high clinical suspicion, followed by paraclinical extension in which neuroimaging is crucial, moving on to the molecular confirmation by using approaches to simultaneously sequence the PLP1 gene in order to detect point mutations and in/dels and performing a deletion/duplication analysis for the detection of gene dosage alterations.

In spite of the incapacitating character of this disease, patients with less severe or moderate forms of PMD have rather normal life expectancy, but there are records of patients with severe classical forms who died past the second decade of life. Because of this, it is a priority for the clinical specialists and treating physicians to improve the diagnosis algorithms in order to shorten time before establishment of the specific therapeutic plan and the appropriate genetic counselling for the families.

Introducción

La leucodistrofia o enfermedad de Pelizaeus Merzbacher (PMD) es una encefalopatía crónica de la infancia causada por desórdenes de la mielinización axonal y del metabolismo de la mielina oligodendroglial, descrita por primera vez en 1885 por Pelizaeus y estudiada a mayor profundidad en 1910 por Merzbacher . Su etiología es genética por mutación hemicigota o alteraciones en la dosis génica del gen PLP1 (Xq22), que afectan la expresión de la Proteína Proteolipídica de la Mielina 1 ,. Dada la localización y función del gen causal, PMD presenta una herencia ligada al cromosoma X recesiva .

Aunque las manifestaciones clínicas son muy heterogéneas ,, los signos clínicos primarios neurológicos incluyen nistagmo, retardo global del desarrollo, espasticidad, acompañados de características radiológicas vistas por Resonancia Nuclear Magnética cerebral (RM) como una mielinización del sistema nervioso central (SNC) aberrante de predominio periventricular sin afectación subcortical, junto a la presencia de islotes mielinizados que dan una apariencia ‘tigroide’ a la sustancia blanca, así como alteración de los patrones de N-acetil aspartato y colina en la espectroscopía que reflejan anomalías mielínicas axonales ,.

A diferencia de otras leucodistrofias en las que la mielina se produce pero es destruida posteriormente (desmielinizantes), en los pacientes con PMD la mielina no se produce de forma adecuada. Se cree que la hipo o dismielinización responde principalmente a que la afectación de la proteína proteolipídica mielínica afectada interfiere con la formación de las vainas de mielina de los oligodendrocitos en el SNC y con la formación de éstas vainas en los axones periféricos ,.

La PMD forma parte de un grupo más amplio de fenotipos neurológicos conocidos como trastornos relacionados con el gen PLP1, que son todos desórdenes alélicos: la forma connatal de PMD, la forma clásica de PMD, el síndrome nulo (SN), la Paraplejía Espástica tipo 2 (SPG2) complicada y la Paraplejía Espástica tipo 2 no complicada, todos ellos caracterizados por un diverso espectro de manifestaciones clínicas, cuya explicación de variabilidad no se comprende completamente ,.

En general, se considera que las duplicaciones del gen PLP1 dan lugar a la forma clásica de PMD, las mutaciones nonsense a las formas de Paraplejía Espástica complicada o no complicada (SPG2) y a la forma connatal de PMD y otras mutaciones monoalélicas se han relacionado con diferentes formas clínicas menos delimitadas . En los pacientes con la forma connatal de PMD, que es la más severa, el estudio histopatológico revela una ausencia completa de la mielinización en todo el cerebro, lo que podría explicar el rápido deterioro clínico y sugiere que la muerte, que en ocasiones es inexplicable, sea causada por alteraciones de la conducción nerviosa en los centros de control vital encefálicos. Existe un grupo de pacientes con características clínicas y neurorradiológicas casi idénticas a la PMD, en los que no se detectan mutaciones de PLP1 y que se clasifican como pacientes con un síndrome PMD like (PMLD) .

Clínicamente, la forma connatal de PMD se hace manifiesta en las primeras semanas de vida, por hallazgos al examen neurológico del recién nacido que incluyen nistagmos pendular, hipotonía, y estridor laríngeo; en edades más avanzadas aparecen crisis epilépticas y déficit motor severo y la hipotonía tiende a transformarse en espasticidad de las extremidades que puede ser muy limitante, con pacientes afectados que pueden nunca lograr la marcha o tener buena funcionalidad de sus miembros superiores . El lenguaje verbal es limitado, pero los pacientes comprenden órdenes sencillas. Los individuos afectados con esta forma de PMD mueren en la infancia, generalmente por complicaciones relacionadas con problemas deglutorios, como lo es la broncoaspiración .

La forma clásica de PMD descrita por Pelizaeus y posteriormente por Merzbacher, se caracteriza inicialmente por la aparición de nistagmos, hipotonía y tremor en los varones afectados, que se acompañan progresivamente de ataxia y cuadriparesia espástica. Lo anterior ocurre en los primeros años de vida. El compromiso motor de las extremidades es menos severo que en la forma connatal, logrando la marcha pero usualmente con requerimiento de dispositivos de apoyo y en porcentaje importante de los casos con un adecuado control voluntario de los miembros superiores ,. Los afectados también tienen mejor desarrollo cognitivo que aquellos que padecen la forma connatal, con lenguaje verbal aceptable. La supervivencia de los pacientes con esta forma de la enfermedad se ha descrito incluso hasta la séptima década de la vida.

Existe también una variante de PMD conocida como Síndrome Nulo (SN). Se trata de una condición causada por la presencia de grandes deleciones genómicas o mutaciones que resultan en la pérdida de las proteínas PLP1/DM20 en la que los pacientes presentan un único fenotipo clínico descrito como más leve que el causado por otras mutaciones en el mismo gen, y que en algunas series de pacientes es considerada como una forma complicada de SPG2 . De manera interesante, se describe que estos pacientes presentan una neuropatía periférica desmielinizante multifocal ,, que incluso puede ser el único hallazgo del SN; los pacientes con SN no presentan nistagmos y la paraplejia espástica que padecen es usualmente leve, se asocia a variables grados de ataxia, y afecta principalmente a los miembros inferiores.

El segundo diagnóstico diferencial a tener en cuenta es la paraplejia espástica hereditaria de tipo 2 (SPG2), enfermedad alélica a PMD y el SN. SPG2 representa un grupo de desórdenes genéticamente heterogéneo con una amplia variabilidad clínica, en el que individuos que la padecen generalmente tienen desarrollo motor normal en los primeros años de vida, con inicio de debilidad más espasticidad progresiva de las extremidades inferiores entre los 2 y los 10 años de edad; los pacientes pueden presentar también nistagmos, atrofia óptica, disartria, ataxia, y grados variables de discapacidad intelectual en las formas complicadas; sin embargo, estos síntomas aparecen con menor severidad que en el fenotipo clásico de PMD. Las mutaciones hasta ahora descritas encontradas en individuos con diagnóstico de SPG2 son principalmente de sentido erróneo (missense) . Cabe anotar que se han reportado descendientes de varones con SPG2 pero no de varones con PMD .

En este artículo se describe a siete individuos con diagnóstico clínico, paraclínico y molecular compatible con PMD a partir de la descripción fenotípica y genotípica de esta enfermedad en pacientes colombianos.

Consideraciones éticas

Se obtuvo el consentimiento informado de los acudientes legales de los pacientes para la publicación de este reporte de casos.

Este estudio fue aprobado por el comite de etica de la Facultad de Medicina de la Universidad Nacional de Colombia

Presentación de casos

La metodología utilizada para las pruebas genéticas del gene PLP1 fue la amplificación de sondas dependiente de ligandos múltiples (MLPZ) usando los kits SALSA P022 A1 o B1 y P071 (MRC-Holland), para probar delecion o duplicación y ña secuenciación del gen por el método de Sanger para la detección de mutaciones puntuales o in/del pequeños, o QT-PCR para confirmar la presencia de mutaciones familiares. Para evaluar el impacto de las alteraciones moleculares usamos los programas PolyPhen - 2 v.2.1 (http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/), HumVar model (http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2) y SIFT (http://sift.jcvi.org) para predecir los cambios patogenicos o benignos en el produto proteico de PLP1, teniendo como referencia la secuencia de la publicación NM_000533.3 (NCBI RefSeq, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore) en la base de datos publica de NCBI.

Resultados

Se incluyeron 7 pacientes con edades de 6 meses a 16 años (4 probandos, dos hermanos y un primo, todos afectados) con diagnóstico clínico, paraclínico y molecular de PMD, atendidos en diferentes centros asistenciales de Colombia. Las genealogías de los casos se muestran en la Figura 1. Dependiendo del subtipo de PMD (clásico o connatal), de la historia natural de la enfermedad y de sus diagnósticos diferenciales iniciales, los pacientes tuvieron acceso a neuroimágenes (RM cerebral simple / contrastada / espectroscopía), electrodiagnóstico (potenciales evocados auditivos, potenciales evocados visuales, electromiografía, velocidades de neuroconducción o test computarizado de marcha), pruebas bioquímicas (estudios diagnósticos para descartar aminoacidopatías o acidemias orgánicas, por ejemplo) y genéticas (cariotipo, estudio molecular de gen PLP1 y estudio de portadores), para poder determinar el diagnóstico final. Además se tuvo en cuenta las variables clínicas y paraclínicas para poder determinar el grado de severidad de la enfermedad empleando el PMD functional disability scoring system, el cual evalúa el impacto de la discapacidad en esta patología .

Figura 1

Genealogías de los casos presentados. Se incluyeron siete pacientes con diagnóstico clínico, paraclínico y molecular de PMD, en A. Los individuos III.1 y III.2, en B. Los individuos III.1 y III.2, en C los casos III.6 y III.7, en D el individuo V.2. Se demuestran las relaciones de consanguinidad entre algunos de ellos, comentadas en el texto: Dos parejas de hermanos, una pareja de primos, y un caso en quien no se conoció a otros familiares afectados.

Para los estudios moleculares se realizaron varios abordajes técnicos, tanto para el análisis de dosis génica como para la detección de mutaciones puntuales. En el primer caso se empleó el test de amplificación múltiple de sondas dependiente de ligamiento (MLPA por sus siglas en inglés), usando el SALSA P022 A1 o B1 y P071 (MRC-Holland), de acuerdo a las recomendaciones del proveedor o el protocolo de QT PCR cuantitava, y en un segundo abordaje se empleó secuenciación del gen PLP1, ya que el análisis por MLPA para deleción o duplicación fue negativo.

En el análisis de la variantes encontradas en el gen PLP1, se empleó la secuencia de referencia NM_000533.3 (NCBI RefSeq, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/5354) y para valorar el impacto de las mutaciones en la estructura proteica y la función se sometieron los resultados a diferentes programas de predicción bioinformática como PolyPhen - 2 v.2.1 (http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2) y SIFT (http://sift.jcvi.org).

Todos los pacientes analizados fueron de sexo masculino, con edades entre 6 meses a 16 años, uno de ellos fallecido a los 5 años de vida por infección respiratoria complicada. La edad promedio de inicio de síntomas fue de 8 meses, con retardo del desarrollo motor en el 100% de los casos, acompañado de nistagmos en el 28.7%. La media de edad de diagnóstico fue de 5 años 5 meses, siendo el diagnóstico de PMD clásica el más frecuente, con cinco pacientes, mientras el tipo connatal se encontró en dos individuos relacionados (28.5%).

En esta muestra, dos pacientes presentaron como antecedente, diagnostico de parálisis cerebral, estando realmente presente como comorbilidad en uno de ellos, lo cual se pudo confirmar por los hallazgos prenatales de su historia clínica. Adicional al retardo del desarrollo existente en esta muestra, todos los pacientes cursaron también con algún grado de retardo del lenguaje. De los 5 pacientes mayores de 5 años, solamente 2 se encontraban escolarizados y su rendimiento académico fue irregular.

Al examen físico de los pacientes descritos, el 57.0% cursaron con nistagmus horizontal y los 3 pacientes restantes con enfenotipo rotatorio clásico; ninguno presentó parálisis de oculomotores ni atrofia de nervio óptico y 3 pacientes tuvieron hipoacusia neurosensorial. El 57.0% presentaron hipotonía, el 28.5% movimientos anormales, el 71.4% signos cerebelosos, el 85.7% tenían algún grado de espasticidad. Cabe anotar que tres 3 pacientes lograron la marcha, aunque esta es fue patológica.

En los dos pacientes con la forma connatal se documentó dificultad para la alimentación, antecedentes de crisis convulsivas, en uno de ellos se encontró microcefalia y ambos tenían una edad maduracional motora en el rango de Alerta, de acuerdo a la escala abreviada del desarrollo de la OMS (WHO Abbreviated Scale of Psychosocial Development, https://www.unicef.org/bolivia/integrated_local_development_1480.htm).

Al aplicar el PMD functional disability scoring system sobre los 7 pacientes, todos presentaron puntajes de discapacidad moderada (10 a 20 puntos en el 57.0% de los pacientes) a severa (por debajo de 10 puntos en el 28.5%), excepto por un paciente en el que por su corta edad no fue posible evaluarlo. Los resultados del análisis clínico se encuentran resumidos en la Tabla 1.

Tabla 1

Resultados de la evaluación clínica de los pacientes con Pelizaeus Merzbacher.

Caractersísticas clínicas	1. III - 1	1. III - 2	3. III - 7	2. III - 2	2. III - 1	4. V - 2	3. III - 6
Edad de inicio	2 años	14 meses	6 meses	5 años	1 año	6 meses	0 meses
Edad al diagnóstico	5 años 11 meses	2 años y 8 meses	1.5 años	9 años	12 años	7 años	3 meses
Primeros síntomas o signos	DD	DD. Nistagmos	Hipotonía. DD	DD	DD	DD	Estridor laríngeo. Nistagmos
DD/ID	+	+	+	+	+	+	+
Nistagmos	Horizontal	Horizontal	Rotatorio	Rotatorio	Rotatorio	Horizontal	Horizontal
Trastorno del lenguaje	+	+	+	+	+	+	NA
Espasticidad	+	+	+	+	+	+	-
Marcha	-	-	-	Autónoma, con dificultad	Autónoma, con dificultad	Autónoma, con dificultad	NA
Trastornos deglutorios	-	-	+	-	-	-	+
Hipotonía	-	+	+	-	-	+	+
Dismetría/ Disdiadoconesia / Ataxia	+	+	-	+	+	+	-
PMD disability scoring system	8 PTS	11 PTS	2 PTS	14 PTS	18 PTS	13 PTS	NA
WHO ASC	72 PTS	94 PTS	29 PTS	115 PTS	86 PTS	100 PTS	25 PTS

DD: Retardo del desarrollo. ID: Discapacidad Intelectual. NA: No aplica. PTS: Puntos. WHO ASC: World Healt Organization Abbreviated Scale of Development / Escala abreviada del desarrollo de la OMS. (+): Presente. (-): Ausente.

Las neuroimagenes de los pacientes con PMD clásico reportaron hiperintensidades tanto difusas como periventriculares de la sustancia blanca supratentorial. Las estructuras como el tallo cerebral, los núcleos basales y el cerebelo no presentaron alteraciones. En los casos de la forma connatal, se observó, además de lo descrito arriba, hipointensidades de los núcleos basales y atrofia de sustancia gris. El 42.8% presentaron alteraciones en los potenciales evocados auditivos y en el 28.5% en los visuales; un paciente mostró alteraciones en la neuroconducciones y en un caso, se observó un incremento de Mioinositol determinado en la espectroscopia por resonancia.

El diagnóstico molecular se empleó en la mayoría de los casos (85.7%), encontrando alteraciones en la dosis génica en el 28,5% y tres diferentes mutaciones puntuales, dos de ellas no reportadas previamente. Dos pacientes presentaron la duplicación completa del gen PLP1, otros dos presentaron la mutación misssense c.140T>C (p.I47T), en dos pacientes se encontró la mutación nonsense c.609C>T (p.Q99X) y otro paciente presentó la mutación missense c.152T>A (p.F51Y), estas dos últimas, privadas. Los resultados del análisis paraclínico de los casos se encuentran resumidos en la Tabla 2.

Tabla 2

Resultados de la evaluación paraclínica de los pacientes con Pelizaeus Merzbacher.

Paraclínicos	1. III - 1	1. III - 2	3. III - 7	2. III - 2	2. III - 1	4. V - 2	3. III - 6
Ausencia connatal de mielina en la resonancia magnética	-	-	+	-	-	-	+
Localización de hiperintensidades en la resonancia magnética	SC. PV	Difusas	Difusas	PV	PV / PaV	PV /PaV	Difusas
Espectroscopia cerebral	SD	Patrones normales	Señal irregular de la materia blanca PV en T2	Patrones normales	Patrones normales	Señal posterosuperior PV de materia blanca irregular en T2	Patrones normales
Potenciales Evocados Auditivos	Desincronía auditiva. Timpanometría tipo A.	Desincronía auditiva vs. Neuropatía auditiva. Grave compromiso de los umbrales fisiológicos	Patrones normales	Patrones normales	Patrones normales	Patrones normales	Patrones normales
Potenciales Evocados Visuales	Trastorno funcional retrocorneal	Compromiso difuso de las vías retinianas con patrón e pérdida axonal	Patrones normales	Patrones normales	Patrones normales	Patrones normales	SD
VNC	Patrones normales	Neuropatía axonal peronea.	SD	Patrones normales	Patrones normales	Patrones normales	SD
EMG	Patrones normales	Patrones normales	SD	Patrones normales	Patrones normales	Patrones normales	SD
Índice de espasticidad de Asworth	MS 2 / MI 4	MS 2 / MI 3	MS / MI 4	MS 1+ / MI 2.	MS 1+ / MI 1+.	MS 1+ / MI 1	NA.
Estudio molecular de PLP1	Duplicación completa del gen	Duplicación completa del gen	c.140T>C (p.I47T) hemicigoto	c.609C>T (p.Q99X) hemicigoto	c.609C>T (p.Q99X) hemicigoto	c.152T>A (p.F51Y) hemicigoto	c.140T>C (p.I47T) hemicigoto

(+): Presente. (-): Ausente. RM: Resonancia Nuclear Magnética cerebral. NA: No aplica. SC: Subcortical. PV: Periventricular. PaV: Paraventricular. SD: Sin Dato. VNC: Velocidades de Neuroconducción. EMG: Electrommiografía. MS: Miembros superiores. MI: Miembros inferiores.

Discusión

Nosotros presentamos la serie mas grande de pacientes Latinoamericanos con diagnóstico clínico y confirmación molecular del espectro de Enfermedad de Pelizaeus Merzbacher, donde la presentación más frecuente se observó en la forma clásica, sin embargo también se lograron identificar dos pacientes con forma connatal.

Fueron claves para el diagnóstico en estos pacientes la presencia de un retardo global del desarrollo asociado a cualquier tipo de nistagmos, ambos signos estuvieron presentes en todos los pacientes. Fue necesario el diagnóstico molecular confirmatorio para el adecuado asesoramiento genético de las familias.

La forma connatal de la PMD es menos frecuente y mucho más severa que la forma clásica. En nuestro estudio fue notable que los pacientes con la forma connatal tienen mayor discapacidad (Puntajes en rangos de alta severidad en el PMD Disability Scoring System) y un más pronunciado retardo en el neuro desarrollo hasta el momento en que fallecen. Cabe mencionar que si bien no alcanzan rangos de alerta en la Escala Abreviada del Desarrollo, es probable que se deba a la temprana edad en que mueren.

En este estudio, en pacientes con diagnóstico de PMD fueron más frecuentes las mutaciones puntuales que las duplicaciones, contrario a lo reportado en literatura, donde el 50% de las alteraciones del gen PLP1 son defectos en la dosis génica (Fig. 2). Las series de casos de la literatura reportaron la aparición de mutaciones puntuales causales en un 30% de los varones con PMD, nosotros encontramos mutaciones puntuales en el 71.5%, probablemente debido al tamaño de la muestra, aunque no se debe descartar un background genético particular en latinoamericanos para esta patología.

Figura 2

Mutaciones encontradas en nuestros pacientes y las previamente reportadas en PLP1. La figura recoge un esquema de la localización a nivel de la proteína de las mutaciones que se detectaron en los casos aquí presentados (Missense, Nonsense) vs. Las mutaciones reportadas previamente en la literatura (Otras reportadas).

El gen PLP1 está localizado en la región cromosómica Xq22, tiene una longitud de 17 kb, contiene 7 exones y 6 intrones. El exón 1 codifica solo para una metionina y los exones 2, 3, 4, y 5 codifican los dominios hidrofóbicos y la secuencia de cadenas hidrofílicas. El dominio C terminal transmembranal es codificado por los exones 6 y 7. Este último contiene una secuencia C terminal hidrofílica y la región 3’ no trascrita ,. El gen PLP1 Codifica para la proteína proteolipídica de mielina tipo 1 llamada también lipofilina (PLP1) de 276 aminoácidos y su isoforma generada por splicing alternativo DM20. Tanto PLP1 como DM20 son proteínas de membrana muy hidrofóbicas. La proteína DM20 pierde 35 residuos dentro de su loop intracelular y tanto PLP/DM20 constituyen más del 50% de las proteínas de la mielina compacta en el sistema nervioso central del adulto . Las funciones de PLP/DM20 no han sido descritas totalmente; sin embargo, es claro que son necesarias para el ensamblaje y estabilidad física de la mielina del sistema nervioso central. No sobra decir que las mutaciones en el gen PLP1 han sido ampliamente relacionadas como causa de PMD y SPG2. Los estudios en pacientes con estas patologías, así como modelos en ratón, han permitido definir qué PLP/DM20 participa en la formación de la línea intra-período de mielina, la compactación de la mielina, la adhesión de las vainas de mielina a la membrana del oligodendrocito y el recubrimiento de mielina del axón. Un amplio tipo de mutaciones ha sido descrito en este grupo de individuos, siendo la forma más frecuentemente reportada la duplicación de gen PLP1 ,,.

La mutación c.140T>C que encontramos en dos de nuestros pacientes con fenotipo connatal fue recientemente reportada por Hoffman y col. pero en PMD clásica . Grossi et al.,. reportaron una mutación similar en un fenotipo clásico, la microduplicación en el exon 2 de PLP (c.134_140dup7) con corrimiento en el marco en lectura (p.Ile47IlefsX4) y repercusión en una proteína truncada en 4 aminoácidos corriente abajo . Será importante en el futuro establecer la funcionalidad bioquímica de la posición Isoleucina 47 con respecto a su impacto en el fenotipo connatal, ya hasta el momento no existen estudios funcionales que permitan comprobar el efecto in vivo de ella.

Las mutaciones nonsense c.609C>T (p.Q99X) y missense y c.152T>A (p.F51Y) no han sido reportadas previamente como causales, pero la predicción por SIFT y PolyPhen de su efecto en la proteína sugiere que sean probablemente deletéreas (Scores de 0.82 y 0.98 en Polyphen respectivamente). Estas mutaciones comprometen dos dominios funcionales de la proteína, en el caso de la c.609C>T (p.Q99X) se ve afectado el dominio citoplasmático y en el caso de la c.152T>A (p.F51Y) un dominio topológico extracelular ,.

En un menor porcentaje de casos se ha reportado que pueden ocurrir triplicaciones, triplicaciones parciales e incluso quintuplicaciones del gen PLP1, y en menos del 2% de los casos se presentan deleciones completas o parciales de este gen ,,.

Conclusiones

En nuestro conocimiento, este es el primer reporte latinoamericano de una serie de pacientes con PMD en el que se encuentra una mayor frecuencia de afectados con PMD clásica con puntajes para discapacidad moderada en quienes se detectaron más mutaciones puntuales que duplicaciones del gen PLP1 como la causa. En los dos pacientes con la forma connatal de la enfermedad que presentamos, a pesar de realizar un diagnóstico más temprano, la discapacidad fue severa y el pronóstico vital fue siempre pobre.

Consideramos que, en esta población, se debería contemplar un algoritmo diagnóstico que, tras la alta sospecha clínica y el soporte con neuroimagen y otros paraclínicos, confirme en simultáneo la alteración molecular de rearreglos tipo delecion / duplicación y la presencia de mutaciones puntuales en el gen PLP1, mediante secuenciación Sanger asociada al análisis de la dosis génica por MLPA o por otra técnica molecular disponible para ese propósito.

A pesar de su carácter discapacitante, los pacientes con formas leves o moderadas de la Enfermedad de Pelizaeus Merzbacher tienen una esperanza de vida larga, con escasos reportes de enfermedad grave que causa el fallecimiento en la segunda década de la vida y la enfermedad en ellos progresa lentamente tras la adolescencia. Es importante mejorar el algoritmo diagnóstico para disminuir los tiempos antes del establecimiento completo de los tratamientos paliativos y para el adecuado asesoramiento genético de las familias, además que, de tratarse de la forma connatal, la muerte del paciente ocurrirá generalmente en la primera década de la vida, por lo que es importante el diagnóstico previo.