[Regeneration - A New Therapeutic Dimension in Otorhinolaryngology].

Regeneration as a therapeutic priniciple and regenerative medicine in general are promising new strategies to add new therapeutic dimensions to our current treatment options. Today, reconstructive surgery, drugs and implants such as the cochlear implant can replace the functions of damaged tissues. In contrast, regenerative therapies aim at the replacement of the damaged tissues themselves while at the same time replacing their lost tissue function. In this review article new technologies such as 3D-bioprinting and the application of decellularised tissues as biomaterials are introduced and explained. A summary of current preclinical and clinical regenerative studies in otorhinolaryngology is complementing these basic aspects. Eigentümer und

Adipose-derived stem cells

Basic fibroblast growth factor

Extracellular matrix

National Institute of Health

Polyethylene glycol

Platelet-rich plasma

Stroma vascular fraction

1. Regenerative Medicine

1.1 Principles of regeneration

Regeneration is defined as the ability of an organism to replace lost tissue and organs. The term should be limited to mechanisms that recapitulate processes during embryogenesis and fetogenesis 1 . Whereas in humans and most mammals this ability is mostly lost and is restricted to certain tissues, including bone marrow, gastrointestinal mucosa, liver, and skin 1 , axolotls, Mexican salamanders, for example, are able to regenerate entire extremities. Recently, relevant mechanisms of this regeneration were determined 2 . It is currently assumed that various progenitor cells with defined regenerative potential are responsible for this form of regeneration 3 . However, macrophages also appear to play a key role in this process 4 .

Following an injury in humans, inflammatory processes occur and scars develop. In general, the original tissue function is at least partly lost because the scar tissue is not identical to the original tissue. Additionally, the immune system and remodeling of the extracellular matrix (ECM) play a crucial role in regeneration in other organisms, including, for example, the axolotl. An increasing and better knowledge of these processes will most probably influence the development of regenerative strategies 5 .

1.2 Introduction to regenerative medicine

The term of regenerative medicine and thus the use of the term regeneration as a therapeutic principle has in the meantime become accepted and is considered as one of the most promising fields of modern biomedicine. However, to date, no standardized definition exists. The NIH defines regenerative medicine as the “process of creating living, functional tissues to repair or replace tissue or organ function lost due to age, disease, damage, or congenital defects” ( https://report.nih.gov/NIHfactsheets/ViewFactSheet.aspx?csid=62 ). Regenerative medicine has the potential to solve the problem of the shortage of organs needed for organ transplantation 6 .

Occasionally, this definition is even extended so that single technologies, including tissue engineering and the therapeutic application of stem cells, represent only some aspects of regenerative medicine. In addition, medical devices may be able to induce regenerative mechanisms and in specific cases even be a regenerative therapy. Furthermore, gene therapy is included in the notion of regenerative medicine when it enables the activation of regenerative mechanisms.

Therefore, regenerative medicine is entirely different from common therapeutic procedures that simply replace the tissue function but not the tissue itself. One obvious example is the cochlear implant. The cochlear implant is an extremely successful prosthesis that is able to replace the function of deficient hair cells by directly stimulating the auditory nerve. The cochlear implant replaces the function of the inner ear but not the inner ear itself. By contrast, regenerative therapy for inner-ear hearing loss and deafness would replace deficient or lost hair cells either by applying gene therapeutic approaches, by inducing regenerative mechanisms, or by differentiating still-existing or externally-applied cells into hair cells.

In otorhinolaryngology, tissue defects after trauma, tumor resection, or in the context of congenital defects also need to be restored. Furthermore, the natural ageing process leads to changes, including the decrease of the hearing threshold, that require treatment. To date, in addition to surgical and pharmaceutical therapies, particularly with regard to otology, hearing aids and prostheses are available that may treat such alterations. However, nearly all fields of otorhinolaryngology might also be the objective of regenerative, therapeutic approaches. They range from the area of otology, where currently prostheses are used very successfully to restore hearing, to reconstructive facial surgery, where currently highly complex surgical procedures are applied for reconstruction. These approaches include the application of local flaps and grafts, the application of pedicled flaps, and microvascular transplants as well as facial transplants 7 , which was first performed successfully in 2005. Since the first operation, only 35 further cases of facial transplants have been described in the literature 8 . Innovative methods based on decellularized tissue and regenerative therapy strategies might provide an alternative in this field 9 .

In the following sections, 2 important technologies from the field of regenerative medicine, namely three-dimensional (3D) bioprinting and decellularized natural materials, and their applications, will be presented.

2. 3D Bioprinting

Tissue engineering has undergone tremendous advances due to the identification of novel stem cell sources and gene editing technologies as well as through the development of smart, responsive and cell-instructive materials. Perhaps the biggest leaps made in the field are being achieved through the combinations of these tools using advanced fabrication techniques such as bioprinting ( Fig. 1 ) 10 . By means of 3D bioprinting, cell suspensions may be printed layer-by-layer with biomaterials and thus highly complex three-dimensional structures can be created 11 . The potential advantages of bioprinting for reconstructive surgery include reduced donor site morbidity, reduced surgery time and improved aesthetic outcome.

Fig. 1

Important developments that promote the progress of regenerative medicine. Courtesy of 10 .

2.1 Bioprinting techniques and bio-ink

Bioprinting differentiates itself from conventional 3D printing in that the bioinks are solutions of hydrated polymers which can undergo crosslinking at physiologic conditions in the presence of cells. The 3D model which is printed can be designed from a photogrammetric scan of the patient or through reconstruction of MRI or CT data. Companies like Materialise ( http://www.materialise.com ) have specialized in producing accurate 3D models for surgical planning and clinical implants and prostheses. 3D models fabricated with bioprinting use one of 3 processing methods ( Fig. 2 ). In laser-assisted bioprinting ( Fig. 2 , middle), a pulsed laser is positioned over an energy-absorbing layer, causing drops of cell-containing bioink to be deposited onto a substrate. Likewise in inkjet printing ( Fig. 2 , on the left), minute droplets of hydrogels and cells are pulsed onto a substrate via the thermal or acoustic vibrations. In the most common method for printing larger, clinically-relevant structures ( Fig. 2 , on the right), microextrusion is used to deposit strands of bioink onto the substrate, the flow of which is controlled by pressure or the movement of a mechanical screw ( Fig. 2 ). The properties of the bioinks for these 3 methods vary considerably. Materials for inkjet printing and laser-induced printing have generally lower viscosity and cell content, whereas bioinks for microextrusion require viscous solutions and can contain high densities of cells 12 .

Fig. 2

Overview of different 3D-bioprinting procedures. Courtesy of 12 .

The success of bioprinted organs is highly dependent on the biological and rheological properties of the bioink. At the very least, an ink must simultaneously provide excellent cytocompatibility and good printing resolution. This so-called bioprinting window has been non-trivial to achieve 13 ( Fig. 3 ). High water content hydrogels are an excellent mimic of the native cartilage matrix and residing cells can produce large amounts of extracellular matrix proteins. Hydrogels however do not print with good shape fidelity and are very weak and brittle. Alternatively, many materials with excellent printability derive these properties from high polymer content and/or high crosslink density which inhibits diffusion of nutrients and results in poor cell viability 13 ( Fig. 3 ).

Fig. 3

Description of the so-called biofabrication window. Courtesy of 13 .

To address this problem, a popular approach is to strengthen the properties of hydrogels through the coextrusion of a thermoplastic, stiffer material 14 15 . In addition, there is a concentrated research effort to develop more advanced bioinks. The biological properties of bioinks can be augmented through the addition of decellularized matrix particles 16 . Likewise particles can enhance the mechanical properties of inks by serving as crosslinking nucleation sites 13 .

2.2 Bioprinting techniques for the head and neck

Advanced manufacturing or 3D printing has already made inroads in maxillofacial reconstruction 17 but bioprinting approaches are still largely investigated at the research level 18 . Due to its unique and complex contours which are critical for the aesthetic appearance, the human auricle has been a favorite target for 3D printing 141 . Already surgical planning tools for auricular reconstruction have been utilized 14 . Many bioprinting approaches using a number of cell types (auricular chondrocytes 19 , mesenchymal stem cells 20 , induced pluripotent stem cells 21 , and materials (nanocellulose and alginate)), ( Fig. 4 , bottom 22 23 ) have been reported. Pure hydrogel ear constructs are soft post-printing and required in vitro maturation to increase tissue properties. Thermoplastic reinforced materials allow sufficient strength to resist skin contraction during implantation and the reinforcement can fill the entire auricular shape, or be used to strengthen individual deconstructed modules corresponding to for example the back plate, helix/tragus and crux/antitragal regions ( Fig. 4 – top [142]).

Fig. 4

Auricle and parts of auricles produced by means of bioprinting procedures using different materials. Top: courtesy of [142]; bottom right: courtesy of 22 . Copyright 2015 American Chemical Society, bottom left: courtesy of 23 .

In summary, bioprinting for craniofacial reconstruction has great promise to make more functional, living, patient-specific grafts with improve clinical outcome. However there are currently no bioprinted products on the market and few tissue engineered products which are commercially successful. The regulatory and financial challenges surrounding these complex combination products are considerable 24 .

3. Decellularized Scaffold Materials

Scaffold materials are important components of in vitro and in-situ tissue-engineering techniques and of regenerative medicine in general. They provide mechanical stability and the specific shape for the tissue or organ that requires replacement. At the same time, they are expected to allow differentiation of the cells and nutrient transportation. The requirements of scaffolds are manifold and depend on the specific application 25 26 . Generally, a distinction is made between artificial and natural biomaterials 27 28 29 . In recent years, biological scaffolds have been successfully developed based on decellularized tissue, also termed bioscaffolds, and applied both preclinically and clinically 30 . The main advantage of decellularized tissues is that they preserve the natural complex structure of the ECM of the original tissue and thus represent an excellent basis for in vivo colonization with differentiated local and progenitor cells; furthermore, they contain numerous signal molecules that may induce functional tissue remodeling 30 . These materials and their modifications have the potential to completely change current strategies of tissue regeneration, also because of their specific interaction with the immune system 31 32 (see also chapter 3.2).

3.1 Basics and decellularization

The ECM consists of structural and functional molecules that are produced and secreted by local cells 1 . It is now well known that the ECM does not only create the structural preconditions but also contains extensive biological information 33 ; and is itself actively responsible for the structural and functional alterations of the cells within the ECM. During development and growth, but also as a response to tissue damage, these processes are activated 30 . The ECM contains among others collagens, glycoproteins, glycosaminoglycans, proteoglycans, adhesion molecules, growth factors, chemokines, and cytokines 30 . The essential role of those proteins becomes clear from the fact that mutations that inactivate the function of single proteins, for example, laminin and collagen, are frequently lethal 34 . The ECM proteins as an important part of the so-called micro-environment are able to influence the differentiation of cells, including, in particular, stem cells 35 . In this context, the term stem-cell niche is also used 35 . Furthermore, this micro-environment influences the immune system and thereby the activity and function of macrophages, which was recently confirmed 31 . Based on this knowledge, new biomaterial-based therapies can be developed that may induce pro-regenerative immune responses and thus the desired tissue regeneration 31 .

By means of various chemical, physical, and enzymatic methods, the local cells can be removed from tissue and organs, which is termed decellularization 30 . Currently, it is possible to decellularize nearly all tissues and organs and thus to obtain tissue-specific scaffolds 36 . In 2011, Badylak used the term of (re)constructive tissue modeling as defining the creation of functional location-specific tissue by means of decellularized materials 37 .

3.2 Role of macrophages

The role of macrophages as a relevant cellular component of regenerative mechanisms was discovered in recent years among others in the context of the regeneration of the extremities of the axolotl 4 . Additionally, macrophages play a key role in the regeneration of the zebrafish tail 38 . The role of macrophages in human wound healing is well known. Macrophages migrate to the site of the damage, clean the wound by phagocytosis, and initiate scarring.

Nonetheless, the roles of macrophages are increasingly analyzed in the context of the integration of biomaterials from decellularized tissue and they are considered to be relevant for regenerative medicine 39 . The positive aspects of macrophage activation, in particular, have been known for some time, whereby the shift of the pro-inflammatory M1 phenotype to the anti-inflammatory or remodeling M2 phenotype is a major aspect for functional tissue regeneration in contrast to scarring 39 . These findings serve for the production of biomaterials that may induce a regenerating phenotype instead of long-lasting inflammation. In this sense, they are relevant for the further development and modification of biomaterials that are essential, in particular, for the regeneration of supporting tissue, including tendons, bones, and cartilage.

4. Regenerative Medicine in Clinical Routine

4.1 Overview

Although regenerative procedures are increasingly applied in clinical trials, they are only rarely found in clinical routine 40 .

The manufacturing of cartilage tissue by means of tissue-engineering procedures is one of the most developed fields of regenerative medicine. In orthopedics, autologous chondrocyte implantation (ACI) and matrix-based autologous chondrocyte implantation (MACI) are already established in clinical routine. In 1994, Brittberg et al. were the first to publish this procedure, in the New England Journal of Medicine. During the last 20 years, it has proven to be a significant clinical option 41 42 43 44 . In the meantime, it has become an alternative for traumatic defects, particularly in younger patients. Because the application of chondrocytes from the joints displays the relevant disadvantage of causing secondary problems in the area of the donor site, currently, nasal chondrocytes have become the focus of interest 45 . Nasal chondrocytes derive from the neural crest 46 . Different investigations demonstrated that nasal chondrocytes are also able to display their effect, in particular, the synthesis of extracellular cartilage matrix, in other locations and are thus suitable as a possible cell source for transplantation 46 47 . A clinical phase I study 45 has already been conducted that confirmed these findings also in the clinical practice. Currently, a larger phase I/II trial has started in Basel, Switzerland, which is expected to confirm these results and the effectiveness of therapy in a larger patient cohort. In a clinical phase I trial, nasal chondrocytes have also been applied for the reconstruction of the alar lobule 48 . In this study, nasal septum chondrocytes were pre-cultured on a collagen fleece made of type I collagen and then inserted as an alar lobule transplant in combination with a forehead flap for reconstruction of the nostril. Because for transection of the forehead flap and refinement and optimization of the appearance a second and mostly even a third intervention was always required, tissue could be collected from the reconstructed area for analysis. Hereby, tissue regeneration could be proven histologically.

4.2 Lacking availability of regenerative therapies in clinical routine

A comparison of scientific publications with our clinical practice clearly shows that numerous experimental and preclinical studies on a wide range of topics are published without the possibility of applying them in clinical practice. A significant number of review articles deal with the question of why commercialization of such therapies is so difficult 40 49 50 . In general, the obstacles are found in the clinical, commercial, and regulatory sectors 50 . Frequently, preclinical data allow only insufficient transferability to humans 50 . Study design and ethical and safety concerns are the issues focused on in the clinic 51 52 , whereas commercialization is impeded by increasing costs and a high product-development risk 53 . Continuously higher safety level requirements and efficiency standards of a therapy as well as different regulations in different countries are relevant problems in the legal context 54 . Further important specific factors that have been identified, including the insufficient support of preclinical and clinical trials, a lack of knowledge by basic and clinical scientists about regulatory aspects that have to be observed when conducting studies from a commercialization aspect, the uncertain financial reimbursement of innovative therapies, and the production and upscaling aspects that are essential for commercialization 40 49 . One crucial factor for success for all actors in this field is to be aware of all these obstacles and to address them specifically already in the very early stages of research and development. This is only possible based on close interdisciplinary cooperation between industry and the regulatory institutions.

In addition to the above-mentioned factors, a fundamental rethink for the whole field of regenerative medicine is currently required 55 . Many experimental investigations do not or only partly include the basic vascular, neural, and lymphatic provision; frequently even the local microenvironment is not sufficiently considered 55 . Furthermore, immunological factors are frequently bypassed by using immune-incompetent animals. However, these factors are essential and of crucial relevance for clinical application. In future, it will be important to perform regenerative medicine even more within an interdisciplinary framework than is currently the case. Knowledge in the fields of developmental biology and immunology, as for example the role of macrophages in the limb regeneration of salamanders 2 4 , is only one such example. A close cooperation with developmental biology and immunology will be essential for regenerative medicine and is relevant for its viability.

5. Regenerative Procedures in Otorhinolaryngology – State-Of-The-Art

In the following, the focus will be placed on areas where clinical applications of regenerative therapies have already been published or preclinical trials approach clinical application. In addition, the above-mentioned fields of 3D bioprinting and decellularized scaffolds will be described in more detail, provided that they are relevant for the respective area. An overview of clinical studies of the indicated clinical applications is summarized in Table 1 .

Table 1 Different stages of the development of regenerative medicine in the head and neck regions.

	Case reports and case series	Phase I	Phase II/III	Commercial product	Routine
Cartilage, nose	Augmentation of the nasal dorsum (n=8; n=32) Yanaga, Japan 57 Spreader graft (?) (n=1) Ceccarelli, Italy 60	Reconstruction of lateral alar cartilage (n=5) Fulco, Switzerland 48	–	–	–
Cartilage, auricle	Partial and total reconstruction of the auricle (n=12) Yanaga, Japan 66 – 67	–	–	–	–
Facial nerve	Facial nerve; lesion of a length of up to 3 cm Navissano, Italy (n=7); NeuroTube 75 Facial nerve Gunn, USA (n=1); Avance 79 Facial nerve – frontal branch Inada, Japan (n=2); PGA collagen tube, no commercial product 77 Chorda tympani Yamanaka, Japan (n=3); PGA collagen tube, no commercial product 78	–	–	e. g. - PGA; NeuroTube ® – Collagen I: NeuraGen ® , NeuroMatrix ® , NeuroFlex ® – NeuraWrat ® , NeuroMend ® – decellularized human allograft Avance ®	–
Vocal folds	–	–	–	–	–
Larynx	–	–	–	–	–
Trachea	12-year-old child, compassionate use, Hamilton, UK 101 102	–	–	–	–
Eardrum	Gelatine + b-FGF (n=53), Kanemaru, Japan 104	Gelatine + b-FGF (n=11), Kanemaru, Japan 106	Gelatine + b-FGF; ongoing according to 106	Alloderm ® Tutopatch ® Audiomesh ® Surgisis ®	–
Mastoid	Kanemaru, Japan (n=10) 115 Kanemaru, Japan (n=26) 117	–	–	–	–
Salivary glands	PRP + ADSC + SVF, intraglandular, Cornella, Italy (n=1) [138]	Phase I/II study protocol, mesenchymal stem cells (n=30), Gronhoj, Denmark [139]	–	–	–

5.1 Rhinology and plastic-reconstructive surgery

5.1.1 Nose

Defects in the region of the nose may be congenital, traumatic, or iatrogenic. In rhinology and plastic-reconstructive surgery of the head and neck, numerous clinical studies applying regenerative procedures for the reconstruction of cartilaginous tissue of the nose have already been conducted and published. They start with the use of autologous chondrocytes for augmentation of the nasal dorsum, as first published by Yanaga et al. in 2004 56 . In this publication, 8 patients were described from whom autologous chondrocytes were isolated from the cartilage of the cavum conchae and amplified. Subsequently, the generated gel-like suspension was injected into the nasal dorsum and in one case into the chin for augmentation. The assessment of the outcome was mainly performed macroscopically and in one case by means of magnetic resonance imaging. In another study from 2006 57 , further results achieved with this methods were published. In 32 patients, a suspension of amplified auricular chondrocytes was used for augmentation of the nose and other locations. The outcome here was also assessed mainly macroscopically. In 8 patients, a biopsy taken from the transplanted tissue suggested the presence of cartilaginous tissue. Significant limitations of these studies include insufficient study design without control groups or standardized evaluation and a lack of a description of the cell-culture technique, which makes repetition of the investigations impossible. Therefore, it is clearly not possible to draw further conclusions from these studies, even though Yanaga and his team applied this technique again in another study with 18 patients in 2013 58 . This time, a slight modification of the cell-culture method was performed and the tissue was first transplanted into the abdominal wall. After approximately 6 months, the transplanted tissue, now surrounded by fatty tissue, was used for augmentation of the nasal dorsum and the chin in special cases with particularly thin skin. However, to date, no publications by other authors using this technique are known. Yanaga and co-workers described this technique in further publications, including for the creation of auricular cartilage for the treatment of microtia (see chapter 5.1.2). In 2017, a case report was published by Ceccarelli et al. 59 , who applied a micro-grafting technique patented for the treatment of chronic wounds (“Rigenera ® ”) 60 in open septorhinoplasty that required insertion of spreader grafts. Unfortunately, this publication also failed to clearly describe the methods and rationale.

A relevant, and thus important, progress was achieved in a study by Fulco et al. in 2014 that was published in the Lancet 48 . The aim of this phase I study was to investigate the safety and feasibility of their method. The alar lobule of 5 patients was reconstructed after tumor resection using cartilage tissue produced in vitro. Additionally, a forehead flap or a nasolabial flap was used for the reconstruction of the outer skin. The cartilage tissue was obtained from the cartilage of the nasal septum, and chondrocytes were isolated and amplified in vitro and then cultured on a collagen I fleece (Chondro-Gide, Geistlich Pharma, Wullhusen, Switzerland). This collagen I scaffold had already been tested and approved for use in joints. In parallel, 2 scaffolds were cultivated. One scaffold was used for transplantation, the second for in vitro analysis so that an assessment of the in vitro chondrogenesis could be performed. After 6 months, the reconstructions were refined and at the same time tissue for histologic examination was obtained from the transplanted area. The study confirmed the safety and feasibility of this method. Furthermore, it was observed for the first time that in vitro-produced cartilage tissue was still present on the site of transplantation, even if the amount was highly variable. The secondary outcome parameters of patient satisfaction and stability of the alar lobule, as assessed by means of nasal-flow measurement, also indicated that this technique was an alternative for classic transplantation of septum or ear cartilage for the reconstruction of lateral alar cartilages. A controlled study verifying and refining these results is currently unavailable.

5.1.2 Auricle

Defects of the auricle may be congenital or occur after trauma or tumor resection. Despite a multitude of in vitro and animal experimental studies confirming the possibility to produce cartilage in the shape of a human auricle 61 62 63 64 65 , currently, there are no high-quality trials that have applied this technique in clinical practice. Only Yanaga et al. used the technique described above (see chapter 5.1.1), where it was applied for nasal augmentation, in a modified way for auricle reconstruction 66 67 . The authors isolated chondrocytes from the microtic auricles of 4 patients and used these cells to produce a cartilage matrix that developed 6 months after subcutaneous injection of the cells in the abdominal region. Subsequently, without an exact description of the technique, an auricular scaffold 68 69 was shaped from this cartilage matrix and transplanted into the auricular area. According to the authors, 12 patients have now been treated, and up to 6 years after surgery no relevant resorption of the auricular scaffold has been observed 67 .

In particular, for complex 3D structures like the human auricle, 3D bioprinting appears to be optimal for restoration. In an initial publication, the principle could be clearly demonstrated 23 . However, in addition to the 3D shaping, the surrounding skin frequently represents a significant problem in auricular reconstruction, because in most cases the available skin is much thicker than the auricular skin. Therefore, a major objective is the creation of a vascularized composite graft from cartilage and skin.

The decellularization of ear cartilage might also be a pioneering innovation in the field of auricular reconstruction. Utomo et al. have already characterized in detail the decellularized human auricle 70 . However, own results (unpublished) reveal an insufficient stability of decellularized auricles after implantation in rabbits.

5.1.3 Facial nerve

Neural damage in the head and neck regions may be traumatic, cancer-related, but also iatrogenic. Frequently, the facial nerve is involved. The treatment encompasses end-to-end anastomoses when the defect length is relatively short, whereas for longer gaps that cannot be adapted tension-free, the application of autologous nerve transplants is the current gold standard 71 . The use of autologous nerve transplants is associated with donor site morbidity, including sensitivity deficits; furthermore suitable transplants are not always available regarding length and diameter 72 . With this background, regenerative procedures are considered as being a promising alternative for nerve repair 73 . In recent years, a multitude of new techniques have been developed for reconstructing nerve defects (nerve tubes). Some of them have reached the clinic, but without being extended into the clinical routine. These procedures pursue among others the principle of finding suitable tubes for the growth of the axons while at the same time impeding the ingrowth of fibroblasts from the environment 74 . For example, autologous veins have been used successfully as neurotubes, but they are not always available. Therefore, synthetic tubes are now a focus of research. Absorbable materials are preferred, because secondary interventions may be avoided for the removal of the non-absorbable materials. Polyglycolic acid, which has been used as a component of surgical suture material for many years, was approved as the first absorbable nerve transplant (NeuroTube, Synovis, Birmingham). In addition to others, Navissano et al. 75 reported the successful clinical application of NeuroTube in lesions of the facial nerve with gaps of up to 3 cm. Negative aspects are the price, the possibly too rapid resorption rate, and the risk of toxic metabolites 73 . In addition, tubes made of collagen I were applied in many preclinical investigations and in clinical studies, and appear to be equivalent to an as autologous nerve transplant for gaps of approximately 1.5–2 cm 73 . Currently, 5 collagen neurotubes are available for clinical use (NeuraGen, NeuroMatrix, NeuroFlex, NeuraWrap, and NeuroMend). Nonetheless, their application is not firmly implemented in clinical routine. Because the published trials do not provide consistent results, it remains unclear whether neurotubes are suitable for longer defects (>1.5 cm), even if they proved to be equivalent to a nerve transplant for short gaps 76 . In 2007, Inada et al. applied a neurotube made of polyglycolic acid (PGA) and collagen I to repair the frontal branch of the facial nerve in 2 patients 77 . Furthermore, a small case series (n=3) was published by Yamanaka et al., who successfully reconstructed the chorda tympani using a similar tube of PGA and collagen I 78 . Both products are not commercially available or approved in Germany. In a case report, Gunn et al. described the repair of the tympanic and mastoidal segments of the facial nerve using a decellularized human implant (“Avance”) 79 .

Decellularized nerve transplants are currently being evaluated in preclinical trials. The initial results indicate comparable outcomes with respect to autologous nerve transplants 80 81 . The use of 3D-bioprinting techniques has been suggested for nerve regeneration, because of the excellent possibility to produce clearly defined tubes 82 .

5.2 Laryngology and tracheal surgery

5.2.1Vocal cords

The vocal folds as a vibratory and complex multilayer part of the larynx are responsible for respiration and phonation. Biomechanical stress, smoking, inflammation, irradiation, or intubation may significantly disturb the function of the vocal folds and lead to a significantly impaired quality of life 83 . Voice therapy of various disorders is not always sufficient, but surgical treatment is always associated with the risk of additional scarring and further deterioration of the voice 84 . Therefore, the treatment of functional disorders and defects of the vocal folds is also an important aim of regenerative strategies. Research currently focuses on the application of bioactive factors, biomaterials, and stem cells 85 86 87 . The requirements of suitable biomaterials are extremely complex, because on the one hand mechanical stability for insertion into the larynx is necessary and on the other hand the vibratory ability of the vocal folds requires enormous flexibility. Hydrogels were evaluated several times regarding injection into the vocal folds 88 , with materials like collagen and elastin play a key role as well as the combination with stem cells or fibroblasts from the patients’ own vocal folds 89 . Stem-cell application can be performed by injection or mobilization of endogenous stem cells 87 . This procedure has already been investigated in animal models, in particular in cases of acute damage of the vocal folds. Clinical trials have not yet been performed

Like the application of decellularized vocal folds, 3D bioprinting has only been described in 3D bioprinting and decellularization of the entire larynx 90 91 .

5.2.2 Larynx

Because of the diversity of tissues in the larynx and the complex function for voice formation and swallowing, the creation of an artificial larynx is a considerable challenge. Currently, the restoration of laryngeal function after partial or total laryngectomy is only partly possible and is associated with major impairment for the patients. Hamilton and Birchall state in a recent review article that the treatment of laryngeal cancer will be crucially influenced by the developments in the field of laryngeal regeneration over the next 10 years 92 . Larynx transplantation is currently mainly a theoretical option that can only be applied in exceptional cases and that is not suitable for reconstruction after tumor surgery. However, it has been described twice in the literature 93 94 . To create an artificial larynx, the production of various tissues, including cartilage, laryngeal muscles, and laryngeal mucosa, must be coordinated. These tissues have to be connected with the vascular and neural systems of the receiver to restore laryngeal function. A potential alternative is the decellularization of an allogenic larynx as a scaffold that could be seeded with different cell types 91 . One major advantage of this strategy is that the complex laryngeal shape and the various ECMs of the different tissues are available as sources for seeding. However, to date, no preclinical or clinical applications of this strategy have been published. Another option for laryngeal reconstruction is the application of bioprinting strategies, of which the general principles were described in detail in chapter 2. However, for the larynx, no references are available, but an individualized tracheal stent made of polycaprolactone by bioprinting has already been successfully implanted 95 . Further progress in this field may well develop as rapidly as assumed by Hamilton and Birchall 92 .

5.2.3 Trachea

In general, tumors and trauma, but also congenital lesions may lead to a situation where important parts of the trachea require reconstruction. Because resection and end-to-end anastomoses are only possible up to a length of approximately 5 cm in adults, the trachea is also an important focus of regenerative procedures 96 97 .

Even if the trachea was considered as the first organ that could be produced in vitro by means of stem cells 98 , its attempted regeneration was a disaster within the entire field of regenerative medicine because, patients underwent surgery without sufficient preclinical data or a solid scientific basis 97 . The published data have to be considered as scientific fraud 99 100 . Only one case of the successful application of a decellularized trachea seeded in vivo with autologous cells can be cited 101 . In this case, a 12-year-old child suffering from congenital long-segment tracheal stenosis was treated with a decellularized trachea 102 . The child has to date survived 4 years since this treatment, although multiple revisions have been necessary 101 .

Even if decellularization and 3D printing are important approaches for tracheal reconstruction, especially for tracheal surgery, extensive and thorough experimental and preclinical data are essential before further clinical application.

5.3 Otology

5.3.1 Tympanic membrane

Defects of the tympanic membrane may occur during acute and chronic otitis media, but also after trauma. While acute tympanic membrane perforations have a very good rate of spontaneous healing, chronic defects require surgical treatment. Although this treatment is frequently successful when cartilage-perichondrium, perichondrium, or muscle fascia transplants with a low donor site morbidity are applied, nonetheless a surgical intervention is required under local or general anesthesia and is not always successful. For this reason, the tympanic membrane is also an objective of research in regenerative medicine; and cost-effective non-surgical therapeutic options are being investigated 103 .

Already in 2011, Kanemaru et al. reported the successful clinical closure of perforations of the tympanic membrane in chronic otitis in more than 98% of the patients 104 . In this study, the tympanic membrane was surgically restored and then a small defect-adapted block of gelatin with or without basic fibroblast growth factor (b-FGF) was applied and fixed using fibrin glue. Only the addition of b-FGF led to the high closure rates while only 1 of 10 perforations could be closed in the control group. Jackler called this development possibly the greatest progress in otology since cochlear implantation 105 . The results of the first study published by Kanemaru et al. were confirmed in a subsequent study in 2017 106 . However, in this later trial, only 11 patients were treated. In the sense of a phase I study, first the safety of this therapy was analyzed without identifying therapy-induced adverse events. Long-term results have not yet been published. Furthermore, the study design, in particular of the 2011 trial, does not correspond to current standards of a clinical phase I study. Nonetheless, both clinical studies provided the first evidence that regenerative therapy might be suitable for the closure of tympanic membrane perforations. Another larger prospective randomized clinical trial was initiated that according to the authors is currently recruiting patients 106 . The technique to apply gelatin with b-FGF was furthermore employed by the authors to treat auditory meatus defects in 54 patients 107 . Unfortunately, the preclinical rationale of this study and its design is imprecisely described. In preclinical research, 3D bioprinting is also used to regenerate the tympanic membrane 108 , which could be shown in the closure of chinchilla tympanic membrane defects. Even decellularized tissue has already been analyzed for tympanoplasty in preclinical studies and in some clinical trials 109 110 . In particular, AlloDerm (LifeCell Corp., USA), which is a product of decellularized human skin, was demonstrated to be equivalent to temporalis fascia with regard to closure rates 109 110 while at the same time requiring a shorter duration of surgery 111 . However, in Germany, AlloDerm is currently not available for tympanoplasty. An overview published by Kaftan presents further decellularized materials in detail 112 . Currently, these materials are not applied for tympanoplasty in Germany on a larger scale. Our own investigations revealed that the acoustic properties of decellularized cartilage tissue are comparable with human tympanic membranes and thin cartilage transplants 113 . However, this material is not currently available for clinical trials.

5.3.2 Mastoid

The mastoid is also a focus of regenerative medicine in otolaryngology 114 115 . In addition to the Eustachian tube, pneumatized mastoid cells play a key role in pressure balance in the middle ear 116 . Their presence and function can impede the development of cholesteatomas and other chronic middle-ear diseases 115 . In a clinical study, 3D hydroxyapatite (3D-HA) was applied in 10 patients for reconstruction of mastoid air cells. After 12 months, in up to 60% of cases, re-epithelized mastoid cells were found during second-look surgeries 115 . The authors postulate that in applying this method, cases of chronic otitis might be treated that otherwise could not be optimally treated. In another trial from 2013, Kanemaru et al. published a positive effect of this therapy on the function of the Eustachian tube 117 . In 26 patients, again 3D-HA was applied for regeneration of mastoid air cells in addition to conventional cholesteatoma treatment and tympanoplasty. In approximately 70% of cases, an improved tube function could be confirmed intraoperatively compared to the pre-surgery situation, while this was only observed in approximately 13% of the conventionally-treated patients. Furthermore, there are other preclinical studies in which other materials, including poly-D,L-lactide-poly-glycolic acid/polyethylene glycol (PLGA/PEG) 118 and polycaprolactone/β-tricalcium phosphate (PCL/β-TCP) 119 , are used for reconstruction of mastoid air cells. Neither 3D bioprinting nor decellularized tissues have to date been used for mastoid reconstruction.

With regard to regeneration and preservation of hair cells, numerous experimental investigations have been conducted. Recently, pioneering publications on inner-ear regeneration have appeared [120,121]. They demonstrate that the therapeutic regeneration of human hair cells might be a potential new way of treatment. Because another review article of this issue deals with treatment of the inner ear, this topic will not be considered here, rather we refer to the contribution of T. Moser and the references 120 121 .

5.4 Salivary glands

Xerostomia after radiation or radioiodine therapy is a serious adverse effect of these therapies and significantly impairs the quality of life of head- and neck-cancer patients. Currently, there is no causal therapy for xerostomia. Even highly improved irradiation procedures, including intensity modulated radiotherapy (IMRT) 122 123 , and the preventive application of amifostine 124 are unable to completely prevent xerostomia. Innovative radiation procedures that attempt to spare stem cell-containing glands 125 are not yet available in the clinical practice. Therefore, salivary gland tissue is also an important focus of regenerative therapy procedures. In addition to classic tissue-engineering approaches to produce glandular tissue in vitro, today stem cell-based procedures have come to the fore 126 . A relevant aspect of radiation- and radioiodine therapy-induced damage is the loss of acinar cells in addition to fibrosis, such that saliva secetion after these therapies is severely reduced 127 62 129 . Therefore, it may be beneficial that the original glandular structure is still present, and by means of stem cells the function of the salivary glands may be restored.

A large number of preclinical studies have been conducted in various animal models with different cell types that all revealed that stem cells after tissue damage (i. e. surgical trauma or radiation) migrate to the site of damage 130 62 62 133 and positively influence the tissue there. Additionally, a direct positive effect of stem cells could be confirmed in several animal models. The research team of Coppes from Groningen, The Netherlands, has provided basic explanations for the effective mechanism of stem cells originating from salivary glands. They convincingly showed that these cells are able to significantly increase saliva production 134 62 62 137 . In 2017, 2 studies were published that applied stem cells for the regeneration of radiation damage in patients for the first time 138 139 . One of these studies is only a case report. The authors applied a mixture of platelet-rich plasma (PRP), adipose-derived stem cells (ADSC), and stromal vascular fraction (SVF) from autologous lipoaspirate to the parotid glands and the submandibular glands of both sides. After 31 months, no severe adverse events were reported and according to the authors, the patient wanted to further participate in the treatment. Important information with regard to the safety and effect of such therapy cannot be retrieved from this report about the application of the cell mixture in one patient 138 . Detailed planning of a phase I study is required, as described by authors from Denmark: They published the study protocol of a placebo-controlled, double-blind randomized phase I/II study that applies adult mesenchymal stem cells for the regeneration of radiation damage in 30 patients after radiation exposure (EudraCT, Identifier: 2014-004349-29; clinicaltrials.gov, Identifier: NCT02513238) 139 . The clinical results of the study are not yet available. It may be expected that also glandular stem cells will be applied in the near future in first phase I or phase I/II studies, so that salivary gland regeneration might be one of a few areas where the findings of preclinical investigations really do lead to clinical studies, even if it is not yet part of the clinical routine.

Based on the current development in the field of 3D bioprinting, cell- and biomaterial-based tissue-engineering strategies for salivary gland regeneration may also receive a new boost, because they may enable the production of complex 3D structures, including the salivary glands 140 .

Conclusion

Whereas regenerative therapies for example in orthopedics are applied not only in clinical studies but also in clinical routine, only a few approaches have reached the level of clinical phase I studies in otorhinolaryngology, despite a variety of potential applications and a similar variety of preclinical studies. These include the application of tissue-engineered cartilage tissue for the reconstruction of the nose and of stem cells for salivary gland regeneration after radiation.

Significant obstacles to the clinical translation and subsequent extension into the clinical routine are the high costs that are associated with such individualized regenerative therapies. Even regulatory preconditions for clinical application frequently cannot be sufficiently fulfilled. Despite all these obstacles, regenerative medicine as innovative technology will fundamentally influence all areas of medicine, including the discipline of otorhinolaryngology, in the following years and decades. It is essential to discontinue unsuccessful strategies and to combine new findings from cell and developmental biology with the progress of immunology and new technologies, including bioprinting 55 .

adipose derived stem cells - Fettgewebsstammzellen

basic fibroblast growth factor

extrazelluläre Matrix

National Institutes of Health

Polyethylenglykol

platelet rich plasma

stroma vascular fraction

1.1 Prinzipien der Regeneration

Regeneration bezeichnet die Fähigkeit eines Organismus verlorengegangene Gewebe und Organe zu ersetzen und sollte begrifflich auf Mechanismen beschränkt werden, die die Vorgänge während der Embryogenese und der Fetogenese rekapitulieren 1 . Während diese Fähigkeit beim Menschen und den meisten Säugetieren weitgehend verlorengegangen ist und nur in bestimmten Geweben wie dem Knochenmark, der gastrointestinalen Mukosa, der Leber und der Haut vorkommt 1 , sind bspw. Axolotl, mexikanische Salamander in der Lage ganze Gliedmaßen zu regenerieren. Erst kürzlich konnten wesentliche Mechanismen dieser Regeneration aufgedeckt werden 2 . Man geht heute davon aus, dass verschiedene Progenitorzellen mit definiertem Regenerationspotenzial gemeinsam für diese Regeneration verantwortlich sind 3 , dass aber auch Makrophagen eine wesentliche Rolle bei diesem Prozess spielen 4 .

Nach einer Verletzung beim Menschen laufen entzündliche Prozesse ab und eine Narbe wird gebildet. Im Allgemeinen geht dabei die ursprüngliche Gewebefunktion zumindest teilweise verloren, da das Narbengewebe nicht dem ursprünglichen Gewebe entspricht. Auch das Immunsystem und die Remodellierung der extrazellulären Matrix spielen eine wesentliche Rolle für die Regeneration in anderen Organismen wie z. B. dem Axolotl. Es ist wahrscheinlich, dass die zunehmenden und besseren Kenntnisse dieser Abläufe die Entwicklung regenerativer Strategien zukünftig wesentlich beeinflussen werden 5 .

1.2 Einführung in die Regenerative Medizin

Der Begriff Regenerative Medizin und mit ihm die Verwendung der Regeneration als therapeutisches Prinzip ist heute allgemein akzeptiert und wird als einer der vielversprechendsten Bereiche der modernen Biomedizin angesehen. Dennoch existiert bislang keine einheitliche Definition. Die NIH definiert Regenerative Medizin als die Herstellung lebender, funktionaler Gewebe mit dem Ziel Gewebe- oder Organfunktionen wiederherzustellen, die aufgrund von Krankheit, Trauma, kongenitalen Defekten oder Alter verloren gegangen sind ( https://report.nih.gov/NIHfactsheets/ViewFactSheet.aspx?csid=62 ). Die Regenerative Medizin hat das Potenzial die Probleme der Organknappheit im Bereich der Organtransplantation zu lösen 6 .

Teilweise wird diese Definition heute noch viel weiter gefasst, so dass einzelne Technologien wie Tissue Engineering und die therapeutische Anwendung von Stammzellen nur einige der Aspekte der Regenerativen Medizin darstellen. Auch medizinische Devices können in der Lage sein Regenerationsmechanismen zu induzieren und können im spezifischen Fall auch eine regenerative Therapie darstellen. Auch die Gentherapie, wenn sie in der Lage ist regenerative Mechanismen zu aktivieren fällt dann unter den Oberbegriff der Regenerativen Medizin.

Die Regenerative Medizin unterscheidet sich somit grundlegend von den heute üblichen therapeutischen Verfahren die lediglich die Funktion von Geweben ersetzen aber nicht das Gewebe selbst. Verdeutlicht werden kann dies bspw. am Cochlea Implantat. Das Cochlea Implantat ist eine extrem erfolgreiche Neuroprothese, die in der Lage ist die Funktion defekter Haarzellen zu ersetzen, indem sie den Hörnerven direkt elektrisch stimuliert. Das Cochlea Implantat ersetzt also die Funktion des Innenohrs aber nicht das Innenohr selbst. Eine regenerative Therapie für die Innenohrschwerhörigkeit und Taubheit würde im Gegensatz dazu die defekten oder verloren gegangenen Haarzellen ersetzen, sei es durch die Verwendung gentherapeutischer Ansätze, durch die Induktion regenerativer Mechanismen oder durch die Differenzierung noch vorhandener oder von extern applizierten Zellen in Haarzellen.

Auch in der Hals-Nasen-Ohrenheilkunde müssen Gewebedefekte nach Trauma, Tumorresektionen oder auch im Rahmen kongenitaler Defekte wiederhergestellt werden. Auch der natürliche Alterungsprozess führt zu Veränderungen, wie z. B. einer Abnahme der Hörschwelle, die behandelt werden müssen. Bisher stehen uns neben chirurgischen und medikamentösen Therapien v. a. im Bereich der Otologie Hörgeräte und Prothesen zur Verfügung, die diese Veränderungen therapieren können. Nahezu alle Bereiche der HNO-Heilkunde können auch das Ziel regenerativer therapeutischer Ansätze sein. Diese reichen von der Otologie, in der gegenwärtig Prothesen sehr erfolgreich für die Wiederherstellung des Hörens verwendet werden bis zur rekonstruktiven Gesichtschirurgie, in der derzeit v. a. komplexe chirurgische Verfahren für die Wiederherstellung verwendet werden. Diese reichen wiederum von der Verwendung lokaler Lappenplastiken und Grafts über die Verwendung gestielter Lappen und mikrovaskulärer Transplantate bis hin zur Gesichtstransplantation 7 , die erstmals 2005 erfolgreich durchgeführt wurde. Seither finden sich lediglich 35 weitere in der Literatur beschriebene Fälle von Gesichtstransplantationen 8 . Neue Methoden auf der Basis dezellularisierter Gewebe und regenerativer Therapiestrategien könnten auch hier eine Alternative darstellen 9 .

Im Folgenden sollen 2 wesentliche aktuelle Technologien aus dem Bereich der Regenerativen Medizin und ihre Anwendungen, das 3D-Bioprinting und dezellularisierte natürliche Materialien vorgestellt werden.

2. 3D-Bio-Druck (3D-Bioprinting)

Die Regenerative Medizin hat sich mit der Identifikation neuer Stammzellquellen, durch Geneditierungstechnologien sowie durch die Entwicklung von intelligenten, adaptiven und zellinstruierenden Materialien technologisch enorm weiterentwickelt. Die wahrscheinlich größten Fortschritte werden dabei durch Kombinationen dieser Technologien mit der Hilfe von neuen Herstellungsmethoden wie dem Bio-Druck erreicht ( Abb. 1 ) 10 . Mithilfe des 3D-Bio-Drucks können Zellsuspensionen schichtweise auf oder mit Biomaterialien gedruckt werden und so hochkomplexe dreidimensionale Strukturen hergestellt werden 11 . Die möglichen Vorteile von Bio-Druck Verfahren für die rekonstruktive Chirurgie sind unter anderem die reduzierte Hebemorbidität, verkürzte OP-Zeit und ein verbessertes ästhetisches Ergebnis.

Abb. 1

Wichtige Entwicklungen, die den Fortschritt in der Regenerativen Medizin vorantreiben. Nachdruck mit Erlaubnis aus 10 .

2.1 Bio-Druck Techniken und Bio-Tinten

Der 3D-Bio-Druck unterscheidet sich vom konventionellen 3D-Druck durch die Verwendung von sog. Bio-Tinten, die Lösungen aus hydratisierten Polymeren sind, die unter physiologischen Bedingungen in der Gegenwart von Zellen quervernetzt werden können. Das zu druckende 3-dimensionale Gewebe kann z. B. aus MRT- oder CT-Daten oder auch aus Daten von Oberflächenscans von Patienten hergestellt werden. Verschiedene Firmen, wie z. B. Materialise ( http://www.materialise.com ) haben sich auf die Produktion von exakten 3D-Modellen für die chirurgische Planung und für individualisierte Implantate und Prothesen spezialisiert. 3D-Modelle können mit drei unterschiedlichen Bio-Druckverfahren hergestellt werden ( Abb. 2 ). Beim laser-assistierten Bio-Druck ( Abb. 2 Mitte) wird ein pulsierender Laser über eine Energie-absorbierende Schicht platziert, was dann dazu führt dass Tropfen der zellhaltigen Bio-Tinte auf einem Substrat platziert werden können. In ähnlicher Weise werden beim Tintenstrahl-Druck ( Abb. 2 links) Tropfen aus Hydrogelen und Zellen durch thermische oder akustische Pulsationen auf ein Substrat aufgetropft. Bei der am häufigsten verwendeten Druckmethode um größere, klinisch-relevante Strukturen herzustellen wird die Mikroextrusionsmethode ( Abb. 2 rechts) verwendet. Dabei werden Fäden aus Bio-Tinte auf ein Substrat aufgebracht, wobei der Tintenfluss durch den Druck oder die Bewegung einer mechanischen Schraube kontrolliert wird ( Abb. 2 ). Die Eigenschaften der Bio-Tinten, die für die unterschiedlichen Verfahren verwendet werden, variieren erheblich. Materialien für das Tintenstrahl-Drucken und für den laser-induzierten Druck besitzen im Allgemeinen eine niedrige Viskosität und einen niedrigen Zellgehalt, während Bio-Tinten beim Mikroextrusionsverfahren eine höhere Viskosität aufweisen müssen aber auch höhere Zellzahlen enthalten können 12 .

Abb. 2

Übersicht über verschiedene 3D-Bio-Druckverfahren. Nachdruck mit Erlaubnis aus 12 .

Die Qualität von Organen, die mittels Bio-Druck hergestellt wurden hängt ganz entscheidend von den biologischen und rheologischen Eigenschaften der Bio-Tinte ab. Eine Bio-Tinte muss sowohl eine exzellente Biokompatibilität als auch gleichzeitig eine gute Auflösung beim Drucken besitzen. Diese Eigenschaften, die idealerweise im sogenannten „Bio-Druck Fenster“ („biofabrication window“) liegen sollten, sind nur sehr schwer zu erreichen 13 ( Abb. 3 ).

Abb. 3

Darstellung des sogenannten Bio-Druck-Fensters („biofabrication window“). Nachdruck mit Erlaubnis aus 13 .

Hydrogele mit hohem Wassergehalt sind exzellent geeignet um die native Knorpelmatrix nachzuahmen, gleichzeitig sind Chondrozyten in der Lage in Hydrogelen große Mengen extrazellulärer Matrixproteine zu produzieren. Nachteilig ist jedoch, dass Hydrogele nicht mit guter Formgenauigkeit gedruckt werden und zudem sehr weich und mechanisch instabil sind. Andererseits erhalten viele Materialien mit guten Druckeigenschaften diese durch einen hohen Polymergehalt und/oder durch viele Quervernetzungsstellen, die die Diffusion von Nährstoffen behindern und zu einer niedrigen Zellvitalität führen 13 ( Abb. 3 ).

Ein vielversprechender Ansatz zur Auflösung dieser Gegensätze ist, die mechanischen Eigenschaften von Hydrogelen durch die gleichzeitige Extrusion eines thermoplastischen, stabileren Materials zu verstärken 14 15 . Zusätzlich wird in großem Stil an der Entwicklung besserer Bio-Tinten gearbeitet. So können die biologischen Eigenschaften von Bio-Tinten bspw. durch die Zugabe von dezellularisierten Matrixpartikeln verbessert werden 16 . Ebenso können Partikel durch ihre Wirkung als Quervernetzer die mechanischen Eigenschaften der Bio-Tinten verbessern 13 .

2.2 Bio-Druck Techniken für den Kopf-Hals-Bereich

Moderne Fertigungstechnologien und 3D-Drucktechniken finden bereits Anwendung im Bereich der knöchernen Gesichtsschädelrekonstruktionen und als Planungsinstrumente für komplexe chirurgische Eingriffe 17 , darüber hinaus wird der Bio-Druck jedoch vorwiegend im Rahmen experimenteller Untersuchungen eingesetzt 18 . Aufgrund ihrer einzigartigen und komplexen Form, die für das ästhetische Erscheinungsbild essentiell ist, ist die humane Ohrmuschel ein beliebtes Ziel von 3D-Bio-Druckverfahren. Dabei wurde der 3D-Druck bereits als chirurgisches Planungsinstrument für die Ohrmuschelrekonstruktion verwendet 141 . Verschiedene Bio-Druck Ansätze die unterschiedliche Zelltypen wie aurikuläre Chondrozyten 19 , mesenchymale Stammzellen 20 , induzierte pluripotente Stammzellen 21 und unterschiedliche Materialien wie Nanocellulose und Alginat ( Abb. 4 unten 22 23 ) verwenden wurden bereits publiziert. Konstrukte die nur aus Hydrogelen hergestellt wurden, sind nach dem Bio-Druck sehr weich und erfordern die weitere Ausreifung in-vitro um ausreichende biomechanische Eigenschaften zu gewährleisten. Thermoplastisch verstärkte Materialien ermöglichen die Herstellung von Konstrukten mit ausreichender biomechanischer Stabilität um den mechanischen Anforderungen durch den Druck der Haut nach der Implantation standzuhalten. Diese Verstärkungen können für die gesamte Ohrmuschel verwendet werden oder um einzelne Teile der Ohrmuschel wie das Cavum conchae, Helix, Tragus oder den Antitragus zu verstärken ( Abb. 4 oben 142 ).

Abb. 4

Mithilfe von Bio-Druckverfahren hergestellte Ohrmuscheln bzw. Teile von Ohrmuscheln aus verschiedenen Materialien. Oben: Abbildung mit Erlaubnis aus 142 , unten rechts: Abdruck aus 22 . Copyright 2015 American Chemical Society, unten links: Abdruck aus 23 .

Zusammenfassend ist der Bio-Druck eine äußerst vielversprechende Technologie für Rekonstruktionen im Kopf-Hals-Bereich, mit der vitale und funktionelle, patientenspezifische und individualisierte Transplantate für verbesserte klinische Ergebnisse hergestellt werden können. Gegenwärtig sind jedoch noch keine Produkte auf dem Markt die mit Bio-Druck Verfahren hergestellt werden, auch nur wenige andere tissue engineerte Produkte sind klinisch einsetzbar und erfolgreich. Dies liegt unter anderem an den regulatorischen und finanziellen Hürden die bei der Herstellung derart komplexer Medizinprodukte addressiert werden müssen 24 .

3. Dezellularisierte Trägermaterialien

Trägermaterialien sind ein wesentlicher Bestandteil von in-vitro und in-situ Tissue Engineering Techniken und der Regenerativen Medizin im Allgemeinen. Sie stellen mechanische Stabilität und die spezifische Form des zu ersetzenden Gewebes bzw. Organs bereit. Gleichzeitig sollen sie eine Differenzierung der Zellen erlauben und den Nährstofftransport fördern. Die Anforderungen an Trägermaterialien sind äußerst vielfältig und von der spezifischen Anwendung abhängig 25 26 . Grundsätzlich werden künstliche von natürlichen Biomaterialien unterschieden 27 28 29 . In den letzten Jahren wurden biologische Trägermaterialien auf Basis dezellularisierter Gewebe, auch Bioscaffolds genannt, sehr erfolgreich weiterentwickelt und sowohl präklinisch als auch klinisch eingesetzt 30 . Der entscheidende Vorteil dezellularisierter Gewebe ist, dass sie einerseits den natürlichen, komplexen Aufbau der extrazellulären Matrix der Ursprungsgewebe behalten und somit eine exzellente Basis für die in-vivo Besiedelung mit ortsständigen differenzierten und Vorläuferzellen darstellen, anderseits enthalten sie auch noch eine Vielzahl an Signalmolekülen, die eine funktionelle Geweberemodellierung induzieren können 30 . Diese Materialien und ihre Modifikationen haben somit und aufgrund ihrer spezifischen Interaktion mit dem Immunsystem 31 32 (siehe auch 3.2.) das Potenzial die bisherigen Strategien der Geweberegeneration vollständig zu verändern.

3.1. Grundlagen und Dezellularisierung

Die extrazelluläre Matrix (ECM) besteht aus strukturellen und funktionellen Molekülen, die von den ortsständigen Zellen produziert und sezerniert werden 1 . Man weiß mittlerweile, dass die ECM nicht nur strukturelle Voraussetzungen schafft sondern auch eine Vielzahl biologischer Informationen enthält 33 und selbst aktiv für strukturelle und funktionelle Veränderungen der Zellen der ECM verantwortlich ist. Während der Entwicklung und während des Wachstums aber auch als Antwort auf Gewebeverletzungen werden diese Prozesse aktiviert 30 . Die ECM enthält unter anderem Kollagene, Glykoproteine, Glykosaminoglykane, Proteoglykane, Adhäsionsmoleküle, Wachstumsfaktoren, Chemokine und Zytokine 30 . Die essentielle Rolle dieser Proteine wird durch die Tatsache verdeutlicht, dass Mutationen, die die Funktion einzelner Proteine wie z. B. Laminin oder Kollagen inaktivieren häufig letal sind 34 . Die Proteine der ECM als wichtiger Teil des sog. Mikromilieus („microenvironment“) sind in der Lage die Differenzierung von Zellen, darunter insbesondere auch Stammzellen zu beeinflussen 35 . In diesem Zusammenhang wird auch von Stammzellnische gesprochen 35 . Darüber hinaus beeinflusst dieses Mikromilieu aber auch das Immunsystem und hier die Aktivität und Funktion von Makrophagen wie erst kürzlich gezeigt werden konnte 31 . Somit können auf Basis dieser Erkenntnisse neue Biomaterial-basierte Therapien entwickelt werden, die pro-regenerative Immunantworten und somit die gewünschte Geweberegeneration induzieren können 31 .

Durch verschiedene chemische, physikalische und enzymatische Methoden können aus Geweben und Organen die ortsständigen Zellen entfernt werden, ein Prozess der Dezellularisierung genannt wird 30 . Es ist heute möglich fast alle Gewebe und Organe zu dezellularisieren und somit gewebespezifische Trägermaterialien herzustellen 36 . Badylak prägte 2011 den Begriff (re-)konstruktive Gewebemodellierung als Entstehung funktionellen lokalisationsspezifischen Gewebes unter Zuhilfenahme dezellularisierter Materialien 37 .

3.2. Rolle von Makrophagen

Die Rolle von Makrophagen als wesentliche zelluläre Komponente regenerativer Mechanismen wurde in den letzten Jahren unter anderem bei der Gliedmaßenregeneration des Axolotl aufgedeckt 4 . Auch bei der Regeneration der Schwanzflosse im Zebrafisch spielen Makrophagen eine wichtige Rolle 38 . Die Rolle der Makrophagen im Rahmen der menschlichen Wundheilung ist seit langem bekannt. Makrophagen migrieren zur Stelle der Verletzung, reinigen die Wunde durch Phagocytose und initiieren die Vernarbung.

Dennoch wird die Rolle von Makrophagen auch zunehmend im Rahmen der Integration von Biomaterialien aus dezellularisierten Geweben analysiert und als wesentlich für die Regenerative Medizin angesehen 39 . Insbesondere werden seit einiger Zeit die positiven Aspekte der Makrophagenaktivierung erkannt, wobei die Verschiebung des pro-inflammatorischen M1-Phänotyps hin zum anti-inflammatorischen oder remodellierenden M2-Phänotyp einen wesentlichen Aspekt bei der funktionellen Geweberegeneration im Gegensatz zur Narbenbildung darstellt 39 . Diese Erkenntnisse dienen der Herstellung von Biomaterialien, die anstelle einer langdauernden Entzündung einen regenerierenden Phänotyp induzieren können. Insofern sind sie wesentlich für die weitere Entwicklung und Modifikation von Biomaterialien, die insbesondere für die Regeneration von Stützgeweben wie Sehnen, Knochen oder Knorpel essentiell sind.

4.1. Überblick

Regenerative Verfahren werden zunehmend im Rahmen klinischer Studien eingesetzt, jedoch sind sie bisher lediglich selten in der klinischen Routine zu finden 40 .

Die Herstellung von Knorpelgewebe mithilfe von Tissue Engineering Verfahren ist einer der am weitesten entwickelten Bereiche der Regenerativen Medizin. In der Orthopädie findet die autologe Chondrozytenimplantation (ACI) und die matrixbasierte autologe Chondrozytenimplantation (MACI) bereits Anwendung in der klinischen Routine. Das erstmals 1994 von Brittberg et al. im New England Journal of Medicine publizierte Verfahren hat sich in den letzten 20 Jahren zu einer eindeutigen klinischen Option entwickelt 41 42 43 44 . Es wird als Alternative insbesondere bei jüngeren Patienten mit traumatischen Defekten angesehen. Da die Verwendung von Chondrozyten aus dem Gelenkbereich ein erheblicher Nachteil ist, der sekundäre Probleme im Bereich der Hebestelle hervorrufen kann stehen gegenwärtig nasale Chondrozyten im Fokus des Interesses 45 . Nasale Chondrozyten entstammen der Neuralleiste 46 . Es konnte in verschiedenen Untersuchungen gezeigt werden, dass nasale Chondrozyten auch an anderer Lokalisation wie z. B. dem Kniegelenk in der Lage sind ihre Wirkung, d. h. insbesondere die Synthese extrazellulärer Knorpelmatrix zu entfalten und somit als mögliche Zellquelle für die Transplantation geeignet sind 46 47 . Es wurde bereits eine klinische Phase I Studie 45 durchgeführt, die diese Erkenntnisse auch in der Klinik bestätigt. Aktuell wird eine größere Phase I/II Studie in Basel durchgeführt, die diese Ergebnisse an einem größeren Patientenkollektiv bestätigen soll und die Effektivität der Therapie belegen soll. Nasale Chondrozyten wurden auch für die Rekonstruktion des Flügelknorpels in einer klinischen Phase I Studie eingesetzt 48 . In dieser Untersuchung wurden nasale Septumchondrozyten auf einem Kollagenvlies aus Typ I Kollagen präkultiviert und dann für die Rekonstruktion des Nasenflügels als Flügelknorpeltransplantat in Verbindung mit einem Stirnlappen eingesetzt. Da für die Durchtrennung des Stirnlappens sowie die Verfeinerung und Optimierung des Erscheinungsbildes in jedem Fall ein zweiter und meist auch ein dritter Eingriff erforderlich ist konnte dieser genutzt werden um Gewebe aus dem rekonstruierten Areal zu gewinnen und zu analysieren und hierdurch eine Geweberegeneration auch histologisch nachgewiesen werden.

4.2. Wieso sind bisher so wenige regenerative Therapien in der klinischen Routine einsetzbar?

Ein Vergleich der wissenschaftlichen Publikationen mit unserer klinischen Praxis zeigt klar, dass eine Vielzahl experimenteller und präklinischer Studien zu den unterschiedlichsten Themen publiziert werden die jedoch nicht in der klinischen Praxis anwendbar sind. Eine signifikante Anzahl von Übersichtsarbeiten beschäftigt sich mit der Frage, weshalb die Kommerzialisierung dieser Therapien so schwierig ist 40 49 50 . Im Allgemeinen sind die Hürden sowohl im präklinischen, als auch im klinischen, im kommerziellen und regulatorischen Sektor zu suchen 50 . Aus präklinischen Daten kann häufig nur unzureichend auf den Menschen geschlossen werden 50 . Studiendesign, ethische und Sicherheitsbedenken stehen in der Klinik im Vordergrund 51 52 , während die Kommerzialisierung durch steigende Kosten und ein hohes Produktentwicklungsrisiko behindert wird 53 . Ständig wachsende Anforderung an Sicherheit und Effizienz einer Therapie sowie unterschiedliche Regularien in unterschiedlichen Ländern sind wesentliche Probleme im regulatorischen Sektor 54 . Wichtige weitere spezifische Faktoren, die identifiziert wurden beinhalten die unzureichende Förderung von präklinischen und klinischen Studien, das häufig bei Grundlagen- und auch bei klinischen Wissenschaftlern nicht ausreichende Wissen über regulatorische Aspekte, die bei der Durchführung von Studien zur Kommerzialisierung beachtet werden müssen, die fragliche Kostenerstattung neuer Therapien, und die Produktions- und Upscaling Aspekte die für die Kommerzialisierung essentiell sind 40 49 . Ein entscheidender Erfolgsfaktor ist somit für alle Akteure sich diese Hindernisse bewusst zu machen und sie spezifisch bereits in sehr frühen Forschungs- und Entwicklungsphasen zu adressieren. Dies ist nur durch die enge interdisziplinäre Arbeit und Kooperation mit der Industrie und den regulatorischen Behörden möglich.

Neben den oben genannten Faktoren wird heute ein Umdenken für die gesamte Regenerative Medizin gefordert 55 . Bei vielen experimentellen Untersuchungen wurde die grundlegende vaskuläre, nervale und lymphatische Versorgung nicht oder kaum in die Untersuchungen mit einbezogen, auch das lokale Mikromilieu wurde häufig nicht ausreichend bedacht 55 . Darüber hinaus sind die immunologischen Faktoren häufig durch die Verwendung immuninkompetenter Tiere umgangen worden, die aber für die klinische Anwendung unumgänglich und von entscheidender Bedeutung sind. Es ist somit zukünftig wesentlich die Regenerative Medizin noch interdisziplinärer auszulegen, als das bisher vielfach der Fall war. Entwicklungsbiologisches und immunologisches Wissen, etwa um die Rolle von Makrophagen bei der Gliedmaßenregeneration im Salamander 2 4 sind hier nur als Beispiele zu nennen. Die enge Kooperation mit Entwicklungsbiologie und Immunologie wird für die Regenerative Medizin zukünftig unabdingbar und für ihr Überleben wesentlich sein.

5. Regenerative Verfahren in der Hals-Nasen-Ohrenheilkunde – aktueller Stand

Im Folgenden soll der Schwerpunkt auf die Bereiche gelegt werden, in denen tatsächlich schon klinische Anwendungen der regenerativen Therapien publiziert wurden oder die präklinischen Versuche sich weit an die Klinik annähern. Zudem soll auf die oben näher dargestellten Verfahren des 3D-Bioprintings und der dezellularisierten Trägermaterialien eingegangen werden sofern diese für die jeweiligen Bereiche relevant sind. Eine Übersicht über klinische Studien der genannten klinischen Anwendungen findet sich in Tab. 1 .

Tab. 1 Verschiedene Entwicklungsstadien der Regenerativen Medizin im Kopf-Hals-Bereich.

	Fallberichte und Fallserien	Phase I	Phase II/III	Kommerzielles Produkt	Routine
Knorpel- Nase	Nasenrückenaugmentation (n=8; n=32) Yanaga, Japan 57 58 Spreader Graft (?) (n=1) Ceccarelli, Italien 60	Nasenflügelknorpelrekonstruktion (n=5) Fulco, Schweiz 48	–	–	–
Knorpel - Ohrmuschel	Partielle und totale Ohrmuschelrekonstruktion (n=12) Yanaga, Japan 66 67	–	–	–	–
Nervus facialis	N. facialis; Läsion bis 3 cm Länge Navissano, Italien (n=7) – NeuroTube 75 N. facialis Gunn, USA (n=1) – Avance 79 N. facialis – Stirnast Inada, Japan (n=2) – PGA-Kollagen-Röhre, kein kommerzielles Produkt 77 Chorda tympani Yamanaka, Japan (n=3) – PGA-Kollagen-Röhre, kein kommerzielles Produkt 78	–	–	z. B. PGA: NeuroTube ® Kollagen I: NeuraGen ® NeuroMatrix ® NeuroFlex ® NeuraWrap ® NeuroMend ® Dezell. humanes Allograft Avance ®	–
Stimmlippen	–	-–	–	–	–
Larynx	–	–	–	–	–
Trachea	12-jähriges Kind, Heilversuch,Hamilton, UK 101 102	–	–	–	–
Trommelfell	Gelatine + b-FGF, (n=53) Kanemaru, Japan 104	Gelatine + b-FGF, (n=11) Kanemaru, Japan 106	Gelatine + b-FGF; laufend nach 106	Alloderm ® Tutopatch ® Audiomesh ® Surgisis ®	–
Mastoid	Kanemaru, Japan (n=10) 115 Kanemaru, Japan (n=26) 117	–	–	–	–
Speicheldrüsen	PRP + ADSC+ SVF intraglandulär Comella, Italien (n=1) 138	Phase I/II Studienprotokoll Mesenchymale Stammzellen (n=30), Gronhoj, Dänemark 139	–	–	–

5.1.1. Nase

Defekte im Bereich der Nase können kogenitaler, traumatischer und iatrogener Natur sein. In der Rhinologie und plastisch-rekonstruktiven Chirurgie des Kopf-Hals-Bereichs wurden bereits eine Reihe klinischer Studien, die regenerative Verfahren zur Wiederherstellung von Knorpelgewebe der Nase verwenden durchgeführt und publiziert. Diese beginnen bei der Verwendung autologer Chondrozyten für die Nasenrückenaugmentation 56 , die Yanaga et al. erstmals 2004 publizierten. Im Rahmen dieser Publikation wurden acht Patienten beschrieben, bei denen autologe Chondrozyten aus dem Knorpel des Cavum conchae isoliert und amplifiziert wurden sowie anschließend als gelartige Suspension in den Nasenrücken injiziert bzw. einmal als Kinnaugmentation verwendet wurden. Die Bewertung der Ergebnisse erfolgte im Wesentlichen makroskopisch, bzw. einmal auch unter Zuhilfenahme der Magnetresonanztomografie. In einer weiteren Studie aus dem Jahr 2006 57 wurden weitere Ergebnisse dieser Methode publiziert. Bei 32 Patienten wurde erneut die Suspension aus amplifizierten aurikulären Chondrozyten für die Augmentation der Nase und für weitere Lokalisationen verwendet. Auch hier wurden die Ergebnisse v. a. makroskopisch bewertet. Bei 8 Patienten wurde eine Biopsie aus dem transplantierten Gewebe gewonnen, die Anhalt für die Anwesenheit von Knorpelgewebe ergab. Die wesentlichen Limitationen dieser Studien sind zum einen das unzureichende Studiendesign ohne Kontrollgruppe oder standardisierte Auswertung, zum anderen die fehlende Beschreibung der Zellkulturtechniken, die eine Wiederholung dieser Untersuchungen unmöglich machen. Somit ist es schlicht unmöglich weitergehende Schlussfolgerungen aus diesen Untersuchungen zu ziehen, auch wenn 2013 in einer weiteren Studie der Gruppe von Yanaga 58 die Technik in einer modifizierten Weise erneut bei 18 Patienten angewandt wurde. Diesmal wurde eine leichte Veränderung der Zellkulturmethoden vorgenommen und das Gewebe zunächst in die Bauchwand transplantiert. Nach etwa 6 Monaten wurde das nun von Fettgewebe umgebene transplantierte Gewebe für die Augmentation des Nasenrückens und des Kinns in speziellen Fällen mit besonders dünner Haut verwendet. Es finden sich jedoch bis heute keine Publikationen anderer Autoren, die diese Technik verwendet hätten. Yanaga und Mitarbeiter verwendeten diese Technik jedoch in weiteren Publikationen unter anderem auch zur Herstellung von Ohrknorpel für die Behandlung der Mikrotie (siehe 5.1.2.). 2017 wurde ein Fallbericht von Ceccarelli et al. publiziert 59 , die eine Mikrografting-Technik, die für die Versorgung chronischer Wunden patentiert wurde „Rigenera ® “ 60 im Rahmen einer offenen Septorhinoplastik, die den Einsatz von Spreadergrafts erforderte, einsetzten. Leider bleiben auch bei dieser Publikation Methodik und Rationale völlig unklar.

Einen wesentlichen Fortschritt und insofern eine bahnbrechende Neuerung stellt die Publikation von Fulco et al. aus dem Jahr 2014 48 im Lancet dar. Ziel dieser Phase I Studie waren die Sicherheit und Machbarkeit der Methode zu untersuchen. In dieser Studie wurde der Flügelknorpel bei 5 Patienten nach Tumorresektionen mit in-vitro hergestelltem Knorpelgewebe rekonstruiert. Zusätzlich wurde ein Stirnlappen oder ein Nasolabiallappen für die Rekonstruktion der äußeren Haut verwendet. Das Knorpelgewebe wurde dabei aus Nasenseptumknorpel gewonnen, Chondrozyten isoliert und in-vitro vermehrt und dann auf ein Kollagen I Trägervlies (Chondro-Gide, Geistlich Pharma, Wullhusen, Schweiz) aufgebracht. Dieses Trägermaterial wurde bereits für die Verwendung im Gelenkbereich erprobt und zugelassen. Parallel wurden jeweils 2 Scaffolds kultiviert, und ein Scaffold für die Transplantation, das zweite für die Analyse der in-vitro Chondrogenese verwendet, sodass eine Überprüfung der in-vitro Chondrogenese vorgenommen werden konnte. Sechs Monate nach der Rekonstruktion wurde jeweils eine Verfeinerung der Rekonstruktion vorgenommen und dabei auch Gewebe für die Histologie aus dem transplantierten Areal gewonnen. Die Studie wies die Sicherheit und Machbarkeit der Methode nach, zudem ergaben sich erste Hinweise, dass in-vitro hergestelltes Knorpelgewebe noch vor Ort zu finden war, wenn auch in sehr variablem Ausmaß. Die sekundären Outcome-Parameter Patientenzufriedenheit und Stabilität des Flügelknorpels, die anhand des Nasendurchflusses bestimmt wurde gaben ebenfalls Anhalt zur Annahme, dass diese Technik eine Alternative zur klassischen Transplantation von Septum- oder Ohrknorpel für die Rekonstruktion des lateralen Flügelknorpels darstellt. Eine kontrollierte Studie, die diese Ergebnisse verifiziert und verfeinert steht gegenwärtig noch aus.

5.1.2. Ohrmuschel

Defekte der Ohrmuschel treten sowohl kongenital als auch nach Trauma und Tumorresektionen auf. Trotz einer Vielzahl von in-vitro und tierexperimenteller Studien, die belegen, dass es möglich ist Knorpel in der Form einer menschlichen Ohrmuschel herzustellen 61 62 63 64 65 existieren gegenwärtig keine qualitativ hochwertigen Studien, die diese Technik in der Klinik anwenden. Lediglich Yanaga et al. verwendeten die bereits oben (5.1.1.) beschriebene Technik, die auch für die Nasenaugmentation verwendet wurde in modifizierter Weise auch für die Rekonstruktion der Ohrmuschel 66 67 . Die Autoren isolierten Chondrozyten aus den mikrotischen Ohrmuscheln von 4 Patienten und verwendeten diese Zellen zur Herstellung eines Knorpelblocks, der nach subkutaner Injektion der Zellen im Bereich des Abdomens nach 6 Monaten entstand. Aus diesem Knorpelblock wurde dann ohne exakte Beschreibung der Technik ein Ohrmuschelgerüst 68 69 hergestellt und in das Ohrmuschelareal transplantiert. Nach Angaben der Autoren wurden bisher 12 Patienten behandelt und es kam nach bis zu 6 Jahren postoperativ nicht zu relevanten Resorptionen des so hergestellten Ohrmuschelgerüstes 67 .

Gerade für eine so komplexe 3-dimensionale Struktur wie die menschliche Ohrmuschel scheint das 3D-Bioprinting ideal zur Herstellung geeignet. Das Prinzip konnte in ersten Publikationen auch eindrucksvoll gezeigt werden 23 . Ein wesentliches Problem ist jedoch neben der 3-dimensionalen Formgebung auch die umgebende Haut, die häufig ein Problem im Rahmen der klinischen Ohrmuschelrekonstruktion darstellt, da die zur Verfügung stehende Haut meist deutlich dicker ist als die Haut der Ohrmuschel. Ein wichtiges Ziel ist somit die Herstellung eines vaskularisierten Composite Grafts aus Knorpel, einer Verschiebeschicht und Haut.

Auch die Dezellularisierung von Ohrknorpel könnte eine wegweisende Neuerung im Bereich der Ohrmuschelrekonstruktion darstellen. Utomo et al. haben dezellularisierten humanen Ohrknorpel bereits ausführlich charakterisiert 70 . Eigene unveröffentlichte Untersuchungen zeigten jedoch eine unzureichende mechanische Stabilität dezellularisierter Ohrmuscheln nach der Implantation in Kaninchen.

5.1.3. Nervus facialis

Nervenschädigungen im Kopf-Hals-Bereich können traumatisch, tumorös oder auch iatrogener Natur sein, häufig ist der Nervus facialis betroffen. Die Therapie umfasst End-zu-End-Anastomosen bei geringer Defektstrecke, während bei längeren Defekten, die nicht spannungsfrei adaptiert werden können, die Verwendung autologer Nerventransplantate heute den Goldstandard darstellt 71 . Die Hebung von autologen Nerventransplantaten ist mit einer Hebemorbidität, wie sensiblen Defiziten verbunden, auch stehen nicht immer in Länge und Durchmesser passende Transplantate zur Verfügung 72 . Aus diesen Gründen werden auch für die Nervenrekonstruktion regenerative Verfahren als vielversprechende Alternativen angesehen 73 . In den letzten Jahren wurden eine Vielzahl neuer Techniken zur Überbrückung von Nervendefekten („Nervenschienen“) entwickelt. Einige von ihnen haben auch die Klinik erreicht, ohne sich jedoch bislang weiter in die klinische Routine zu verbreiten. Diese Verfahren verfolgen unter anderem das Prinzip eine geeignete Schiene für das Auswachsen der Axone bereitzustellen und gleichzeitig das Einwachsen von Fibroblasten aus der Umgebung zu verhindern 74 . Als Nervenschienen wurden auch z. B. autologe Venen erfolgreich verwendet, jedoch stehen auch diese nicht immer zur Verfügung. Somit sind synthetische Nervenschienen in den Fokus der Forschung gerückt. Resorbierbare Materialien sind vorteilhaft, da Sekundäreingriffe zur Entfernung der nicht-resorbierbaren Materialien vermieden werden können. Polyglykolsäure, die als Bestandteil von chirurgischem Nahtmaterial seit vielen Jahren in der Klinik verwendet wird, wurde als erste resorbierbare Nervenschiene zugelassen (NeuroTube, Synovis, Birmingham). Unter anderem Navissano et al. 75 berichteten über die erfolgreiche klinische Verwendung von NeuroTube bei Läsionen des Nervus facialis bis 3cm. Als negativ werden der Preis, die möglicherweise zu rasche Resorptionsrate und die Gefahr toxischer Abbauprodukte angesehen 73 . Auch Schienen aus Kollagen I wurden in vielen präklinischen Untersuchungen und auch in klinischen Studien verwendet und werden für Defekte bis zu einer Länge von etwa 1,5–2cm als autologen Nerventransplantaten ebenbürtig angesehen 73 . Derzeit stehen 5 Kollagen Nervenschienen (NeuraGen, NeuroMatrix, NeuroFlex, NeuraWrap, and NeuroMend) für die klinische Anwendung zur Verfügung. Dennoch hat auch ihre Verwendung noch keinen festen Platz im klinischen Alltag, da sie sich zwar bei kurzen Defekten als ebenbürtig zum Nerventransplantat erwiesen haben, dies jedoch insbesondere bei längeren Defekten (größer als 1,5 cm) noch unklar ist, da die veröffentlichten Studien keine einheitlichen Ergebnisse lieferten 76 . 2007 verwendeten Inada et al. zur Rekonstruktion des Stirnastes des Nervus facialis bei 2 Patienten eine Nervenschiene aus PGA und Kollagen I 77 . Es findet sich auch eine kleine Fallserie (n=3) von Yamanaka et al., die die Chorda tympani mit einer ähnlichen Nervenschiene aus PGA und Kollagen I erfolgreich rekonstruierten 78 . Beide Präparate sind nicht kommerziell erhältlich oder in Deutschland zugelassen. Gunn et al. beschrieben in einem Fallbericht die Rekonstruktion des tympanalen und mastoidalen N. facialis mit einem dezellularisierten humanem Implantat „Avance“ 79 .

Dezellularisierte Nerventransplantate werden derzeit genauer in präklinischen Studien evaluiert, wobei erste Ergebnisse auf vergleichbare Ergebnisse mit autologen Nerventransplantaten hindeuten 80 81 . 3D-Bioprinting Techniken für die Nervenregeneration wurden aufgrund der hervorragenden Möglichkeit zur Herstellung von klar definierten Kanälen auch für diese Anwendung vorgeschlagen 82 .

5.2.1. Stimmlippen

Die Stimmlippen sind als schwingungsfähiger und komplex in mehreren Schichten aufgebauter Teil des Larynx für die Respiration und die Phonation verantwortlich. Mechanische Fehlbelastungen, Rauchen, Entzündungen, Bestrahlung oder Intubationen können beispielsweise die Funktion der Stimmlippen erheblich stören und zu einer deutlichen Einschränkung der Lebensqualität führen 83 . Die Stimmtherapie der verschiedenen Störungen ist nicht immer ausreichend, die chirurgische Therapie ist dagegen stets mit dem Risiko einer zusätzlichen Vernarbung und weiteren Verschlechterung der Stimme vergesellschaftet 84 . Somit ist auch die Behandlung von Funktionsstörungen und Defekten der Stimmlippen ein wichtiges Ziel regenerativer Therapiestrategien. Die Forschung konzentrierte sich bisher schwerpunktmäßig auf die Applikation von bioaktiven Faktoren, Biomaterialien und die Anwendung von Stammzellen 85 86 87 . Dabei sind die Anforderungen an geeignete Biomaterialien extrem komplex, da einerseits eine ausreichende mechanische Stabilität zur Platzierung im Larynx notwendig ist und andererseits die Schwingungsfähigkeit der Stimmlippe eine sehr große Flexibilität erfordert. Vielfach wurden Hydrogele zur Injektion in die Stimmlippen untersucht 88 . Hierbei spielen natürliche Materialien wie Kollagen und Elastin als Trägermaterial eine wesentliche Rolle sowie ihre Kombination mit Stammzellen oder patienteneigenen Stimmlippenfibroblasten 89 . Die Applikation von Stammzellen kann dabei durch Injektion oder durch Mobilisation endogener Stammzellen erfolgen 87 und wurde bereits vielfach in Tiermodellen, insbesondere jedoch bei akuten Schädigungen der Stimmlippen untersucht. Klinische Studien stehen in diesem Bereich noch aus.

3D-Bioprinting wurde ebenso wie die Verwendung von dezellularisierten Stimmlippen nur im Rahmen des 3D-Bioprintings und der Dezellularisierung des gesamten Larynx beschrieben 90 91 .

5.2.2. Larynx

Die Herstellung eines artifiziellen Larynx ist aufgrund der Vielfalt der im Larynx vorhandenen Gewebe und der komplexen Funktion des Larynx für die Stimmbildung aber auch für den Schluckvorgang eine große Herausforderung. Andererseits ist derzeit die Wiederherstellung der laryngealen Funktionen nach partieller und totaler Laryngektomie nur partiell möglich und mit großen Einschränkungen für die betroffenen Patienten verbunden. Hamilton und Birchall gehen in einer aktuellen Übersicht davon aus, dass die Therapie des Larynxkarzinoms in den kommenden 10 Jahren durch die Entwicklungen im Bereich der Larynxregeneration entscheidend beeinflusst werden wird 92 . Die Larynxtransplantation ist eine derzeit v. a. theoretische Option, die aufgrund der notwendigen Immunsuppression nur in Ausnahmefällen und nicht für die Rekonstruktion nach Tumorchirurgie in Betracht kommt, aber auch bereits 2-mal in der Literatur beschrieben wurde 93 94 . Für die Herstellung eines artifiziellen Larynx ist die Herstellung so unterschiedlicher Gewebe wie des knorpeligen Gerüsts, der laryngealen Muskulatur und der laryngealen Schleimhaut in koordinierter Weise erforderlich. Diese Gewebe müssen gleichzeitig mit dem Gefäß- und Nervensystem des Empfängers verbunden werden um die Funktion des Larynx wiederherzustellen. Eine mögliche erfolgversprechende Alternative ist die Dezellularisierung eines allogenen Larynx als Trägergerüst, das mit verschiedenen Zellarten besiedelt werden könnte 91 . Ein großer Vorteil dieser Strategie ist, dass das komplexe laryngeale Gerüst und die vielfältigen extrazellulären Matrizes der verschiedenen Gewebe als Ausgangspunkt für die Besiedelung zur Verfügung stehen. Ein tierexperimenteller oder klinischer Einsatz dieser Strategie wurde bisher noch nicht publiziert. Eine weitere Option für die laryngeale Rekonstruktion ist die Verwendung von Bioprinting Strategien, deren allgemeine Prinzipien unter 2. ausführlich beschrieben wurden. Für den Larynx existiert hierzu noch keine Literatur, jedoch wurde ein individualisierter Trachealstent aus Polycaprolacton, der mithilfe von Bioprinting hergestellt bereits erfolgreich klinisch eingesetzt 95 . Die weitere Entwicklung in diesem Bereich könnte somit tatsächlich so rasant sein wie von Hamilton und Birchall dargestellt 92 .

5.2.3. Trachea

Grundsätzlich können Tumore, Trauma aber auch kongenitale Läsionen dazu führen, dass erhebliche Teile der Trachea wiederhergestellt werden müssen. Da eine Resektion und End-zu-End Anastomose nur bis zu einer Länge von etwa 5 cm bei Erwachsenen möglich ist, stellt auch die Trachea somit ein wichtiges Ziel für regenerative Verfahren dar 96 97 .

Auch wenn die Trachea für einige Zeit als das erste Organ angesehen wurde, das mithilfe von Stammzellen in-vitro hergestellt werden konnte 98 hat sich die Trachealregeneration zum Albtraum der gesamten Regenerativen Medizin entwickelt, da ohne ausreichende präklinische Daten oder auch nur annähernd solide wissenschaftliche Basis Patienten operiert wurden 97 . Die publizierten Daten müssen heute als Wissenschaftsbetrug angesehen werden 99 100 . Es kann derzeit lediglich ein Fall einer erfolgreichen Anwendung einer dezellularisierten und in-vivo mit autologen Zellen besiedelten Trachea zitiert werden 101 . In diesem Fall wurde ein 12-jähriges Kind, das unter einer kongenitalen langstreckigen Trachealstenose litt mit einer dezellularisierten Trachea behandelt 102 . Das Kind hat nach dieser Behandlung bisher 4 Jahre überlebt, auch wenn multiple Revisionseingriffe erforderlich waren 101 .

Auch wenn die Dezellularisierung und auch das 3D-Printing für die Trachea vielversprechende Ansätze bieten sind insbesondere im Bereich der Trachealchirurgie zunächst umfangreiche und sorgfältige experimentelle und präklinische Daten vor weiteren klinischen Anwendungen unabdingbar.

5.3.1. Trommelfell

Trommelfelldefekte können im Rahmen der akuten und chronischen Otitis media, aber auch posttraumatisch oder iatrogen auftreten. Während akute Trommelfelldefekte eine sehr gute Spontanheilungsrate aufweisen, müssen chronische Defekte in der Regel chirurgisch behandelt werden. Obwohl die Behandlung von Trommelfelldefekten durch Knorpel-Perichondrium-Inseltransplantate, Perichondrium-Transplantate oder Muskelfaszien transplantate häufig mit geringer Hebemorbidität und gutem Erfolg möglich ist, ist dennoch ein chirurgischer Eingriff in Lokalanästhesie oder Vollnarkose erforderlich und gelingt nicht immer. Somit ist auch das Trommelfell Ziel der Forschung in der Regenerativen Medizin und es wird nach kosteneffektiven und nicht-chirurgischen Therapieoptionen gesucht 103 .

Kanemaru et al. berichteten bereits 2011 über den erfolgreichen klinischen Verschluss von Trommelfellperforationen im Rahmen von chronischen Otitiden in über 98% der behandelten Patienten 104 . In dieser Studie wurde das Trommelfell chirurgisch angefrischt und dann ein an den Defekt angepasster kleiner Block aus Gelatine mit oder ohne basic fibroblast growth factor (b-FGF) appliziert und anschließend mit Fibrinkleber fixiert. Nur der Zusatz von b-FGF ergab diese hohen Verschlussraten, während bei der Kontrollgruppe lediglich eine von 10 Perforationen verschlossen worden war. Von Jackler wurde diese Entwicklung als der möglicherweise größte Fortschritt in der Otologie seit dem Cochlea Implant bezeichnet 105 . Die Ergebnisse der ersten Studie von Kanemaru et al. wurden in einer Folgestudie 2017 bestätigt 106 . In dieser Studie wurden jedoch nur 11 Patienten behandelt und zunächst im Sinne einer Phase I Studie die Sicherheit dieser Therapie analysiert ohne dass dabei therapie-induzierte Nebenwirkungen festgestellt worden wären. Langzeitergebnisse wurden leider bisher nicht publiziert, weiterhin entspricht das Studiendesign insbesondere der Studie aus dem Jahr 2011 nicht den aktuellen Anforderungen an eine Phase I klinische Studie. Dennoch geben beide klinische Studien erste Hinweise darauf, dass eine regenerative Therapie auch für den Verschluss von Trommelfellperforationen sinnvoll sein könnte. Weiterhin wurde eine größere prospektive randomisierte klinische Studie initiiert, die nach Angaben der Autoren derzeit Patienten rekrutiert 106 . Die Technik der Applikation von Gelatine mit b-FGF wurde von den Autoren auch bereits für die Therapie von Gehörgangsdefekten bei 54 Patienten eingesetzt 107 . Leider bleiben auch hier die präklinische Rationale und das Studiendesign ungenau. In der präklinischen Forschung wird auch für die Regeneration des Trommelfells das 3D-Bioprinting verwendet 108 und konnte an Chinchillas für den Verschluss von Trommelfelldefekten verwendet werden. Auch dezellularisierte Gewebe wurden bereits für die Tympanoplastik in präklinischen Untersuchungen und auch einigen klinischen Studien analysiert 109 110 . Insbesondere AlloDerm (LifeCell Corp., USA), ein Produkt aus dezellularisierter menschlicher Haut hat sich als gleichwertig zur Temporalisfaszie im Hinblick auf die Verschlussraten gezeigt 109 110 bei gleichzeitig kürzerer OP-Zeit 111 . Jedoch ist AlloDerm gegenwärtig in Deutschland nicht für die Tympanoplastik erhältlich. In einer Übersicht von Kaftan werden weitere dezellularisierte Materialien ausführlich dargestellt 112 . Gegenwärtig werden derartige Materialien in Deutschland nicht in größerem Umfang für die Tympanoplastik verwendet. In eigenen Untersuchungen erwiesen sich die akustischen Eigenschaften von dezellularisiertem Knorpelgewebe als vergleichbar mit dem menschlichen Trommelfell oder mit dünnen Knorpeltransplantaten 113 . Jedoch steht das Material noch nicht für klinische Studien zur Verfügung.

5.3.2. Mastoid

Auch das Mastoid ist Ziel der Regenerativen Medizin in der Hals-Nasen-Ohrenheilkunde 114 115 . Belüftete Mastoidzellen spielen neben der Eustachischen Röhre eine wichtige Rolle für den Druckausgleich im Mittelohr 116 . Ihr Vorhandensein und ihre Funktion können das Entstehen von Cholesteatomen und anderen chronischen Mittelohrerkrankungen verhindern 115 . In einer klinischen Studie wurde 3-dimensionales Hydroxyapatit (3D-HA) bei 10 Patienten zur Rekonstruktion der Mastoidzellen verwendet. Nach 12 Monaten wurden im Rahmen von Second Look Operationen in bis zu 60% wieder epithelisierte Mastoidzellen gefunden 115 . Die Autoren postulieren, dass so auch Fälle sonst nicht optimal behandelbarer chronischer Otitiden behandelt werden könnten. In einer weiteren Studie publizieren Kanemaru et al. 2013 eine positive Wirkung dieser Therapie auch auf die Funktion der Eustachischen Röhre 117 . Bei 26 Patienten wurden neben einer konventionellen Cholesteatom-Sanierung und Tympanoplastik erneut 3D-HA zur Regeneration von Mastoidzellen verwendet. Bei den so behandelten Patienten ließ sich intraoperativ in etwa 70% der Fälle eine verbesserte Tubenfunktion im Vergleich zum Zeitpunkt vor der Operation nachweisen, während dies nur bei etwa 13% der konventionell behandelten Patienten der Fall war. Darüber hinaus existieren einige weitere präklinische Studien, die andere Materialien wie Poly-DL-Lactid-Poly-Glycolsäure/Polyethylenglycol (PLGA/PEG) 118 oder Polycaprolacton/β-Tricalciumphosphat (PCL/β-TCP) 119 für die Rekonstruktion der Mastoidzellen verwenden. 3D-Bioprinting oder dezellularisierte Gewebe wurden bislang nicht für die Mastoidrekonstruktion verwendet.

Zum Thema Regeneration und Erhalt von Haarzellen werden aktuell eine erhebliche Anzahl experimenteller Untersuchungen durchgeführt. Es sind kürzlich wegweisende Untersuchungen zur Innenohrregeneration publiziert worden 120 121 die zeigen, dass die Regeneration von menschlichen Haarzellen für die Therapie möglich sein könnte. Da ein weiteres Referat zu neuen Therapieformen im Bereich des Innenohrs in diesem Band erscheint wird an dieser Stelle nicht weiter auf die Thematik eingegangen, sondern auf den Artikel „Molekulares Verstehen des Hörens – Was ändert sich für den Patienten?“ von T. Moser und die o. a. Literaturangaben 120 121 verwiesen.

5.4. Speicheldrüsen

Die Xerostomie nach Radiatio oder Radiojodtherapie stellt eine erhebliche Nebenwirkung dieser Therapien dar und verschlechtert die Lebensqualität der Patienten mit Kopf-Hals-Tumoren ganz enorm. Bis heute existiert keine kausale Therapie der Xerostomie, auch stark verbesserte Bestrahlungsverfahren wie die intensitätsmodulierte Bestrahlung (IMRT) 122 123 oder die präventive Gabe von Amifostin 124 sind nicht in der Lage die Xerostomie gänzlich zu vermeiden. Neuartige Bestrahlungsverfahren die versuchen die stammzellhaltigen Drüsenareale auszusparen 125 sind noch nicht in der klinischen Praxis verfügbar. Aus diesem Grunde ist auch das Speicheldrüsengewebe ein wichtiges Ziel regenerativer Therapieverfahren. Neben klassischen Tissue Engineering Ansätzen, die versucht haben Drüsengewebe in-vitro herzustellen stehen heute stammzellbasierte Verfahren im Vordergrund 126 . Ein wesentlicher Aspekt der Radiatio und Radiojodtherapie induzierten Schädigung stellt neben einer Fibrosierung der Verlust von Azinuszellen dar, so dass die Speichelsekretion nach diesen Therapien stark reduziert ist 127 128 129 . Man kann sich nun zu Nutze machen, dass die ursprüngliche Drüsenstruktur noch vorhanden ist und mithilfe von Stammzellen lediglich die Funktion der Speicheldrüsen wiederherstellen.

Es wurden bereits eine Vielzahl präklinischer Studien in unterschiedlichen Tiermodellen mit verschiedenen Zelltypen durchgeführt, die allesamt zeigten, dass Stammzellen nach Gewebeschaden, sei es durch chirurgisches Trauma oder durch Radiatio an den Ort der Schädigung migrieren 130 131 132 133 und dort den Gewebeschaden positiv beeinflussen können. Auch eine direkte positive Wirkung der Stammzellen konnte in mehreren Tiermodellen nachgewiesen werden. Die Arbeitsgruppe von Coppes in Groningen hat grundlegende Erklärungen für den Wirkmechanismus von aus Speicheldrüsen gewonnenen Stammzellen geliefert und auch überzeugend gezeigt, dass diese Zellen in der Lage sind die Speichelproduktion signifikant zu erhöhen 134 135 136 137 . Im Jahr 2017 wurden nun auch erstmals 2 Studien publiziert, die Stammzellen für die Regeneration des Strahlenschadens bei Patienten einsetzen 138 139 . Bei der einen Studie handelt es sich lediglich um einen Fallbericht. Die Autoren applizierten einen Mix aus platelet rich plasma (PRP), Fettgewebsstammzellen (ADSC) und die Stroma Gefäß Fraktion (SVF) aus autologem Lipoaspirat in die Glandulae parotideae und die Glandulae submandibulares auf beiden Seiten. Nach 31 Monaten wurden keine schweren Nebenwirkungen berichtet und der Patient wollte nach Angaben der Autoren weiter an der Behandlung teilnehmen. Wesentliche Erkenntnisse im Hinblick auf die Sicherheit oder Wirkung einer derartigen Therapie liefert diese Verwendung des Zellmixes an einem Patienten jedoch nicht 138 . Sinnvoll und notwendig ist die solide Planung einer Phase I Studie, wie dies Autoren aus Dänemark berichten: Sie veröffentlichten das Studienprotokoll einer placebo-kontrollierten, doppelblinden, randomisierten Phase I/II Studie die adulte mesenchymale Stammzellen für die Regeneration des Strahlenschadens bei 30 Patienten nach Radiatio einsetzt (EudraCT, Identifier: 2014-004349-29; ClinicalTrials.gov, Identifier: NCT02513238) 139 . Die klinischen Ergebnisse der Studie stehen derzeit noch aus. Es ist damit zu rechnen, dass auch glanduläre Stammzellen in der nahen Zukunft in ersten Phase I oder Phase I/II Studien eingesetzt werden, sodass die Speicheldrüsenregeneration einer der wenigen Bereiche ist, in dem die Erkenntnisse präklinischer Untersuchungen tatsächlich zu klinischen Studien, wenn auch noch nicht in die klinische Routine gefunden haben.

Aufgrund der aktuellen Entwicklungen im Bereich des 3D-Bioprinting könnten zukünftig auch die Zell- und biomaterialbasierten Tissue Engineering Strategien im Bereich der Speicheldrüsenregeneration wieder neuen Aufschwung erlangen, da sie die Herstellung komplexer 3-dimensionaler Strukturen wie der Speicheldrüsen ermöglichen können 140 .

Fazit

Während bspw. in der Orthopädie regenerative Therapien in klinischen Studien aber auch in der klinischen Routine eingesetzt werden sind in der Hals-Nasen-Ohrenheilkunde trotz einer Vielzahl potentieller Anwendung und einer ebenso großen Vielfalt präklinischer Studien bisher nur wenige Ansätze in klinische Phase I Studien gelangt. Hierzu zählen bisher die Verwendung tissue engineerten Knorpelgewebes für die Rekonstruktion der Nase sowie die Verwendung von Stammzellen für die Speicheldrüsenregeneration nach Radiatio.

Wesentliche Hürden der klinischen Translation und der anschließenden Verbreitung in den klinischen Alltag sind die hohen Kosten die mit derartigen individualisierten regenerativen Therapien verbunden sind. Auch die regulatorischen Voraussetzungen können bisher vielfach noch nicht ausreichend für die klinische Anwendung erfüllt werden. Trotz aller Hindernisse wird die Regenerative Medizin als neue Technologie alle Bereiche der Medizin, so auch die Hals-Nasen-Ohrenheilkunde in den nächsten Jahren und Jahrzehnten entscheidend verändern. Unabdingbar hierfür ist es die nicht erfolgreichen Strategien zu verlassen und neue gemeinsame Erkenntnisse aus der Zell- und Entwicklungsbiologie mit den Fortschritten der Immunologie und den neuen Technologien wie dem Bioprinting zu verbinden 55 .