[Molecular Understanding of Hearing - How Does This Matter to the Hearing Impaired?]

This review addresses the advances of our molecular understanding of hearing and how this benefits the hearing impaired. Classical biochemical methods usually fall short in contributing to the analysis of the molecular mechanisms of hearing e. g. in the cochlea, the auditory part of the inner ear, due to the scarcity of the cells of interest. Genetics, molecular cell biology, and physiology, on the other hand, have elucidated the intricate molecular and cellular mechanisms that bring about the outstanding performance of the auditory system. Many of those mechanisms are quite unique and specialized to serve the specific needs of hearing. Hence, their defects often spare other organs and lead to specific non-syndromic deafness. High throughput sequencing can reveal causes of sporadic deafness when combined with careful bioinformatics. Molecular approaches are also helpful for understanding more common forms of hearing impairment such as noise-induced hearing impairment. While molecular therapies are not yet clinically available, careful molecular genetic analysis helps to counsel the hearing impaired subjects. Eigentümer und

1. From human genetics to molecular mechanisms and back to the patient

In the past years, major efforts have been undertaken to discover genes with important function in the inner ear. They spanned from the cloning from cDNA libraries that were created from animal tissue at different time points in inner ear development, over the analysis of the transcriptome of single cells, the proteomics of massive collections of animal inner ears, highly sensitive mass spectrometry of immune-purified subcellular compartments, linkage analyses in large, often consanguine families with genetic hearing impairment, up to the identification of pathogenic mutations associated with sporadic hearing impairment by means of high throughput sequencing technologies. The approaches making use of human genetics had and have a particular significance. Numerous genes with key functions in the cochlea were identified as so-called deafness genes ( http://hereditaryhearingloss.org/ ) by means of human genetic analyses, initially mainly by linkage analyses with subsequent Sanger sequencing of candidate genes within the linked region 1 2 , while nowadays application of high throughput sequencing procedures 3 4 (next generation sequencing, NGS) is becoming a standard procedure ( Fig. 1 ). In contrast to the formerly applied Sanger sequencing that was limited to the identification of mutations in few genes (such as for example the GJB2 gene coding for connexin 26), NGS-based panels with numerous deafness genes can be tested for identification of causal mutations and even sequencing of the entire exome (whole exome sequencing, WES; exons are the entirety of the transcribed gene segments) of the hearing impaired subject or trio-WES (patient and parents) can be performed. The decision, which type of molecular diagnostics can be performed and how many deafness genes are sequenced, is mainly determined by the context of the examination (scientific evaluation or routinely performed diagnostics).

Fig. 1

Elucidation of the molecular mechanism in cases of monogenic hearing loss. If hereditary hearing loss is suspected, linkage analysis of the gene loci of the affected gene and gene identification may uncover which gene is affected. This procedure can be shortened by next generation sequencing and bioinformatics. In vitro analysis and generation of animal models for newfound mutations may then identify localization, structure, and function not only of the normal but also the defective protein. This allows further assessment of the disease mechanism and the development of diagnostic and therapeutic approaches that may then be applied for treatment of hearing impaired patients.

In conjunction with audiometric phenotyping and pedigree analysis, NGS-based sequencing then also identifies the pattern of inheritance; e. g. autosomal recessive (gene/disease is marked with DFNB, both parents are carriers of the mutation but healthy), autosomal dominant (DFNA, depending on penetrance one of the parents may be hearing impaired), and X-chromosomal (DFNX, the mother is carrier of the mutation but usually healthy, male descendants are affected). The sequences generated by NGS-based methods (so-called “reads”) require a careful bioinformatic analysis as well as professional interpretation of the detected variants by a human geneticist in order to identify potentially pathogenic mutations. Even if the sequencing is available for well-informed otolaryngologists, the interpretation of the variants from the NGS data requires experience and is performed e. g. in the Institute of Human Genetics of the University Medical Center Göttingen by an entire team of experts. Since July 2016, there are now for the first time items in the German physicians’ fee schedule (Einheitlicher Bewertungsmaßstab, EBM) that allow application of NGS-based routine diagnostics. However, the number of genes to be analyzed is restricted so that large panels with many genes or even exome sequencing require prior declaration to bear costs by the responsible health insurer. Despite those restrictions, the possibility to invoice NGS-based services represents a great success and will facilitate the identification of pathogenic mutations in cases of sporadic sensorineural hearing impairment. Already today, NGS-based analysis is applied in human genetics in university medical departments but also in practices and so it is recommended to establish intensive cooperation in this field.

The gene identification is then followed by generation of molecular probes such as antibodies, in vitro structural, biochemical, and biophysical analyses of the recombinant protein and the creation of genetically modified organisms such as fruit flies, zebrafish, and/or mice for further functional characterization of the gene 5 . For this, different genetic approaches like chemical mutagenesis, homologous recombination, and genome editing are applied. In the last years, numerous mouse mutagenesis programs have been conducted and in some cases the genetically modified embryonic stem cells or even finalized mouse mutants were provided for scientific purposes at reasonable expense (e. g. https://www.komp.org/ ; http://www.mousephenotype.org/ ; https://www.infrafrontier.eu/search ). However, the path from embryonic stem cells to homozygous mouse mutants is challenging and typically even university otolaryngology departments have to rely on cooperation with experienced partners to successfully complete it. If the function of one specific gene is in the focus of interest, it is recommended to start researching which other group(s) are working on this gene even or in particular when those groups do not themselves perform research in the auditory system. Additionally, there are now companies which offer the production of genetically modified animals for research purposes, but the costs are substantial. Finally, the mouse holding capacities are limited in many medical universities and/or the expenses for animal holding are extremely high such that an intensive gene analysis in the mouse model is limited. Similar repositories exist for mutant fruit flies and zebrafish and the costs for keeping them are significantly lower. Based on this and also on other advantages such as the ease of acute expression of a specific gene, the zebrafish may represent an important intermediate stage with the hair cells of its lateral line organ and the inner ear (e. g. 6 ). However, one must bear in mind that the anatomy and physiology of the inner ears of fish and mammals are markedly different so that statements on human hearing impairment based on findings in zebrafish have to be made with great caution.

The morphological and functional characterization of a gene requires the availability of several methods such as immunohistochemistry, light and electron microscopy with different resolutions, systemic and cellular auditory physiology, and behavioral analyses. Some of the applied methods will be discussed in the following chapters. The observed mutant phenotypes allow understanding the role of the gene of interest in hearing 5 7 . The expertise available in otolaryngology departments regarding the morphological and functional analysis of hearing is readily used by research groups working in other disciplines. Among others, the measurements of auditory brainstem responses (ABR) and otoacoustic emissions in rodents 8 as well as immunohistochemistry and confocal microscopy can be realized here and are appropriate work for doctoral theses and research rotations of residents in training. Furthermore, in particular findings regarding systems physiology and behavioral biology in a mouse model for genetic hearing impairment may be very helpful for clinical diagnostics. Findings in research of molecular physiology in mice, for example, have led to a pathophysiological classification of sensorineural hearing loss ( Fig. 2 , 7 9 ). The specificity of the determined phenotypes can be controlled by re-insertion of a healthy copy of the gene, e. g. with the help of viral vectors. Such “rescue experiments” and their methodical implementation in the mouse model may further serve as feasibility trial for the development of possible gene therapeutic approaches 10 11 12 13 14 . Genetic trials that investigate the role of candidate genes in the inner ear because of an expected analogy to other systems have often found interesting deviations in the molecular profile of inner hair cells and helped to consider alternative and unconventional molecular mechanisms (see chapter on synaptic sound coding). In addition, those studies were helpful for the establishment of new methods for examination of the inner ear. Finally, molecular and cell physiological understanding of hearing is an important precondition for novel approaches to hair cell regeneration 15 and other innovative therapy approaches like the optical cochlear implant 16 . Based on this, a clinical trial on transdifferentiation of supporting cells into hair cells is at the moment conducted in the USA 17 in which virus-mediated expression of the transcription factor Atoh1 shall be induced in these cells 18 . With regard to strategies for cell replacement therapy making use of exogenous cells obtained from stem cells, further progress has been made, for example in attempts to regenerate spiral ganglion neurons 19 . The possibility to generate inner ear organoids 20 21 22 promises a clearly improved availability of sensory cells and neurons for pharmacological and genetic analyses and progress in future cell replacement therapy. However, its development and potential clinical translation will likely need more than another decade. Up to then, hearing aids and cochlear implants will remain the most important options for hearing rehabilitation and their further improvement is a relevant focus of research and development. One future-oriented example for those activities is the field of optic stimulation of the cochlea where research in Germany is currently in a leading position. On one hand, the Medical University of Hannover and the Saarland University Medical Center initiated the development of a new generation of hearing aids that use the possibility of optomechanically stimulating the cochlea 23 24 . On the other hand, the University Medical Center Göttingen in cooperation with the University of Freiburg and the Technical University of Chemnitz works on the development of an optical cochlear implant for optogenetic stimulation of virus-transduced spiral ganglion neurons 25 26 . Since light can be confined in space better than electric stimuli, the optical cochlear implant promises a finer frequency resolution of coding and thus an improved speech understanding in noise.

Fig. 2

Pathomechanisms of sensorineural hearing loss. Damage of the outer hair cells leads to a reduction or the complete loss of non-linear cochlear amplification. This impairs the sensitivity and frequency discrimination of hearing. Impaired sound coding and signal propagation by inner hair cells and spiral ganglion neurons lead to auditory synaptopathy or neuropathy, where in particular the temporal processing of registered sound stimuli is impaired. In cases of global cochlear disorders such as e. g. disturbed endolymphatic secretion or defective mechanoelectrical transduction, the amplifying mechanisms as well as sound coding are impaired. (OHC: outer hair cells, IHC: inner hair cells). Taken from 9 .

2. The potassium cycle, transduction, and division of labor in the cochlea

The so-called “potassium cycle” of the inner ear is a “hotspot” of genetic hearing impairment, including the connexin 26 gap junction channels that are defective in the frequently observed autosomal recessive hearing loss DFNB1A. The physiological significance is with the use of potassium ions for mechanoelectrical transduction by hair cells, which is a “genius invention” of evolution allowing depolarization (receptor potential generation) of the hair cells without them consuming metabolic energy for the restoration of the sodium and potassium homeostasis. In contrast to neurons that are depolarized by influx of sodium which afterwards has to be pumped out into the extracellular space against the ion gradient in exchange with potassium, the hair cell “simply” opens voltage-gated potassium channels of the basolateral membrane and passively releases potassium into the perilymph. One of the involved potassium channels is K V 7.4 (or KCNQ4), which is defective in autosomal dominant hearing loss DFNA2 27 28 . Influx of potassium from the endolymph into the hair cell during mechanoelectrical transduction requires an appropriate electrochemical gradient (driving force) that is permanently generated by the stria vascularis by providing a high potassium concentration (about 150 mM) and a positive potential (80–120 mV, endolymphatic potential) in the endolymph.

This way, mechanoelectrical transduction of the hair cell can pursue despite poor oxygen supply due to the minimal blood perfusion in the organ of Corti, allowing maximal acoustic sensitivity, as the metabolic burden is mainly picked up by the stria vascularis: division of labor. The hair cell uses highly specialized mechanosensitive ion channels for mechanoelectrical transduction that are opened by a fine “thread” (“tip-link”, Fig. 3a ) during deflection of the stereocilia. Currently so-called transmembrane like channels (TMC 1 and 2) are considered as promising candidates for the hair cell transduction channel ( Fig. 3b 29 30 31 ). TMC 1 is affected in the human hearing impairment types DFNB7/11 and DFNA36 and recently the general feasibility of gene therapy could be shown in corresponding mouse models by means of viral gene transfer 12 .

Fig. 3

The cochlear potassium cycle. a Tip-links between the stereocilia of hair cells are generated and anchored by a complex molecular mechanism. The proteins involved are entirely coded by sequences identified as deafness genes. b TMC1 is a candidate for the potassium-permeable mechanotransduction channel of the stereocilia which is opened by tension within the tip-links. Immunofluorescence labeling of TMC1 (red) localizes it at the tips of the stereocilia, which are immunolabeled against actin (green). The figures show the stereocilia of inner hair cells (top left) and vestibular hair cells (top and bottom right) of the mouse cochlea. Scale bar: 2 µm. Modified from 31 . c The potassium cycle in the cochlea enables the activity of the hair cells. The high potassium concentration in the scala media allows passive influx into the hair cells from which potassium in turn flows out via potassium channels, among others KCNQ4. There, it is taken up by supporting cells and forwarded to the stria vascularis where it is taken up into the marginal cells via NKCC1 (bottom right). From there, it is then released back into the scala media by KCNQ1 channels. This process, too, involves numerous deafness genes (underlined). For comparison: similar functioning of the potassium recycling of the kidneys (bottom left). Modified from 50 .

The tip-links are built from the extracellular matrix proteins cadherin 23 and protocadherin 15 32 and anchored in the membrane of the stereocilia by means of refined protein complexes 5 ( Fig. 3a ).

Mutations of some genes coding for the proteins of the tip-links and the anchoring proteins lead to Usher syndrome (sensorineural hearing loss, retinitis pigmentosa, depending on severity in combination with a loss of vestibular function) 5 because these proteins are also relevant for the function of photoreceptors of the eye.

After potassium has served mechanoelectrical transduction of the hair cells and has been released into the perilymph, it is thought to return into the stria vascularis via several pathways (potassium cycle, Fig. 3c ). It is assumed that supporting cells in the organ of Corti, similar to the brain’s glial cells, take up potassium via ion pumps such as KCC4. The potassium then diffuses through the network of the “coupled” supporting cells, probably via gap junction channels generated from connexin 26 and 30 (both coding genes are deafness genes). It reaches the fibrocytes of the cochlea’s lateral wall that are also coupled by gap junctions until it is finally “re-used” by the stria vascularis. The stria vascularis, a kidney-like epithelium in the lateral wall of the cochlea with very efficient blood circulation (“vascularis”) is equipped with a sophisticated system of ion channels and ion pumps ( Fig. 3c ). For some of the genes coding for these proteins, pathogenic mutations are known that lead to deafness and sometimes also to renal or cardiac diseases (syndromic hearing loss). Defects of the potassium cycle or of transduction lead to a global cochlear dysfunction ( Fig. 2 ) because the driving force for outer as well as inner hair cells and their output function is missing (see below). Finally, this often results in a degeneration of the sensory elements of the cochlea.

3. Cochlear amplification and synaptic sound coding

The receptor potential resulting from mechanoelectrical transduction primarily leads to electromotility in outer hair cells and glutamate release in the inner hair cells at their synapses with type 1 spiral ganglion neurons. The electromotility of outer hair cells (voltage-controlled changes of the cellular length) is mediated by the so-called “motor protein” prestin (named after the musical notation “presto”) and probably forms the mechanism that is responsible for the cochlear amplifier 33 34 . Prestin is a protein that changes its conformation with the membrane potential and may be described in a simplified way as a type of piezo crystal. Similar to the voltage in quartz watches, the receptor potential leads to an expansion of prestin in the lateral hair cell membrane. Since a high number of prestin molecules do the same “in series”, a microscopically visible change of the length of the hair cell can be observed and the hair cell introduces the mechanical energy into the oscillation of the organ of Corti. Selective dysfunction by mutations in the prestin gene 35 or loss of the electromotility or the outer hair cells themselves 27 28 lead to a type of hearing loss that can be called a physiological “amplifier defect” ( Fig. 2 ). Beside the loss of otoacoustic emissions due to the lacking electromotility of the outer hair cells, a hearing loss of maximally 50–60 dB 36 can be expected along with deteriorated frequency discrimination 37 .

Within the sensory inner hair cells, the depolarizing receptor potential opens voltage-gated Ca V 1.3 Ca 2+ channels at the active zones of transmitter release. The incoming Ca 2+ ions serve as signal that couples the mechanoelectrical transduction to the release of the transmitter glutamate, which leads to stimulation of the postsynaptic auditory neuron and finally to the generation of an action potential that “informs” the brain about the acoustic stimulus. The active zones of the inner hair cells are highly specialized in order to meet the high functional requirements of sound coding with regard to rate, temporal precision and duration of synaptic transmission ( Fig. 4 ). This specialization is readily illustrated by the presence of the synaptic ribbon generated from the protein ribeye and the molecular machinery that is different from the “typical” glutamatergic synapse of the CNS. The individual proteins, however, are less in the focus of this review (overviews can be found in 38 39 40 ), which will rather concentrate on the extent of deviation from the “conventional construction design” and the fact that several genes coding for proteins of the hair cell synapse are defective in the context of hereditary hearing loss 7 41 . Beside the Cav1.3 Ca 2+ channel and its regulator CaBP2, the protein otoferlin is to be mentioned which plays a role as “master protein” of the afferent hair cell synapse 7 38 . Genetic defects of genes coding for proteins of the hair cell synapse lead to a type of hearing loss that is called auditory synaptopathy ( Fig. 2 ). For example, defects of the otoferlin gene lead to auditory synaptopathy (DFNB9 and temperature-sensitive hearing loss) where the cochlear function may be intact upstream of the hair cell synapse (at least initially) but the temporally precise sound coding is limited or even impossible 7 42 . Accordingly, otoacoustic emissions and/or microphone/summation potential (electrocochleography) are found but no – or a pathological – compound action potential or ABR. Subjectively the sound threshold may be preserved, however speech understanding especially in noise is very poor 7 42 . Also in the field of genetic auditory synaptopathy, first studies revealed a restoration of the hearing function by viral gene transfer in an animal model 10 43 . However, many questions remain to be addressed before this approach may be clinically implemented. Still, already now it can be safely stated that in patients with auditory synaptopathy (e. g. DFNB9 7 ) the results of hearing rehabilitation with cochlear implants are very promising while hearing aids only provide insufficient benefit. In contrast, the results regarding different types of auditory neuropathy are less clear 44 . The efforts on the correlation of molecular genetic findings and the outcome of cochlear implantation that are already underway (e. g. 45 ) promise improved possibilities for otolaryngologists regarding counseling of hearing impaired patients that might be candidates for cochlear implantation.

Fig. 4

Comparison of synaptic proteins found in “conventional” glutamatergic synapses of the central neural system and ribbon synapses of the cochlea. Numerous proteins found in conventional synapses (left) are not present in the hair cells’ ribbon synapses (right) where special proteins are found, of which many are encoded by deafness genes (marked in red). Modified from 38 .

Understanding auditory synaptopathy or loss of synapses, however, is of general significance for clinical otolaryngology. Animal experiments and investigations of the human temporal bone lead to the expectation that the damage and the loss of hair cell synapses is causal for frequent types of hearing impairment such as noise-induced hearing loss, age-related hearing loss (complex genetic diseases: genetic predisposition and exogenous influences) and hearing loss after application of ototoxic medications as well as Menière’s disease 7 46 47 . The classic experiment conducted by Kujawa and Liberman 48 on temporary threshold shift in the mouse indicates that noise trauma, even in cases of complete remission of the otoacoustic emissions and the hearing threshold, may lead to an irreversible loss of up to half of all hair cell synapses: “hidden hearing loss”. Immunohistochemistry could confirm this for the synaptic ribbon and ABR measurements show a linear relation between the amplitude of the spiral ganglion compound action potential and the number of hair cell synapses. Meanwhile comparable findings were assessed also in other species and electrocochleography in adolescents with a history of increased noise exposure revealed a relative reduction of the compound action potential 46 . Further clinical studies as well as analyses of human temporal bones will have to verify the transferability of those animal experimental findings.

4. Summary

Progress in the fields of genetics and molecular physiology of hearing allows for a better understanding of molecular mechanisms of hearing and sensorineural hearing loss. In order to turn this progress into clinical use, updates on current research, on differential audiometric diagnostics, and the cooperation with NGS-experienced human geneticists are required. First, the focus must be on improved diagnostics, especially in cases of suspected genetic hearing impairment. This helps to counsel patients and their families adequately and allows the informed choice of the most appropriate means of hearing rehabilitation, e. g. hearing aid versus cochlear implant in cases of auditory synaptopathy. Similar aspects also apply for differential diagnostics of frequent types of sensorineural hearing loss such as noise-induced deafness. The translation of innovative pharmacological or gene-therapeutic procedures for sensorineural hearing loss will need several years of intensive research, but major progress is expected in this field. Therefore, it is recommended to “stay tuned” for future developments.

1. Von der Humangenetik zum molekularen Mechanismus und zurück zum Patienten

In den vergangenen Jahren sind zahlreiche Wege zur Aufdeckung von Genen mit wichtiger Funktion im Innenohr beschritten worden. Von der Klonierung aus cDNA-Bibliotheken, die aus tierischem Gewebe zu verschiedenen Zeitpunkten der Innenohr-Entwicklung erzeugt wurden, zur Analyse des Transkriptoms einzelner Zellen, von Proteomics von massiven Kollektionen tierischer Innenohren zu sensitivster Massenspektrometrie immunaufgereinigter subzellulärer Kompartimente, von Kopplungsanalysen in großen oft konsanguinen Familien mit genetischer Schwerhörigkeit bis zur Identifizierung pathogener Mutationen bei sporadischer Schwerhörigkeit mittels neuer Hochdurchsatz-Sequenziertechnologien. Die humangenetischen Ansätze hatten und haben dabei einen besonderen Stellenwert. Zahlreiche Gene mit Schlüsselfunktionen in der Cochlea wurden durch humangenetische Analysen als sog. „Taubheitsgene“ identifiziert ( http://hereditaryhearingloss.org/ ), wobei initial v. a. Kopplungsanalysen mit nachfolgender Sanger-Sequenzierung von Kandidatengenen in der gekoppelten Region 1 2 und nun zunehmend Hochdurchsatz-Sequenzierungsverfahren 3 4 ( Next Generation Sequencing [NGS]) verwendet werden ( Abb. 1 ). Anders als bei der früher üblichen auf Mutationen weniger Gene beschränkten Sanger-Sequenzierung (wie z. B. für das GJB2 Gen, das für Connexin 26 kodiert) können hier für die Identifizierung von ursächlichen Mutationen entweder NGS-basierte Panels mit zahlreichen Taubheitsgenen getestet oder gar eine Sequenzierung des gesamten Exoms (Whole Exom Sequencing [WES], alle zur Transkription genutzten Genabschnitte [Exone]) des Schwerhörigen bzw. ein Trio-WES (Patient und Eltern) durchgeführt werden. Die Entscheidung, welche Art der molekularen Diagnostik durchgeführt werden kann und wie viele Taubheitsgene sequenziert werden, wird durch den Kontext der Untersuchung (im Rahmen wissenschaftlicher Untersuchungen oder in der Routinediagnostik) maßgeblich bestimmt.

Abb. 1

Aufklärung des molekularen Mechanismus bei der monogenen Schwerhörigkeit. Bei Anhalt für eine erblich bedingte Schwerhörigkeit kann durch Kopplungsanalyse der Genort des betroffenen Genes, durch Genidentifizierung das betroffene Gen selbst aufgedeckt werden. Dieser Vorgang kann durch Next Generation Sequencing und bioinformatische Methoden wesentlich verkürzt werden. Durch in vitro Analysen und Generierung von Tiermodellen für die entdeckte Mutation können dann Lokalisation, Struktur und Funktion nicht nur des normalen sondern auch des defekten Proteins aufgeklärt werden. Dies erlaubt eine weitere Untersuchung des Krankheitsmechanismus und die Entwicklung von Ansätzen für Diagnostik und Therapie, welche dann zu einer Behandlung der Schwerhörigkeit im Patienten genutzt werden können.

Zusammen mit dem audiometrischen Phänotyp identifiziert die NGS-basierte Sequenzierung dann auch den Erbgang: z. B. autosomal rezessive (Gen/Erkrankung dann mit DFNB gekennzeichnet, beide Eltern sind Merkmalsträger aber gesund), autosomal dominant (DFNA, je nach Penetranz ist auch eines der Eltern schwerhörig), und X-chromosomal (DFNX, Mütter sind Merkmalsträger, aber meistens gesund, männliche Nachkommen sind betroffen). Die durch NGS-basierte Methoden generierten Sequenzen (sog. „Sequenzierschnipsel“ oder „Reads“) benötigen eine sorgfältige bioinformatische Analyse sowie eine fachgerechte Bewertung gefundener Varianten durch den Humangenetiker, um die potentiell pathogenen Mutationen zu identifizieren. Auch wenn die Sequenzierung nun dem informierten HNO-Arzt zugänglich ist, erfordert die Bewertung von Varianten aus NGS-Daten viel Erfahrung und wird daher z. B. im Institut für Humangenetik der UMG in Göttingen durch ein ganzes Expertenteam durchgeführt. Seit Juli 2016 gibt es nun erstmalig EBM-Ziffern, die eine Anwendung NGS-basierter Routinediagnostik erlauben, allerdings gibt es Einschränkungen bei der Anzahl zu analysierenden Gene, sodass bei großen Panels mit vielen Genen oder gar Exomsequenzierungen vorab ein Antrag auf Kostenübernahme bei der entsprechenden Krankenkasse gestellt werden muss. Trotz dieser Einschränkungen stellt die Abrechenbarkeit NGS-basierter Leistungen einen großen Fortschritt dar und wird die Identifizierung pathogener Mutationen bei sporadischer sensorineuraler Schwerhörigkeit erleichtern. Bereits jetzt wird NGS-basierte Analyse umfangreich in der hochschulmedizinischen aber auch in der niedergelassenen Humangenetik genutzt und so empfiehlt es sich hier eine entsprechende Zusammenarbeit aufzubauen.

An die Gen-Identifizierung schließen sich dann die Generierung von molekularen Sonden wie Antikörpern, in vitro struktur- und zellbiologische Analysen des rekombinanten Proteins und die Erstellung von genetisch veränderten Organismen in Fruchtfliege, Zebrafisch und/oder Maus für die weitere funktionelle Charakterisierung des Gens an 5 . Dabei werden verschiedene genetische Ansätze wie chemische Mutagenese, homologe Rekombination und Genom-Editierung eingesetzt. In den letzten Jahren wurden zahlreiche Mausmutagenese-Programme durchgeführt und in einigen Fällen wurden die genetisch veränderten embryonalen Stammzellen oder auch fertiggestellte Mausmutanten der Wissenschaft zu überschaubaren Kosten zur Verfügung gestellt (z. B. https://www.komp.org/ , http://www.mousephenotype.org/ , https://www.infrafrontier.eu/search ). Allerdings ist der Weg von den embryonalen Stammzellen zur homozygoten Mausmutante anspruchsvoll und auch von universitären HNO-Kliniken typischerweise nur in Zusammenarbeit mit einschlägig vorerfahrenen Kooperationspartnern zu leisten. Bei Interesse an der Funktion eines spezifischen Gens empfiehlt sich eine Recherche der an diesem Gen arbeitenden Gruppen, auch oder gerade wenn diese nicht selbst am Ohr forschen. Zudem bieten Firmen inzwischen die Erstellung solcher genetisch veränderter Tiere für Forschungszwecke an, doch die Kosten dort sind erheblich. Schließlich sind die Tierhaltungskapazitäten an zahlreichen Universitätsmedizin-Standorten begrenzt und/oder die Haltungskosten sehr hoch, sodass eine umfassende Analyse von Genen im Mausmodell dadurch limitiert wird. Ähnliche Repositorien existieren auch für mutante Fruchtfliegen und Zebrafische, deren Haltungskosten deutlich niedriger sind. Daher, aber auch durch einige Vorteile von Zebrafisch etwa bei der akuten Expression eines speziellen Gens, kann der Zebrafisch mit den Haarzellen seines Seitenlinienorgans und des Innenohrs einen wichtigen Zwischenschritt bilden (z. B. 6 ). Man muss aber im Blick behalten, dass sich die Anatomie und Physiologie der Innenohren von Fischen und Säugetieren doch erheblich unterscheiden, sodass Aussagen zur humanen Schwerhörigkeit auf der Basis von Befunden am Zebrafisch mit großer Vorsicht getroffen werden sollten.

Die morphologische und funktionelle Charakterisierung benötigt die Verfügbarkeit zahlreicher Methoden wie Immunhistochemie, Licht- und Elektronenmikroskopie mit verschiedenem Auflösungsvermögen, systemische und zelluläre Hörphysiologie und Verhaltensanalysen. Einige der dabei verwendeten Methoden werden in den folgenden Kapiteln angesprochen. Die beobachteten Phänotypen geben Einsichten in die Rolle des Ziel-Gens beim Hören 5 7 . Die an HNO-Kliniken vorhandene Expertise bei der morphologischen und funktionellen Analyse des Hörens wird sehr gern von Arbeitsgruppen aus anderen Feldern in Anspruch genommen. Dabei sind etwa Ableitungen von BERA und otoakustischen Emissionen an Nagern 8 ebenso wie die Immunhistochemie und Konfokalmikroskopie realisierbar und gleichzeitig geeignet für Doktorarbeiten und Forschungsrotationen von Weiterbildungsassistenten. Darüber hinaus können insbesondere systemphysiologische und verhaltensbiologische Befunde im Mausmodell einer genetischen Schwerhörigkeit sehr informativ für die klinische Diagnostik sein. So hat die Molekularphysiologie an der Maus zu einer pathophysiologischen Klassifikation der sensorineuralen Schwerhörigkeit geführt ( Abb. 2 , 7 9 ). Die Spezifität der beobachteten Phänotypen kann durch das Wiedereinbringen des gesunden Gens, z. B. mit viralen Vektoren, kontrolliert werden. Dabei können solche „Rettungsexperimente“ und ihre methodische Umsetzung im Mausmodell gleichzeitig als Machbarkeitsstudien für die Entwicklung möglicher gentherapeutischer Ansätze dienen 10 11 12 13 14 . Genetische Ansätze, die aufgrund angenommener Analogien zu anderen Systemen die Rolle von Kandidaten-Genen im Innenohr untersuchten, haben häufig interessante Abweichungen im molekularen Profil von Innenohrzellen gefunden und geholfen, alternative und unkonventionelle molekulare Mechanismen zu berücksichtigen (siehe etwa das Kapitel zur synaptischen Schallkodierung). Darüber hinaus waren diese Studien hilfreich bei der Etablierung von Methoden zur Untersuchung des Innenohrs. Schließlich sind die molekular- und zellbiologischen Einsichten eine wichtige Voraussetzung für Ansätze zur Haarzellregeneration 15 und anderen innovativen Therapieansätzen wie dem optischen Cochlea Implantat 16 . Auf dieser Grundlage wird in den USA aktuell bereits ein klinischer Versuch zur Transdifferenzierung von Stützzellen in Haarzellen durchgeführt 17 , die durch viral-vermittelte Expression des Transkriptionsfaktors Atoh1 in diesen Zellen induziert werden soll 18 . Auch bei Strategien für die Zellersatztherapie mit aus Stammzellen gewonnenen exogenen Zellen gibt es weitere zellbiologische und tierexperimentelle Fortschritte wie etwa beim Ersatz von Spiralganglionneuronen (z. B. 19 ). Die Möglichkeit Organoide des Innenohrs zu generieren 20 21 22 , verspricht eine deutlich verbesserte Verfügbarkeit von Haarzellen und Nervenzellen für pharmakologische oder genetische Untersuchungen und Fortschritte für eine zukünftige Zellersatztherapie, für deren Entwicklung und potentielle klinische Translation aber sicher noch mehr als eine Dekade benötigt wird. Bis dahin bleiben Hörgeräte und Cochlea Implantate die wichtigsten Optionen der Hörrehabilitation und ihre weitere Verbesserung eine wichtige Aufgabe für Forschung und Entwicklung. Als ein zukunftsweisendes Beispiel dieser Aktivitäten soll hier die optische Stimulation der Cochlea genannt werden, in denen die deutsche Hochschulmedizin aktuell führend ist. Zum einen wird an der Medizinischen Hochschule Hannover und der Universitätsmedizin in Homburg/Saar durch die Möglichkeit mit Licht eine mechanische Reizung der Cochlea herbeizuführen die Entwicklung einer neuen Generation von Hörgeräten initiiert 23 24 . Zum anderen wird an der Universitätsmedizin Göttingen in Zusammenarbeit mit Technologen der Universität Freiburg und der Technischen Universität Chemnitz ein optisches Cochlea Implantat zur optogenetischen Reizung von viral-transduzierten Spiralganglionneuronen entwickelt 25 26 . Weil Licht besser gebündelt werden kann als Strom hat das optische Cochlea Implantat eine feinere Frequenzauflösung und verspricht so u. a. ein verbessertes Sprachverstehen im Störgeräusch.

Abb. 2

Pathomechanismen der sensorineuralen Schwerhörigkeit. Schädigungen der äußeren Haarzellen bedingen eine Reduktion oder den Verlust der nichtlinearen cochleären Verstärkung. Dies beeinträchtigt die Sensitivität und Frequenzdiskrimination. Eine gestörte Schallkodierung und Reizweiterleitung durch die innere Haarzelle und Spiralganglionneurone führen zum Krankheitsbild der auditorischen Synaptopathie bzw. Neuropathie, bei dem v. a. die zeitliche Verarbeitung der aufgenommenen Schallreize gestört ist. Bei globalen cochleären Störungen wie z. B. gestörter Endolymphsekretion oder defekter mechanoelektrischer Transduktion sind sowohl die Verstärkermechanismen als auch die Schallkodierung beeinträchtigt (ÄHZ äußere Haarzellen, IHZ innere Haarzelle). Aus 9 .

2. Der Kaliumkreislauf, die Transduktion und die Arbeitsteilung in der Cochlea

Der sog. „Kaliumkreislauf“ des Innenohrs ist ein „Hotspot“ der genetischen Schwerhörigkeit, zu dem auch die Connexin 26 Gap Junction Kanäle gehören, die bei der häufigen autosomal rezessiven Schwerhörigkeit DFNB1A defekt sind. Die physiologische Signifikanz liegt bei der Verwendung von Kalium-Ionen für die mechanoelektrische Transduktion der Haarzellen. Dies ist ein kleiner evolutionärer Geniestreich, der den Haarzellen die elektrische Erregung (Rezeptorpotenzial) erlaubt, ohne dass metabolische Energie für die Wiederherstellung der Natrium- und Kalium-Homöostase aufgewandt werden muss. Anders als im Neuron, wo Natrium das erregende Ion darstellt und zum Wiederausgleich des Potenzials entgegen dem Ionen-Gradienten im Austausch gegen Kalium wieder in den Extrazellulär-Raum gepumpt werden muss, öffnet die Haarzelle „einfach“ spannungsgesteuerte Kalium-Kanäle der basolateralen Membran und setzt passiv Kalium in die Perilymphe frei. Einer der dabei beteiligten Kalium-Kanäle ist K V 7.4 (oder KCNQ4), welcher bei der autosomal dominanten Schwerhörigkeit DFNA2 defekt ist 27 28 . Damit jedoch bei der mechanoelektrischen Transduktion Kalium aus der Endolymphe in die Haarzelle einströmen kann, benötigt es dort einen entsprechenden elektrochemischen Gradienten (treibende Kraft: hohe Kalium-Konzentration [ca. 150 mM] und positives endolymphatisches Potenzial [80–120 mV]), der stetig von der Stria vascularis erzeugt wird.

Auf diese Weise wird die mechanoelektrische Transduktion der Haarzelle, deren Sauerstoff-Versorgung bedingt durch die für maximale akustische Sensitivität minimierte Blutperfusion im Corti Organ schlecht ist, von metabolischer Last befreit, die vorwiegend von der Stria vascularis getragen wird („Arbeitsteilung“). Die Haarzelle nutzt für die mechanoelektrische Transduktion hochspezialisierte mechanosensitive Ionenkanäle, die bei Auslenkung der Stereocilia von einem feinen „Faden“ („tip-link“, Abb. 3a ) geöffnet werden. Aktuell gelten sog. Transmembrane like Channels (TMCs 1 und 2) als aussichtsreiche Kandidaten für den Haarzell-Transduktionskanal ( Abb. 3b , 29 30 31 ). Diese Gene sind bei den humanen Schwerhörigkeiten DFNB7/11 und DFNA36 betroffen und kürzlich konnte in entsprechenden Mausmodellen mittels viralem Gen-Transfer die prinzipielle Machbarkeit einer Gen-Therapie gezeigt werden 12 . Die tip-links werden aus den extrazellulären Matrix-Proteinen Cadherin 23 und Protocadherin 15 gebildet 32 und durch raffinierte Proteinkomplexe in der Membran der Stereocilia verankert 5 ( Abb. 3a ).

Abb. 3

KaliumKreislauf in der Cochlea. a „Tip links“ in den Stereocilia der Haarzellen werden durch einen komplexen molekularen Apparat gebildet und verankert. Die daran beteiligten Proteine werden sämtlich von als Taubheitsgene identifizierten Sequenzen kodiert. b TMC1 ist ein Kandidat für den Kalium-durchlässigen Mechanotransduktionskanal der Stereocilia, welcher durch Zug an den „tip links“ geöffnet wird. Immunfluoreszenzfärbungen gegen markiertes TMC1-Protein (rot) lokalisieren es an den Spitzen der Stereocilia, welche durch Actin (grün) markiert werden. Die Bilder zeigen die Stereocilia von inneren Haarzellen (oben links), äußeren Haarzellen (unten links) und vestibulären Haarzellen (oben und unten rechts) der Maus-Cochlea. Maßstabsbalken: 2 µm. Modifiziert aus 31 . c Der Kaliumkreislauf in der Cochlea ermöglicht die Aktivität der Haarzellen. Die hohe Kalium-Konzentration in der Scala media führt zu Einstrom in die Haarzellen, aus welchen das Kalium u. a. über KCNQ4-Kanäle ausströmt. Dort wird es von „Stützzellen“ aufgenommen und über Gap Junction Kanäle weiter bis zur Stria vascularis geleitet, wo es über NKCC1 in die marginalen Zellen (unten rechts) aufgenommen wird. Von dort wird es über KCNQ1-Kanäle wieder in die Scala media ausgeschüttet. Auch an diesem Prozess sind zahlreiche Taubheitsgene (unterstrichen) beteiligt. Unten links zum Vergleich die ähnliche Funktionsweise der Kalium-Wiederverwertung in der Niere. Modifiziert aus 50 .

Mutationen einiger Gene für die Proteine der tip-links und die Verankerungsproteine führen zum Usher-Syndrom (sensorineurale Schwerhörigkeit, Retinitis pigmentosa je nach Typ mit vestibulärem Funktionsverlust) 5 , da sie auch für die Funktion von Photorezeptoren des Auge wichtig sind. Nachdem Kalium der mechanoelektrischen Transduktion der Haarzellen gedient hat und von ihnen in die Perilymphe freigesetzt wurde, gelangt es vermutlich über mehrere Wege zurück in die Stria vascularis („Kaliumkreislauf“, Abb. 3c ). Man glaubt, dass „Stützzellen“ im Corti Organ, vergleichbar mit den Glia-Zellen des Gehirns, Kalium über Ionenpumpen wie KCC4 aufnehmen. Das Kalium diffundiert dann vermutlich über aus Connexin 26 und 30 (beide kodierenden Gene sind Taubheitsgene) gebildete Gap-Junction Kanäle durch das Netzwerk der „gekoppelten“ Stützzellen und in die ebenfalls durch Gap Junctions gekoppelten Fibrozyten der lateralen Wand der Cochlea, bis es schließlich vom Epithel der Stria vascularis „wiederverwendet wird“. Die Stria vascularis, ein „nieren-ähnliches“ Epithel in der lateralen Wand der Cochlea mit sehr effizienter Durchblutung („vascularis“), ist mit einem raffinierten System von Ionenkanälen und Ionenpumpen ausgestattet ( Abb. 3c ). Für einige der kodierenden Gene sind pathogene Mutationen bekannt, die zu Schwerhörigkeit und gelegentlich auch zu Nieren- oder Herzerkrankungen führen (syndromale Schwerhörigkeit). Defekte des Kaliumkreislaufs bzw. der Transduktion führen zu einer globalen cochleären Dysfunktion ( Abb. 2 ), da die treibende Kraft sowohl für äußere als auch für innere Haarzellen und deren Output-Funktion fehlt (siehe unten). Schließlich resultiert oft eine Degeneration der sensorischen Elemente der Cochlea.

3. Die cochleäre Verstärkung und die synaptische Schallkodierung

Die mechanoelektrische Transduktion führt zum Rezeptorpotenzial, das in den äußeren Haarzellen primär zur sog. „Elektromotilität“ und in den inneren Haarzellen zur Freisetzung des Botenstoffs Glutamat an den Synapsen mit den Typ-1 Hörnervenzellen führt. Die Elektromotilität der äußeren Haarzellen (spannungsgesteuerte Veränderungen der Zelllänge) wird durch das sog. ,,Motorprotein“ Prestin (von Presto, schnell) vermittelt und bildet wahrscheinlich den Mechanismus der dem cochleären Verstärker zugrunde liegt 33 34 . Prestin ist ein Protein, das bei Spannungsänderung seine Konformation ändert und kann vereinfacht als eine Art Piezo-Kristall dargestellt werden. Wie die Spannung in unseren Quartz-Uhren führt das Rezeptorpotenzial zu einer Änderung der Ausdehnung von Prestin in der seitlichen Haarzellmembran. Da sehr viele Prestin Moleküle quasi „in Serie“ dasselbe tun kommt es zu einer mikroskopisch sichtbaren Längenänderung der Haarzelle, die mechanische Energie in die Schwingung des Corti-Organs einführt. Selektive Dysfunktion durch Mutationen im Prestin-Gen 35 oder Verlust der Elektromotilität bzw. der äußeren Haarzellen 27 28 führt zu einer Schwerhörigkeit die man physiologisch als „Verstärkerdefekt“ bezeichnen kann ( Abb. 2 ). Neben dem Verlust der durch die Elektromotilität der äußeren Haarzellen bedingten otoakustischen Emissionen erwartet man hier einen Hörverlust von maximal 50–60 dB 36 und eine verschlechterte Frequenzdiskrimination 37 .

In den inneren Haarzellen öffnet das depolarisierende Rezeptorpotenzial spannungsgesteuerte Ca V 1.3 Ca 2+ -Kanäle an den aktiven Zonen der Transmitterfreisetzung. Das einströmende Ca 2+ dient als Signal, das die mechanoelektrische Transduktion an die Freisetzung des Transmitters Glutamat koppelt, welcher in der postsynaptischen Hörnervenzelle zur Erregung und schließlich zur Generierung eines Aktionspotenzials führt, das das Gehirn über den akustischen Reiz „informiert“. Die aktiven Zonen der inneren Haarzellen sind sehr spezialisiert um den hohen funktionellen Anforderungen der Schallkodierung an die Rate, zeitliche Präzision und Dauer der synaptischen Transmission zu genügen ( Abb. 4 ). Die Spezialisierung wird eindrücklich durch die Anwesenheit des aus dem Protein Ribeye gebildeten synaptischen Bands und die auch ansonsten von der „typischen“ glutamatergen Synapse des ZNS abweichende molekulare Maschinerie verdeutlicht. Für das Ziel dieses Übersichtsartikels sind dabei weniger die einzelnen Proteine (Übersichten in 38 39 40 ) wichtig, sondern mehr das Ausmaß der Abweichung vom „konventionellen Bauplan“ und der Fakt, dass mehrere der für die Haarzellsynapse kodierende Gene bei erblicher Schwerhörigkeit betroffen sind 7 41 . Neben dem Ca V 1.3 Ca 2+ -Kanal und seinem Regulator CaBP2 ist hier v. a. das Protein Otoferlin zu nennen, das offenbar eine Rolle als „Master-Protein“ der Haarzellsynapse trägt 7 38 . Genetische Defekte der für die Haarzellsynapse kodierenden Gene führen zu einer Schwerhörigkeit die als auditorische Synaptopathie/Neuropathie bezeichnet wird ( Abb. 2 ). So führen Defekte im Otoferlin Gen zu auditorischen Synaptopathien (DFNB9 und temperaturempfindliche Schwerhörigkeit), bei denen die cochleäre Funktion upstream der Haarzellsynapse (zumindest initial) intakt sein kann, aber die zeitlich präzise Schallkodierung eingeschränkt oder unmöglich ist 7 42 . Dementsprechend findet man otoakustische Emissionen und/oder Mikrophon/Summationspotenziale (Elektrocochleografie), aber kein – oder ein pathologisches – Summenaktionspotenzial bzw. BERA. Subjektiv kann die Tonschwelle recht gut erhalten sein, das Sprachverstehen ist v. a. im Störschall jedoch sehr schlecht 7 42 . Auch im Bereich der synaptischen Gendefekte haben bereits erste Studien eine Wiederherstellung der Hörfunktion durch viralen Gen-Transfer im Tiermodell gezeigt 10 43 . Jedoch sind in diesem Bereich noch viele Fragen offen bevor man an eine klinische Umsetzung dieses Ansatzes gehen kann. Bereits jetzt kann aber festgehalten werden, dass die Ergebnisse der Hörrehabilitation mit Cochlea Implantaten bei Patienten mit auditorischen Synaptopathien sehr gut sind, während Hörgeräte nur unzureichenden Benefit für die Betroffenen liefern (z. B. DFNB9, 7 ). Dagegen sind die Ergebnisse über verschiedene Formen der auditorischen Neuropathie hinweg weniger eindeutig 44 . Die bereits begonnenen Bemühungen zur Korrelation von molekulargenetischen Befunden und dem Outcome bei Cochlea Implantat Versorgung (z. B. 45 ) verspricht dem HNO-Arzt verbesserte Möglichkeiten zur Beratung von hörgestörten Kandidaten für ein Cochlea Implantat.

Abb. 4

Vergleich von synaptischen Proteinen in „konventionellen“ glutamatergen Synapsen des zentralen Nervensystems und in Bandsynapsen der Cochlea. Zahlreiche Proteine aus konventionellen Synapsen (links) sind in Bandsynapsen der Haarzellen (rechts) offenbar nicht vorhanden, während es dort spezielle Proteine gibt, von denen etliche durch Taubheitsgene kodiert werden (rot markiert). Modifiziert aus 38 .

Das Verständnis der Synaptopathie bzw. des Synapsenverlusts ist jedoch von genereller Bedeutung für die klinische Hals-Nasen-Ohrenheilkunde. Tierexperimente und Untersuchungen am menschlichen Felsenbein legen nahe, dass die Schädigung und der Verlust von Haarzellsynapsen auch bei häufigen Formen der Schwerhörigkeit, wie der Lärmschwerhörigkeit, der altersbegleitenden Hörstörung (komplex-genetische Erkrankungen: genetische Prädisposition und exogene Einflüsse) und der Schwerhörigkeit nach Einwirkung einiger ototoxischer Medikamente sowie beim Morbus Menière für das Krankheitsbild ursächlich ist 7 46 47 . Das klassische Experiment von Kujawa und Liberman 48 zum temporären Schwellenschwund in der Maus deutet darauf hin, dass ein Lärmtrauma, selbst bei kompletter Erholung der otoakustischen Emissionen und der Hörschwelle, zu einem irreversiblen Verlust von bis zur Hälfte aller Haarzellsynapsen führen kann: „Hidden Hearing Loss“. Dies wurde mit Immunhistochemie für das synaptische Band 49 und BERA Messungen belegt, die eine lineare Beziehung zwischen der Amplitude des Summenaktionspotenzial des Hörnervs und der Zahl der Haarzellsynapsen zeigte. Inzwischen wurden vergleichbare Befunde auch an anderen Spezies erhoben und mittels Elektrocochleografie an Jugendlichen mit Lärmanamnese eine relative Verminderung des Summenaktionspotenzials gezeigt 46 . Weitere klinische Studien wie auch Analysen von humanen Felsenbeinen sollten die Übertragbarkeit der tierexperimentellen Befunde erhärten bzw. überprüfen.

4. Zusammenfassung

Die Fortschritte in der Genetik und Molekularphysiologie des Hörens ermöglichen ein besseres Verständnis der molekularen Mechanismen von Hören und sensorineuraler Schwerhörigkeit. Um diesen Fortschritt für die klinische Praxis zu nutzen, ergeben sich die Notwendigkeiten für Updates aus der aktuellen Forschung, für differenzierte audiometrische Diagnostik und für die Zusammenarbeit mit NGS-erfahrenen Humangenetikern. Zunächst geht es also um verbesserte Diagnostik, v. a. bei Verdacht auf genetische Hörstörung. Dies hilft der Beratung der Betroffenen und ihrer Familien und erlaubt die differenzierte Wahl der Hörrehabilitation: z. B. Hörgerät vs. Cochlea Implantat bei der auditorischen Synaptopathie. Ähnliches gilt auch für die differenzierte Diagnostik von häufigen Formen der sensorineuralen Schwerhörigkeit wie der Lärmschwerhörigkeit. Die Translation von innovativen pharmakologischen oder gentherapeutischen Therapieverfahren für die sensorineurale Schwerhörigkeit wird noch Jahre der Forschung erfordern, aber hier sind nun Fortschritte absehbar. Es empfiehlt sich also „auf Empfang zu bleiben“.