[Mechanisms of recombinant adenovirus-mediated SD-HA fusion protein proliferation inhibition and induced apoptosis of K562 cells].

Objective: To investigate whether fusion protein SD-HA could regulate its downstream signaling molecule activity by competing with the phospho-BCR-ABL Y177 site, and its mechanisms to inhibit proliferation and induce apoptosis of K562 cells.
Methods: Co-immunoprecipitation interaction technology analysis of fusion protein SD-HA functioned by potently binding to the phospho-BCR-ABL Y177 site, Ras, MAPK and Akt activities were observed in the Ad5F35-SD-HA-treated cells. Western blot analyses of SD-HA fusion protein on cell membrane receptor pathway to death cascade caspase-8, caspase-3 and PRAP were performed.
Results: Exploration into the underlying mechanisms revealed that Ad5F35-SD-HA infection functioned by binding to the phospho-BCR-ABL Y177 site, which lead to a complex with Grb2. competitively disrupted the Grb2 SH2-phospho-BCR-ABL Y177 formation. The fusion protein SD-HA could reduce the activation of Ras and phosphorylation of MAPK (p-MAPK) and the expression level of p-ELK, inhibition of Ras-MAPK signaling pathway; SD-HA fusion protein could reduce p-Akt and Akt substrate p-GSK with inhibition of PI3K-Akt signaling pathway, thereby inhibiting the proliferation of K562 cells. Caspases-8-induced apoptosis signal could be activated by DED protein binding to DED domain of precursor caspases-8. Conclusions: The strategy of fusion protein SD-HA inhibiting-Y177 BCR-ABL and Grb2 binding could be used as a novel entry point for the treatment of chronic myeloid leukemia.

在前期研究中，我们通过基因重组技术，利用新型腺病毒载体Ad5F35具有高转染效率等优势[1]–[2]，将接头蛋白生长受体结合蛋白2（growth receptor bound protein 2，Grb2）的Src同源结构域2（Src homology 2，SH2）与Fas相关死亡结构域蛋白（Fas-associated protein with death domain，FADD）的死亡效应结构域（death effector domain，DED）融合表达（携带HA标签的SD-HA融合蛋白），实验结果显示腺病毒介导的融合蛋白SD-HA可在BCR-ABL阳性慢性髓性白血病（CML）细胞中显示特异性抑制增殖和诱导凋亡的双重效应[3]–[4]。本研究拟通过双向免疫共沉淀分析外源性SD-HA融合蛋白是否可以与内源性BCR-ABL的第177位酪氨酸磷酸化位点（Y177p）结合，形成异源二聚体，且通过Western blot和免疫共沉淀检测BCR-ABL蛋白及下游信号通路分子有丝分裂原激活的蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）、RAS和Akt活性的变化，分析腺病毒介导的融合蛋白SD-HA对细胞膜死亡受体途径的激活，即caspase级联反应蛋白caspase-8、caspase-3及多聚ADP-核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase，PARP）的蛋白表达及活化情况，旨在进一步探讨腺病毒介导的治疗肽融合蛋白SD-HA抑制CML细胞恶性表型的具体分子机制。

材料与方法

1．实验材料及仪器：Ad5F35骨架质粒由瑞典Fan教授惠赠[2]，穿梭质粒pAdTrack-CMV由美国He教授惠赠。Lipofectamine 2000为美国Invitrogen公司产品；鼠抗HA单克隆抗体、兔抗人β-actin抗体、羊抗兔IgG抗体和HRP耦联的羊抗鼠IgG二抗购自美国Santa Cruz公司。荧光倒置显微镜Te2000-U购自日本Nikon公司，凝胶成像系统Gel Doc 1000、蛋白电泳槽和半干转膜仪购自美国Bio-Rad公司。

2．SD-HA及其突变对照SmD-HA的构建和鉴定：按照人Grb2基因的cDNA全长序列（GenBank登录号：NP_002077）、DED基因的cDNA全长序列（GenBank登录号：NM_003824），用primer5.0软件辅助设计扩增人SH2及DED域基因CDS全长序列的PCR引物并经Blast软件比对后公司合成，实验用引物序列见表1。引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成、纯化。

表1

引物序列及产物大小

引物名称	正义引物P1（5′→3′）	反义引物P2（5′→3′）	产物大小（bp）
SH2	CGGGGTACCGCCACCATGTGGTTTTTTGGCAAAATCCCCAG	ACGCGATATCTTCTATGTCCCGCAGGAATATCTG	294
DED-HA	CGGGGTACCGCCACCATGCCGTTCCTGGTGCTGCTGCAC	CCCAAGCTTCTAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTActcGTCGTCGACGCGCCGCAGCAGGT	306
拼接Linker	SH2-Linker-P2:ACCACCACCAGAACCACCACCACCTTCTATGTCCCGCAGGAATATCTG	DED-Linker-P1:GGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTCCGTTCCTGGTGCTGCTGCAC	308
Sm- R86K-L	CTCTCACTCTCTTTGATAAGAAAG	CTTTCTTATCAAAGAGAGTGAGAG	308

PCR扩增SH2、DED片段，SH2循环参数：94 °C预变性5 min，98 °C 10 s，54 °C 10 s，72 °C 30 s，共30个循环，72 °C延伸10 min，−20 °C保存备用。DED用质粒pGFP-FADD为模板扩增（Andrew Thorburn教授[5]赠送），DED循环参数：94 °C预变性5 min，98 °C 10 s，55 °C 10 s，72 °C 30 s，共30个循环，72 °C延伸10 min，−20 °C保存备用。

拼接PCR重组SD-HA及其突变对照SmD-HA。分别用引物扩增SH2、DED后胶回收，然后将两个片段等摩尔混合，加入Taq、dNTP，退火延长5个循环，然后加入扩增SH2、DED的引物（SH2的P1/DED的P2），进行常规PCR扩增30个循环。SH2-DED的突变体SmD（R86K）的构建同样采用拼接PCR技术，设计突变位点的拼接引物。将与BCR-ABL Y177结合很重要的Grb2第86位的精氨酸（R）突变成赖氨酸（K）。引物及PCR产物测序均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

3．细胞培养及实验分组：表达BCR-ABL的K562细胞株用含100 U/ml青霉素、100 µg/ml链霉素和10%胎牛血清的RPMI l640培养液常规培养于5%CO2、37 °C恒温培养箱，常规换液传代，后续实验研究取对数生长期的细胞进行。实验分为4组：融合蛋白SD-HA组、突变对照SmD-HA组、空载体对照组和磷酸盐缓冲液（PBS）处理对照组。

4．重组腺病毒对K562细胞转染效率观察：感染24、48 h后，各组病毒与Polybrene（终浓度为4 µg/ml）混合后感染K562细胞，荧光显微镜观察细胞的荧光数，筛选感染条件，通过预实验观察不同病毒滴度对细胞的转染效率，病毒感染复数（MOI）为每个细胞感染的病毒颗粒数，我们选择MOI为104来感染细胞。采用流式细胞术检测荧光蛋白表达，以未转染病毒K562细胞为对照，确定48、96 h转染效率，实验数据用流式细胞仪软件Multicycle for windows分析。

5．免疫共沉淀分析融合蛋白SD-HA与p-BCR-ABL（Tyr 177）蛋白质的相互作用：腺病毒Ad5F35-SD-HA感染K562细胞96 h后，收集各实验组细胞，PBS洗涤，采用试剂盒蛋白提取试剂裂解细胞，按ProFound™ Mammalian HA-Tag IP/Co-IP试剂盒说明，具体步骤如下：抗HA预包被的琼脂糖珠与各实验组的全细胞裂解液4 °C免疫共沉淀反应4 h后，琼脂糖珠结合的沉淀物用2×非还原性样本缓冲液洗脱，用120 g/L的SDS-PAGE分离，转膜至PVDF膜，用抗磷酸化Bcr（p-Bcr）Tyr 177抗体或抗HA抗体作为一抗，辣根过氧化物酶藕联的羊抗鼠或羊抗兔IgG分别为二抗。用ECL化学发光底物进行显色，化学发光成像仪中显像，Bio-Rad凝胶成像系统分析成像结果。注意实验全程加磷酸酶抑制剂。

6．Western blot法检测BCR-ABL下游信号分子的酪氨酸磷酸化水平：提取各实验组全细胞蛋白，检测BCR-ABL下游信号分子MAPK、Akt蛋白及其磷酸化蛋白p-MAPK、p-Akt的表达变化情况，采用常规Western blot法检测，实验全程需加磷酸酶抑制剂。Bio-Rad凝胶成像系统对各蛋白条带的吸光度（A）值进行检测，以肌动蛋白（Actin）为内参照蛋白，对各实验组目的条带表达进行标准化，实验设PBS处理组表达水平为1，以反映各处理组蛋白的抑制率。蛋白抑制率（%）=[1−（A实验组/AActin）/（APBS处理组/AActin）]×100%。

7．BCR-ABL下游信号分子Ras、MAPK及Akt激酶活性分析：参照Ras活性检测试剂盒（美国Pierce公司产品）说明书进行实验，采用ECL化学发光底物显色，Bio-Rad凝胶成像系统照相并分析实验结果。提取各实验组全细胞裂解液用于检测总Ras蛋白，剩余裂解液与10 µl的0.5 mmol/L乙二胺四乙酸（pH 8）和5 µl的10 mmol/L GTPγS 30 °C孵育15 min后，加入琼脂糖珠（预包被GST-Raf1-RBD蛋白），冰浴1 h后进行免疫反应。洗脱结合蛋白。用Western blot法检测总Ras蛋白水平和GST-结合Ras（活化Ras）水平，分析Ras激酶活化情况。

按照Akt激酶或p44/42 MAP激酶试剂盒（美国Cell Signaling Technology公司产品）操作说明，检测MAPK和Akt激酶活性。Bio-Rad凝胶成像系统检测各实验组蛋白条带的A值，以内参照蛋白条带的A值作为参照，实验设PBS处理组激酶活性为1。激酶活性抑制率（%）=[1−（A实验组/A内参蛋白）/（APBS处理组/A内参蛋白）]×100%。

8．Western blot法分析caspase级联反应蛋白的表达及活化：腺病毒Ad5F35-SD-HA感染K562细胞96 h，收集各实验组细胞，PBS洗涤，提取蛋白，Western blot法分析各实验组凋亡膜受体死亡途径的相关凋亡蛋白caspase-8、caspase-3和PARP蛋白及活化降解片段的表达。

结果

1．重组腺病毒转染效率分析：各实验组分别感染K562细胞后，荧光显微镜观察，可见每个视野中大多数细胞表达绿色荧光蛋白（GFP）（图1A所示为48 h感染情况）。再将感染病毒24、48、96 h的细胞用PBS洗涤3次，流式细胞术检测细胞表达GFP的比率，定量分析病毒对细胞的转染效率均大于80%（图1B所示为48 h感染结果）。

图1

腺病毒转染K562细胞48 h转染效率

A：荧光显微镜观察（×100）；B：流式细胞术分析

2．双向免疫共沉淀分析融合蛋白SD-HA与p-BCR-ABL（Tyr 177）蛋白质的相互作用：用抗HA抗体进行免疫标记，带HA标签的融合蛋白SD-HA可将p-BCR-ABL（Tyr 177）沉淀形成复合物，而SmD-HA不能（图2A）；p-BCR-ABL（Tyr 177）与各实验组蛋白裂解液发生免疫反应，也可沉淀携带HA标签的SD-HA蛋白，与之发生免疫共沉淀反应（图2B）。而对照组病毒转染K562细胞后，均不能与p-BCR-ABL（Tyr 177）蛋白发生免疫共沉淀反应。

图2

双向免疫共沉淀验证融合蛋白SD-HA与p-BCR-ABL (Tyr 177)蛋白质的相互作用

A：带HA标签的融合蛋白SD-HA能与p-BCR-ABL (Tyr 177)发生免疫沉淀；B：p-BCR-ABL (Tyr 177)能免疫沉淀SD-HA蛋白。1：融合蛋白SD-HA组；2：突变对照SmD-HA组；3：空载体对照组；4：PBS处理对照组

3．重组腺病毒介导的SD-HA对MAPK蛋白激酶活性的影响：Western blot法检测各实验组总MAPK及p-MAPK蛋白水平，各实验组的总MAPK及p-MAPK蛋白条带A值通过与其对应的Actin条带的A值对比，可见细胞内源的MAPK蛋白水平变化不大，但融合蛋白SD-HA组p-MAPK水平明显降低，蛋白抑制率约为50%。我们用MAPK底物磷酸化分析法，进一步验证MAPK激酶活性的变化，用总MAPK蛋白作为参考，用于校正蛋白上样，同样证实融合蛋白SD-HA的转导可以明显减低MAPK的底物磷酸化ELK（p-ELK）的水平，从而降低MAPK激酶活性（激酶活性抑制率约为40%）（图3）。

图3

Western blot法检测融合蛋白SD-HA对K562细胞磷酸化MAPK（p-MAPK）及MAPK激酶活性的影响

A：p-MAPK表达分析；B：MAPK激酶活性分析。1：融合蛋白SD-HA组；2：突变对照SmD-HA组；3：空载体对照组；4：PBS处理对照组

4．重组腺病毒介导的SD-HA对Akt蛋白激酶活性的影响：经重组腺病毒处理细胞96 h后，提取各组细胞总蛋白，Western blot检测结果显示，与各对照组相比，融合蛋白SD-HA组细胞内源性总Akt表达无明显变化，但p-Akt表达明显减低（蛋白抑制率为44.0%）。为进一步验证Akt激酶活性变化，我们分析了Akt底物磷酸化GSK（p-GSK）的表达水平，结果显示，融合蛋白SD-HA组与各对照组比较，p-GSK表达水平明显减低（激酶活性抑制率为52.3%）（图4）。

图4

Western blot法检测融合蛋白SD-HA对K562细胞磷酸化Akt（p-Akt）及Akt激酶活性的影响

A：p-Akt表达分析；B：Akt激酶活性分析。1：融合蛋白SD-HA组；2：突变对照SmD-HA组；3：空载体对照组；4：PBS处理对照组

5．重组腺病毒Ad5F35介导的SD-HA对Ras蛋白激酶活性的影响：Western blot检测各组细胞总Ras蛋白和GST-结合Ras（代表活化Ras蛋白激酶）水平，分析Ras激酶活性，抗GST用于校正蛋白上样量,结果显示，与各对照组相比，融合蛋白SD-HA组细胞内GST-结合Ras（活化Ras）水平减低（激酶活性抑制率为60.0%）（图5）。

图5

Western blot法检测融合蛋白SD-HA对K562细胞Ras激酶活性的影响

1：融合蛋白SD-HA组；2：突变对照SmD-HA组；3：空载体对照组；4：PBS处理对照组

6．Western blot分析重组腺病毒介导的SD-HA对K562细胞caspase级联反应蛋白表达及活化的影响：Western blot检测结果如图6所示，融合蛋白SD-HA组可见caspase-8蛋白出现明显的相对分子质量43×103活化降解片段，caspase-3蛋白出现明显的相对分子质量17×103和19×103的活化降解片段（图6B），PARP蛋白出现相对分子质量89×103的活化降解片段，突变对照SmD-HA组caspase-8、caspase-3和PARP的活化降解片段条带隐约可见，空载体对照组和PBS处理组降解片段未见。

图6

Western blot法检测各组细胞caspase级联反应蛋白水平

A：各组细胞caspase-8级联反应蛋白水平；B：各组细胞caspase-3级联反应蛋白水平；C：各组细胞PARP级联反应蛋白水平。1：融合蛋白SD-HA组；2：突变对照SmD-HA组；3：空载体对照组；4：PBS处理对照组

讨论

CML持续表达强酪氨酸激酶活性的BCR-ABL融合蛋白，其N端第177位酪氨酸位点（Y177）是BCR-ABL癌蛋白与各种信号通路中接头蛋白结合的重要位点[5]。BCR-ABL通过其Y177p自身酪氨酸磷酸化后，与接头蛋白Grb2的SH2特异性结合，再通过Grb2的N端和C端的SH3结构域结合下游的Gab2、Sos分子，分别激活磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide3-kinases，PI3K）-AKT途径、RAS-MAPK途径的细胞转导信号，致细胞恶性转化[5]。

鉴于Grb2在CML细胞信号传导中的重要地位，有研究组针对Grb2的SH3结构域设计二聚肽peptidimer-c，阻止Grb2与下游分子的连接[6]–[7]；Kardinal等[8]合成能与Grb2的SH3结构域作用的膜转导肽HAGBP，竞争性抑制Grb2与Sos的结合，抑制Ras信号途径活化，从而达到抑制肿瘤细胞Ras依赖性增殖的目的。而该实验存在一些不足，合成的治疗肽只竞争性抑制了Grb2 SH3结构域N端与Sos的结合，对其结构域C端介导的信号传导无作用，不能充分阻断BCR-ABL-Y177磷酸化后经Grb2介导的信号传导，故抑制CML细胞增殖作用有限。

近年来，通过多种途径诱导肿瘤细胞凋亡已成为肿瘤治疗的重要手段，而利用调节凋亡相关信号通路的方式诱导肿瘤细胞凋亡已经成为肿瘤研究的热点[9]–[10]。在细胞凋亡的膜死亡受体途径中，凋亡蛋白caspase的激活是细胞发生凋亡的关键一步，而FADD通过其DED募集caspase-8前体蛋白，从而启动caspase-8前体蛋白寡聚化又是caspase-8激活的关键[11]。

我们前期研究证实，外源性转入SH2蛋白可竞争性结合BCR-ABL激酶区以外的Y177p位点，抑制Grb2-Y177p复合物形成，从而抑制RAS-MAPK、PI3K-Akt信号途径的活化[2]。所以，BCR-ABL的Y177p位点可能成为治疗CML的一个新切入点。进一步研究中，我们将SH2和DED融合表达的SD-HA蛋白转入CML细胞株KU812、K562，实验结果显示，SD-HA可以特异性抑制CML细胞增殖和诱导其凋亡[9]。

本研究以含有BCR-ABL融合基因的CML急变的细胞株K562为模型，分析腺病毒AD5F35所介导的融合蛋白SD-HA对CML细胞抑制增殖、促进凋亡具体的作用机制。双向免疫共沉淀实验证实融合蛋白SD-HA可与BCR-ABL的Y177p蛋白相互作用，形成复合物，竞争性抑制接头蛋白Grb2与BCR-ABL-Y177p的结合，从而阻断Grb2将BCR-ABL癌蛋白信息向下游信号途径传递。进一步分析其下游信号途径，融合蛋白SD-HA能抑制Grb2下游细胞增殖信号途径分子Ras、MAPK和AKT的活化，即下调其磷酸化蛋白水平，减低激酶活性，抑制CML细胞增殖。

Western blot结果显示caspase级联反应蛋白caspase-8、caspase-3和PARP的活化，推测可能是融合蛋白SD-HA的SH2结构域与BCR-ABL-Y177p结合后，通过其携带的结构域DED在一定的空间范围内大量聚集，容易使携带的DED与caspases-8前体DED结合而寡聚化，形成异源性二聚体，从而激活caspase-8诱导的细胞凋亡信号，活化caspase-3，下游信号分子PARP活化，切断胞核内的染色体，启动细胞的程序性死亡，诱导细胞凋亡。

本研究结果证实：BCR-ABL阳性K562细胞转入新型重组腺病毒载体Ad5F35-SD-HA后，可高效表达融合蛋白SD-HA，并与Grb2的SH2结构域竞争性结合BCR-ABL-Y177p，抑制BCR-ABL-Y177磷酸化所依赖的Ras-PI3K增殖信号。并且通过其DED寡聚化，引起caspase-8前体活化，激活caspase-8及其caspase-8依赖的凋亡信号，从而诱导CML细胞凋亡。研究结果提示，抑制BCR-ABL-Y177与Grb2结合的策略作为CML治疗新靶点具有可行性。