Frequency of common polymorphisms in Caveolin 1 ( CAV1 ) gene in adults with high serum triglycerides from Colombian Caribbean Coast.

BACKGROUND: Caveolin 1 gene (CAV1) has been associated with insulin resistance, metabolic syndrome and hypertension in humans. Also, it has been related to high serum triglycerides in rodents, however there is little evidence of this relation in humans. AIM: To describe frequencies of common variations in CAV1 in adults with high serum triglycerides.
METHODS: A case-control study was carried out with adults from Colombian Caribbean Coast. A whole blood sample was employed to measure serum concentrations of triglycerides, glucose, total cholesterol and HDLc. Six common Single Nucleotide Polymorphism (SNP) in CAV1 were genotyped (rs926198, rs3779512, rs10270569, rs11773845, rs7804372 and rs1049337). Allelic and genotypic frequencies were determined by direct count and Hardy-Weinberg Equilibrium (HWE) was assessed. Case and control groups were compared with null-hypothesis tests.
RESULTS: A total of 220 cases and 220 controls were included. For rs3779512 an excess in homozygotes frequency was found within case group (40.4% (GG), 41.3% (GT) and 18.1% (TT); Fis=0.13, p=0.03). Another homozygotes excess among case group was found in rs7804372 (59.5% (TT), 32.3% (TA) and 8.2% (AA); Fis= 0.12, p= 0.04). In rs1049337, cases also showed an excess in homozygotes frequency (52.7% (CC), 35.0% (CT) and 12.3% (TT); Fis= 0.16, p= 0.01). Finally, for rs1049337 there were differences in genotype distribution between case and control groups (p <0.05).
CONCLUSION: An increased frequency of homozygote genotypes was found in subjects with high serum triglycerides. These findings suggest that minor alleles for SNPs rs3779512, rs7804372 and rs1049337 might be associated to higher risk of hypertriglyceridemia.

Introduction

Caveolin 1 (CAV1) is a 36.4 Kb gene located in chromosome 7 (7q31.1), with three exonic segments separated by two introns, which codifies for a 22 KDa membrane protein - . These three exons account for 30, 165 and 342 bp, while introns represent more than 95% of total CAV1 length and contain more than 500 Single Nucleotide Polymorphisms (SNP) , .

CAVEOLIN-1 protein is indispensable for caveolae formation in plasma membrane of many cellular types, however adipose tissue expresses the highest amount of this protein in humans, rodents and other animals, suggesting that CAVEOLIN-1 and caveolae are involved in energy homeostasis , . Moreover, in vitro studies demonstrated that CAVEOLIN-1 expression is significantly increased during adipogenesis, also it has been saw that the presence of this protein is necessary for appropriated preadipocytes proliferation and differentiation , .

In adipocytes, CAVEOLIN-1 has been directly linked to insulin receptor as an enhancing factor for intrinsic phosphorylation - , and it has been associated with stability of the Glucose Transpoter 4 (GLUT 4) , . Additionally, CAVEOLIN-1 and caveolae are closely implicated in triglycerides metabolism through their association with lipid droplets conformation, and also caveolar domains in cell membrane are suspected to be sites for fatty acids entry and for triglycerides synthesis - .

Animal models with rodents have demonstrated that caveolin-1 is crucial for triglycerides metabolism in adipose tissue since it seems to be involved in lipid droplets distribution and lipid storage dynamics . Therefore it has been found that CAV1 knock-out individuals under an exposition to high fat diet are lean and more likely to develop hypertrygliceridemia as well as insulin resistance , .

In humans, common variations in CAV1 gene have been associated to metabolic disorders such as insulin resistance, high blood pressure and metabolic syndrome - . Initially two exonic variations in CAV1 were associated with high blood pressure and metabolic syndrome in a population from Southern Spain . After that, an intronic SNP (rs926198) was associated with insulin resistance, and partially related to high blood pressure in a translational study that employed a human cohort with European ancestry . Recently, the same intronic polymorphism was related to metabolic syndrome, type 2 diabetes and low HDL cholesterol in a human cohort with European ancestry, and these findings were replicated in an admixed Hispanic group, which represents the first evidence involving CAV1 with lipid alterations in humans .

In spite of growing evidence linking CAV1 with lipid homeostasis, there are still little findings supporting an association with triglycerides metabolism in human groups. Triglycerides (or triacylglycerol), the most relevant molecule for energy storage, are mainly accumulated in adipose tissue, but also are constitutive components of blood plasma and serum . High serum triglycerides (or hypertriglyceridemia) is a prevalent alteration among adult population that is generally associated with a high-energy unbalanced environment . In developing countries, dyslipidemias and particularly high serum triglycerides are public health issues, which contribute to cardiovascular mortality among more vulnerable communities .

Together with most of Latin American countries, Colombia has registered a permanent elevation in frequencies of hypertriglyceridemia with notable intra-national variations in a range of prevalence that has been found as low as 19.3% and as high as 43.9% , . In Cartagena de Indias, on the Colombian Caribbean Coast, high serum triglycerides were found in 38.2% of women , and between 67.7% and 77.8% of the general population , which represents one of the highest national frequencies.

Considering that Colombian Caribbean populations would require novel strategies to reduce the impact of high serum triglycerides on public wellness, it has been proposed that genetic factors might be a source of valuable data to design preventive interventions or therapeutic approaches. In this way, this study was aimed to describe frequencies of six SNPs in CAV1 in adults with high serum triglycerides from the Colombian Caribbean Coast.

Materials and Methods

A cross-sectional, case-control study was carried out in urban zone of Cartagena de Indias, an admixed population with a predominant European ancestry (60%) as a consequence of Spaniards colonization between XVI and XIX centuries .

Non-sibling individuals from both genders, aging 18-80 years old were included. Subjects with primary endocrine alterations or previous diagnosis of genetic disease, eating behavior disorders, recent hospitalization, cancer, personal antecedents of surgical treatment for obesity, pregnant women, and breast-feeding mothers were excluded. All subjects were asked to participate, and their informed consent was required, following Universidad de Cartagena Ethics Committee recommendations.

Subjects were selected through a convenience sampling in work places and household clusters. For this procedure seven sampling points were included, which represent a socio-economic mixed population that is currently employed in diverse labors (e.g., management, civil construction, industrial production, security services, and teaching/learning). Unemployed populations were included through a random cluster sampling that was executed in five socio-demographic diverse areas.

Classification of cases and control groups was based on Joint Interim Statement (JIS) criteria for high serum triglycerides . Therefore, cases were those subjects with serum triglycerides ≥150 mg/dL or clinical antecedents of high serum triglycerides, while subjects with serum concentrations below 150 mg/dL and without previous diagnosis of dyslipidemia were selected as controls.

Fasting blood sample were collected for measuring of serum glucose, cholesterol, triglycerides and HDL cholesterol. Colorimetric assays to determine serum concentrations were performed in UNIMOL laboratory at the University of Cartagena following standard protocols. Serum biochemical parameters were assessed in order to bring a wide description of metabolic status. Among of these variables only serum triglycerides was employed as selection criteria for cases or controls.

Socio-demographic variables were registered employing a validated survey previously applied to Caribbean urban communities , . Cases and controls groups were paired by sex and age according to this data.

For genetic analysis, 3 mL of whole blood were collected in sterile tubes containing EDTA as anticoagulant; these samples were refrigerated and transported to UNIMOL laboratory at the University of Cartagena for further procedures. Genomic DNA was isolated through the employment of a commercial kit (Promega Corp., Madison, USA) following principles published by others , and then quantified through fluorometric method with Qubit 2.0 (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA) using proper reagents.

For genotyping assay, prior to molecular procedures, common variants in CAV1 were selected employing data from HapMap project and Haploview 4.2 software (Broad Institute, Cambridge, USA) , . Genomic data from CEU population (Utah Residents with Northern and Western European Ancestry) was used as reference to select SNPs with Minor Allele Frequency (MAF) ≥0.25, and correlation coefficient (r2) ≥0.8. According to these parameters, six polymorphisms were selected for further molecular analysis (Table 1).

Table 1

Single Nucleotide Polymorphisms (SNP) selected in Caveolin 1 (CAV1) gene employing data from HapMap project. Minor Allele Frequency (MAF) ≥0.25 and r2 ≥0.8 were used as tagging criteria.

SNP	MAF	Function	Reference Variation
rs926198	0.332	Intron	C/T
rs3779512	0.407	Intron	G/T
rs10270569	0.274	Intron	C/T
rs11773845	0.420	Intron	A/C
rs7804372	0.270	Intron	A/T
rs1049337	0.250	3'-UTR	C/T

UTR: Untranslated Region

Selected SNPs were genotyped through quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR), using specific TaqMan probes (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA). Allelic discrimination was automatically performed with end-point fluorescent data, which was analyzed through StepOne Real-Time PCR Software (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA).

Sociodemographic data, anthropometric measures and serum concentrations were described employing main tendency and frequency values. When appropriate, mean values were compared through Student's t test, while frequencies were compared with X2 or Fisher's exact tests. Allelic and genotypic frequencies were determined by direct count, linkage disequilibrium was estimated employing Arlequin 3.5 , and Hardy-Weinberg Equilibrium (HWE) was assessed through Fis values with Genetix 4.05 software. Differences in genotype distributions among cases and controls groups were assessed through null-hypothesis tests, as it has been described elsewhere .

Results

A total of 440 subjects were included in the study (220 cases and 220 controls). Mean values for age, Body Mass Index (BMI), anthropometric and serum biochemical variables were represented in the Table 2. There were not statistically significant differences in sex distribution, age and anthropometric variables between both groups.

Table 2

Socio-demographic, anthropometric and metabolic variables. Comparisons between groups were performed with X2 and t-student test, when appropriate.

Variables	Cases		Controls		p-value
Sex (males)	61.3%	54.5-67.7	66.3%	59.6-72.5	0.321
Age (years old)*	43.1	±12.0	42.1	±14.3	0.418
Anthropometric Parameters*
Body Mass Index (kg/m2)	26.9	±4.0	26.3	±4.4	0.139
Waist Circumference (cm)	94.3	±9.5	92.4	±10.9	0.063
Hip Perimeter (cm)	101.9	±8.5	101.9	±9.1	0.941
Blood Pressure (mmHg)*
Systolic	114.5	±16.8	111.9	±15.1	0.082
Diastolic	76.5	±11.3	75.0	±10.1	0.139
Serum Concentrations (mg/dL)*
Triglycerides	210.4	±63.4	143.2	±27.2	<0.001
Glucose	100.7	±33.1	87.4	±25.5	<0.001
Cholesterol	200.9	±68.3	178.1	±37.2	<0.001
HDLc	47.4	±16.3	42.9	±10.9	<0.001

Sex was represented as proportion. 95% confidence interval

* Mean values ± standard deviation

For polymorphism rs926198, minor allele (C) was found in 27.9% of cases and in 30.9% of control subjects (p= 0.34). In the group of cases, genotypes TT, TC and CC were found in 52.7%, 38.6% and 8.6% of subjects, respectively; while in controls these genotypes were found in 50.0%, 38.2% and 11.8%, respectively. Hardy-Weinberg equilibrium (HWE) was found in both groups with Fis values in 0.04 (p= 0.31) and 0.10 (p= 0.07) for cases and controls, respectively (Table 3).

Table 3

Genotype distributions for Single Nucleotide Polymorphisms in Caveolin 1 (CAV1) gene in subjects with high serum triglycerides (cases) and controls. A recessive model was applied in order to compare differences between cases and controls.

Genotype	Cases	Controls	p-value
rs926198	n(%)	n(%)
TT	116 (52.7)	110 (50.0)
TC	85 (38.6)	84 (38.2)
CC	19 (8.6)	26 (11.8)	0.53
TT+TC	201 (91.4)	194 (88.2)
CC	19 (8.6)	26 (11.8)	0.34
rs3779512
GG	89 (40.4)	82 (37.3)
GT	91 (41.4)	101 (45.9)
TT	40 (18.2)	37 (16.8)	0.62
GG+GT	180 (81.8)	183 (83.2)
TT	40 (18.2)	37 (16.8)	0.70
rs10270569
CC	149 (67.7)	141 (64.1)
CT	61 (27.7)	75 (34.1)
TT	10 (4.6)	4 (1.8)	0.12
CC+CT	210 (95.4)	216 (98.2)
TT	10 (4.6)	4 (1.8)	0.17
rs11773845
AA	88 (40.0)	71 (32.3)
AC	92 (41.8)	96 (43.6)
CC	40 (18.2)	53 (24.1)	0.15
AA+AC	180 (81.8)	167 (75.9)
CC	40 (18.2)	53 (24.1)	0.16
rs7804372
TT	131 (59.5)	116 (52.7)
AT	71 (32.3)	86 (39.1)
AA	18 (8.2)	18 (8.2)	0.30
TT+AT	202 (91.8)	202 (91.8)
AA	18 (8.2)	18 (8.2)	-
rs1049337
CC	116 (52.7)	121 (55.0)
CT	77 (35.0)	86 (39.1)
TT	27 (12.3)	13 (5.9)	0.06
CC+CT	193 (87.7)	207 (94.1)
TT	27 (12.3)	13 (5.9)	0.03

X2 and Fisher's exact tests were performed to determine differences in genotype distribution between cases and controls.

Minor allele (T) frequency for SNP rs3779512 in the case group was 38.9%, and in the control group was 39.8% (p= 0.83). Genotypic distribution in cases was 40.4% (GG), 41.4% (GT) and 18.2% (TT), with Fis= 0.13 (p= 0.03); in controls genotypic distribution was 37.3% (GG), 45.9% (GT) and 16.8% (TT), with Fis=0.04 (p= 0.30) (Table 3).

In rs10270569, when a change C/T was reported, minor allele (T) was found in 18.4% of cases and 18.9% of controls (p= 0.93). Homozygotes CC, heterozygotes CT and homozygotes TT represented 67.7%, 27.7% and 4.6% in the case group, respectively; and in the control group these proportions were 64.1%, 34.1% and 1.8%. HWE was estimated in the case group (Fis= 0.07, p= 0.17), and also in the control group (Fis= -0.11, p= 0.97 ) (Table 3).

For SNP, rs11773845 minor allele (C) was found in 39.1% and 45.9% of cases and controls, respectively (p= 0.047). Among case subjects, proportions of homozygotes AA, heterozygotes AC and homozygotes CC were 40.0%, 41.8% and 18.2%, respectively. In the control group, genotypic distribution AA/AC/CC was 32.3%, 43.6% and 24.1%, in that order. In both groups Fis was equal to 0.12 (k= 0.04), suggesting an excess in heterozygote frequency (Table 3).

Frequency of minor allele (A) in SNP rs7804372 was 24.3% in the case group and 27.7% in the control group (p= 0.28). In cases, genotypic frequencies of homozygotes (TT), heterozygotes (TA) and homozygotes (AA) were 59.5%, 32.3% and 8.2%, respectively. This distribution in control subjects was 52.7%, 39.1% and 8.2%, in the same order. HWE in the case group was found with Fis=0.12 (p= 0.04), and in controls with Fis= 0.02 (p= 0.41) (Table 3).

Minor allele (T) in SNP rs1049337 was found in 29.8% of case subjects, and in 25.5% of controls (p= 0.17). Genotypic frequencies in cases were 52.7% (CC), 35.0% (CT) and 12.3% (TT); while in control subjects frequencies were 55.0% (CC), 39.1% (CT) and 5.9% (TT). Excess in heterozygotes frequency was found in cases (Fis= 0.16, p= 0.01), while HWE was found in the control group (Fis= -0.03, k= 0.71) (Table 3).

To assess differences in genotypic distribution between cases and controls, homozygotes for minor allele were compared in a recessive model. According to this approach, there were statistically significant differences between cases and controls for SNP rs1049337 (p <0.05) (Table 3).

Discussion

The current research has contributed to the description of common variants in CAV1 gene in an admixed population from Caribbean Region, which represents an initial approach to cumulate evidence on genotype/phenotype relation involving SNPs in CAV1 and metabolic disorders that has been previously found in American-Hispanic population , .

In the present study, marginal differences in allele and genoptype frequencies were found, suggesting that there are little statistical significance to determine a genetic association, however further researches with a meticulous association analysis should not be discharged. According to results from this work, when case and control groups were compared in the present study, the minor allele T in rs1049337 and the homozygotes TT were found to be more frequent in cases (Table 3). In a simple way these differences between groups suggest a tendency that relates CAV1 variations and hypertriglyceridemia in adult population, where the risk allele is acting as a recessive character. A significant Hardy-Weinberg disequilibrium was also found in the case group (Fis= 0.16, p= 0.01), which indicates that an excess in heterozygotes frequency was found among these subjects, supporting findings of a recessive model that was described above. Other authors have previously analyzed this SNP in cohorts with obesity-related diseases, however a dominant model showed that there were not differences in genotype distribution between subjects with and without insulin resistance (p= 0.08) . Another study applied a similar design to describe association between high serum triglycerides and rs926198, nevertheless there were not differences in allele or genotype frequencies . Hence, this work brings novel evidence about this particular polymorphic variations and its behavior in groups with high serum triglycerides from an admixed population.

Since rs1049337 showed an interesting behavior, allele frequencies found in this study were compared to previous reports from reference populations in order to bring a deeper description that might be helpful in further analysis. In this regard, allele frequency for rs1049337 was similar to that reported by the HapMap project for CEU population (MAF: 27.6% vs 25.0%) (Table 4). In spite of ethnic similarities with MEX (Mexican ancestry in Los Angeles, California), it was not possible to establish a comparison with current samples from Cartagena de Indias due to the lack of data for this SNP in HapMap Project database .

Table 4

Allele frequencies for Single Nucleotide Polymorphisms in Caveolin 1 (CAV1) gene from different populations. References population were taken from HapMap project, while Cases and Controls represent sample from the present study.

SNP	Cases	Controls	CEU	MEX	YRI	HCB
rs926198
C	0.280	0.309	0.332	0.184	0.611	0.093
T	0.720	0.691	0.668	0.816	0.389	0.907
rs3779512
G	0.611	0.602	0.593	0.730	0.195	0.895
T	0.389	0.398	0.407	0.270	0.805	0.105
rs10270569
C	0.816	0.811	0.726	0.780	0.732	0.965
T	0.184	0.189	0.274	0.220	0.268	0.035
rs11773845
A	0.609	0.541	0.580	0.750	0.221	0.698
C	0.391	0.459	0.420	0.250	0.779	0.302
rs7804372
A	0.243	0.277	0.270	0.210	0.327	0.221
T	0.757	0.723	0.730	0.790	0.673	0.779
rs1049337
C	0.702	0.745	0.750	-	0.973	0.488
T	0.298	0.255	0.250	-	0.027	0.512

CEU: Utah residents with Northern and Western European ancestry;

MEX: Mexican ancestry in Los Angeles, California;

YRI: Yoruba in Ibadan, Nigeria;

HCB: Han Chinese in Beijing, China

In general, allelic frequencies and genotype distributions in this sample were similar to those found in groups with European ancestry living in North America (Table 4). In fact, findings from Cartagena de Indias were notably close to European frequencies even in SNPs with a high inter-population variation such as rs926198, rs3779512 and rs1049337, suggesting that Spaniard ancestry is a predominant component in contemporary population from Cartagena de Indias .

Previous studies have described a three-hybrid admixed population in Cartagena de Indias, in which European ancestry represented more than a half of all lineages , , thus current genotype frequencies of CAV1 SNPs are in agreement with an elevated representation of Spanish ancestry. In this sense, it is possible that genetic association studies could be replicated employing simple fitting methods that require a conservative increase in size of study or sample size. However, following STREGA consortium recommendations , genetic stratification in Cartagena de Indias remains a concerning issue that should be included as a confounder in weighted analytical procedures.

In spite of the historical contribution of African immigrants forced to come to the Colombian Caribbean Coast as slaves - , this recent demographic event showed little influence on CAV1 SNPs genetic distribution, considering that local allelic frequencies were distant to those found in reference African groups (Table 4). These results suggest that sex-biased gene flow caused by social predominance of European groups during colonial period in Latin America and the Caribbean might be responsible for some of current population genetic patterns , .

Although results from the present study have pointed out to a relationship between CAV1 polymorphisms and high serum triglycerides, there are some limitations that must be considered. First, this study was carried out on an admixed population where genetic stratification has been widely described, therefore a confounding effect must be discharged in further analysis , . Second, group sizes is relatively small for complete discrimination of genetic associations, thus this study was mostly restricted to descriptive and comparative observations.

Conclusion

Allelic and genotype frequencies described for SNPs in CAV1 in a sample from Cartagena de Indias were similar to those observed in groups with European ancestry. Additionally, differences in allelic and genotype distributions between cases and controls found in this study settled a precedent for incoming genetic association studies with a larger sample and higher performance in analytical procedures.

Introducción

El gen Caveolina 1 (CAV1) tiene una longitud de 36.4 Kb y se localiza en el cromosoma 7 (7q31.1), conformado por tres segmentos exónicos separdos por dos intrones, el cual codifica para una proteína integral de membrana de 22 KDa -. Estos tres exones están comprendidos por 30, 165 y 342 pb, mientras que los intrones representa más del 95% de la longitud total de CAV1 y continen más de 500 Polimorfismos de Nucleótido Simple (SNP, por las siglas en inglés para Single Nucleotide Polymorphism) ,.

La proteína CAVEOLINA-1 es indispensable para la formación de la caveola en la membrana plasmática de muchos tipos celulares, sin embargo en humanos, roedores y otros animales la mayor cantidad de esta proteína se expresa en el tejido adiposo, sugiriendo que la CAVEOLINA-1 y las caveolas están involucradas en la homeostasis energética ,. Además, en estudios in vitro se ha demostrado que la expresión de CAVEOLINA-1 se incrementa significativamente durante la adipogénesis, y también se ha observado que la presencia de esta proteína es necesaria para la proliferación y diferenciación de los preadipocitos ,.

En adipocitos, la CAVEOLINA-1 ha sido directamente relacionada directamente con el receptor de insulina como un facilitador de las fosforilación intrínseca -, y ha sido asociada con la estabilidad del Transportador de Glucosa 4 (GLUT4) ,. Adicionalmente, la CAVEOLINA-1 y las caveolas están estrechamente implicadas en el metabolismo de triglicéridos a través de su asociación con la formación y mantenimiento de los cuerpos lipídicos, y además se sospecha que los dominios caveolares en la membrana celular son sitios de entrada para ácidos grasos y síntesis de triglicéridos -.

Modelos animales con roedores han demostrado que la caveolina-1 es crucial en el metabolismo de triglicéridos en el tejido adiposo ya que parece estar involucrada en la distribución y dinámica de almacenamiento de los cuerpos lipídicos . En el mismo sentido, se ha encontrado que los ratones silenciados en CAV1 al ser sometidos a una dieta alta en grasas permanecen delgados y son más propensos a desarrollar hipertrigliceridemia, así como resistencia a la insulina ,.

En humanos, variantes comunes en CAV1 han sido asociadas con algunos desórdenes metabólicos como resistencia a la insulina, hipertensión arterial y síndrome metabólico -. Inicialmente dos variaciones exónicas en CAV1 fueron asociadas con hipertensión y síndrome metabólico en una población del sur de España . Seguidamente, un SNP intrónico (rs926198) fue asociado con resistencia a la insulina y parcialmente relacionado con hipertensión en un estudio traslacional que analizó una cohorte de sujetos con ancestría Europea . Recientemente, el mismo polimorfismo fue vinculado con el síndrome metabólico, diabetes mellitus tipo 2 y bajas concentraciones de colesterol HDL en dicha cohorte con ancestría Europea, además estos hallazgos fueron replicados en un grupo Hispano genéticamente subestructurado, lo que representa la primera evidencia que relaciona a CAV1 con alteraciones lipídicas en humanos .

A pesar del creciente cúmulo de evidencia vinculando a CAV1 con la homeostasis lipídica, aún son escasos los hallazgos que respaldan la asociación con el metabolismo de triglicéridos en grupos humanos. Los triglicéridos (o triacilglicerol), constituyen la molécula más importante para el almacenamiento de energía, se acumulan principalmente en el tejido adiposo, pero también son componentes constitutivos del plasma y suero sanguíneo . La hipertrigliceridemia es una alteración prevalente en la población adulta que generalmente está asociada a un entorno energéticamente desbalanceado . En países de medianos y bajos ingresos las dislipidemias y particularmente la hipertrigliceridemia son problemas prioritarios para la salud pública que contribuyen con la mortalidad por enfermedad cardiovascular en las poblaciones más vulnerables .

Junto a la mayoría de los países de América Latina, Colombia ha registrado un incremento persistente en la frecuencia de hipertrigliceridemia con notables variaciones intra-nacionales que oscilan en un rango de prevalencias que va desde valores tan bajos como 19.3% hasta otros tan altos como 43.9% ,. En Cartagena de Indias, en el Caribe Colombiano, la hipertrigliceridemia fue encontrada en el 38.2% de las mujeres , y entre el 67.7 y 77.8% de la población general , lo que representa una las frecuencias más altas a nivel nacional.

Considerando que las poblaciones del Caribe Colombiano podrían requerir estrategias novedosas para reducir el impacto de la hipertrigliceridemia sobre el bienestar colectivo, algunos han propuesto que los factores genéticos serían una fuente de datos útiles para diseñar intervenciones preventivas o abordajes terapéuticos. Sobre esta base, el presente estudio tuvo como objetivo describir las frecuencias de seis SNPs de CAV1 en adultos con hipertrigliceridemia del Caribe Colombiano.

Materiales y Métodos

Se llevó a cabo un estudio de casos y controles en la zona urbana de Cartagena de Indias, una población genéticamente mezclada con predominancia de ancestría Europea (60%) como consecuencia de la colonización española durante los siglos XVI al XIX .

Fueron incluidos individuos no emparentados de ambos sexos, con 18-80 años de edad. Se excluyeron a los sujetos con alteraciones endocrinas primarias o un diagnóstico previo de enfermedad genética, desórdenes de la conducta alimentaria, hospitalización reciente, cáncer, antecedentes personales de tratamiento quirúrgico para obesidad, mujeres embarazadas y en periodo de lactancia. Todos los sujetos fueron invitados a participar voluntariamente en el estudio y se les solicitó el consentimiento informado por escrito, siguiendo las recomendaciones del Comité de Ética en Investigación de la Universidad de Cartagena.

Los sujetos fueron seleccionados a través de un muestreo por conveniencia en los lugares de trabajo y conglomerados de viviendas. Para este procedimiento de incluyeron siete puntos de muestreo, que representan un grupo de la población con características socio-económicas mixtas y que se dedican a diversas labores (e.g., administración y oficina, construcción civil, producción industrial, servicios de seguridad y docencia). Los sujetos desempleados fueron incluidos a través de un muestreo aleatorio por conglomerados que fue ejecutado en cinco áreas con características socio-demográficas también diversas.

La clasificación de los grupos de casos y controles estuvo basada en los criterios para hipertrigliceridemia de la Declaración Provisional Conjunta (JIS, por la sigla en inglés para Joint Interim Statment) . De acuerdo con esto, los casos fueron aquellos sujetos con concentraciones séricas de triglicéridos ≥150 mg/dL o con antecedentes clínicos de hipertrigliceridemia, mientras que los controles fueron los participantes con concentraciones inferiores a 150 mg/dL y sin diagnóstico previo de dislipidemia.

A todos los participantes se les tomó una muestra de sangre venosa bajo condiciones de ayuno para medir las concentraciones séricas de glucosa, colesterol, triglicéridos y colesterol HDL. Los niveles de estas variables fueron determinados en el Laboratorio UNIMOL de la Universidad de Cartagena a través de ensayos colorimétricos usando protocolos estandarizados. Estos parámetros de bioquímica sanguínea fueron evaluados para brindar una mayor descripción del estado metabólico y facilitar en análisis de los resultados. Entre estas variables únicamente la trigliceridemia fue usada como criterio de discriminación entre casos y controles.

Las variables socio-demográficas fueron registradas mediante una encuesta validada que ha sido aplicada previamente en comunidades urbanas del Caribe Colombiano ,. Los grupos de casos y controles fueron apareados por seco y edad, siguiendo los datos recolectados en esta encuesta.

Para el análisis genético, se empleó una muestra de sangre de 3 mL recolectada en tubos estériles conteniendo EDTA como anticoagulante. Estas muestras fueron refrigeradas y transportadas al Laboratorio UNIMOL en la Universidad de Cartagena donde fueron procesadas. El ADN genómico fue extraído usando un juego de reactivos comerciales (Promega Corp., Madison, USA) siguiendo los principios publicados por otros autores , y luego cuantificados por fluorometría con el Qubit 2.0 (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, Estados Unidos) usando los reactivos correspondientes.

Para los ensayos de genotipificación, antes de los procedimientos de biología molecular, se seleccionaron las variantes en CAV1 usando los datos del proyecto HapMap y el programa Haploview 4.2 (Broad Institute, Cambridge, Estados Unidos) ,. Se emplearon los datos genómicos de la población CEU (sujetos con ancestría del Norte y Occidente de Europa residentes en Utah, Estados Unidos) como referencia para seleccionar los SNPs con una Frecuencia del Alelo Menor (MAF, por las siglas en inglés para Minor Allele Frequency) ≥0.25 y un coeficiente de correlación (r2) ≥0.8. Según estos parámetros, seis polimorfismos fueron seleccionados para análisis posteriores (Tabla 1).

Tabla 1. Polimorfismos

de Nucleótido Simple (SNP) seleccionados en el gen Caveolina 1 (CAV1) usando datos del proyecto HapMap. Se aplicaron como criterios de selección una Frecuencia de Alelo Menor (MAF) ≥0.25 y un coeficiente de correlación (r2) ≥0.8.

SNP	MAF	Function	Reference Variation
rs926198	0.332	Intron	C/T
rs3779512	0.407	Intron	G/T
rs10270569	0.274	Intron	C/T
rs11773845	0.420	Intron	A/C
rs7804372	0.270	Intron	A/T
rs1049337	0.250	3'-UTR	C/T

UTR: Región No Transcripta

Los SNPs seleccionados fueron genotipificados por Reacción en Cadena de la Polimerasa Cuantitativa, usando sondas TaqMan específicas (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, Estados Unidos). La discriminación alélica se ejecutó automáticamente a partir de los datos finales de fluorescencia que fueron analizados con el StepOne Real-Time PCR Software (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, Estados Unidos).

Los datos socio-demográficos, las medidas antropométricas y las concentraciones séricas fueron descritas con medidas de tendencia central y frecuencia. Según fuera apropiado, las medias fueron comparadas mediante la prueba t de Student, mientras que las frecuencias fueron comparadas con la prueba X2 o la prueba exacta de Fisher o de. Las frecuencias alélicas y genotípicas fueron determinadas por conteo directo, el desequilibrio de ligamientos fue estimado con el programa Arlequin 3.5 , y el Equilibrio de Hardy-Weinberg (HWE, por la sigla en inglés para Hardy-Weinberg Equilibrium) fue evaluado a través de los valores de Fis usando el programa Genetix 4.05. Las diferencias en las distribuciones genotípicas entre casos y controles fueron analizadas a través de pruebas de hipótesis nulas, como ha sido sugerido por otros autores .

Resultados

Se incluyó un total de 440 sujetos en el estudio (220 casos y 220 controles). Los valores promedios de edad, Índice de Masa Corporal (IMC), y de las variables antropométricas y bioquímicas se encuentran descritos en la Tabla 2. No se encontraron diferencias estadísticamente significativas en la distribución por sexo, edad y variables antropométricas entre ambos grupos.

Tabla 2

Variables sociodemográficas, antropométricas y metabólicas. Los grupos fueron comparados mediante las pruebas de X2 o la prueba t-student, según fuera conveniente.

Variables	Casos		Controles		Valores de p
Sexo (hombres)	61.3%	(54.5-67.7)	66.3%	(59.6-72.5)	0.321
Edad (años)*	43.1	±12.0	42.1	±14.3	0.418
Parámetros Antropométricos*
Índice de Masa Corporal (kg/m2)	26.9	±4.0	26.3	±4.4	0.139
Circunferencia abdominal (cm)	94.3	±9.5	92.4	±10.9	0.063
Perímetro de caderas (cm)	101.9	±8.5	101.9	±9.1	0.941
Presión arterial (mmHg)*
Sistólica	114.5	±16.8	111.9	±15.1	0.082
Diastólica	76.5	±11.3	75	±10.1	0.139
Concentración séricas (mg/dL)*
Triglicéridos	210.4	±63.4	143.2	±27.2	<0.001
Glucosa	100.7	±33.1	87.4	±25.5	<0.001
Colesterol	200.9	±68.3	178.1	±37.2	<0.001
cHDL	47.4	±16.3	42.9	±10.9	<0.001

La variable sexo fue descrita como una proporción. Intervalo de Confianza del 95%.

* Promedio ± Desviación estándar

En el SNP rs926198, el alelo menor (C) fue encontrado en el 27.9% de los casos y en el 30.9% de los controles (p= 0.34). En el grupo de casos, los genotipos TT, TC y CC se encontraron en el 52.7%, 38.6% y 8.6% de los sujetos respectivamente; mientras que en el grupo de controles estos genotipos se encontraron en el 50.0%, 38.2% and 11.8%, respectivamente. Ambos grupos se encontraban en equilibrio de Hardy-Weinberg con valores de Fis de 0.04 (p= 0.31) y 0.10 (p= 0.07) para los casos y los controles respectivamente (Tabla 3).

Tabla 3

Distribución genotípica de los SNPs en el gen de Caveolina 1 (CAV1) en sujetos con hipertrigliceridemia (casos) y controles. Se aplicó un modelo recesivo para la comparación de las diferencias entre ambos grupos (casos y controles).

Distribución genotípica	Cases	Controles	Valores de p
rs926198
TT	116 (52.7)	110 (50.0)
TC	85 (38.6)	84 (38.2)
CC	19 (8.6)	26 (11.8)	0.53
TT+TC	201 (91.4)	194 (88.2)
CC	19 (8.6)	26 (11.8)	0.34
rs3779512
GG	89 (40.4)	82 (37.3)
GT	91 (41.4)	101 (45.9)
TT	40 (18.2)	37 (16.8)	0.62
GG+GT	180 (81.8)	183 (83.2)
TT	40 (18.2)	37 (16.8)	0.70
rs10270569
CC	149 (67.7)	141 (64.1)
CT	61 (27.7)	75 (34.1)
TT	10 (4.6)	4 (1.8)	0.12
CC+CT	210 (95.4)	216 (98.2)
TT	10 (4.6)	4 (1.8)	0.17
rs11773845
AA	88 (40.0)	71 (32.3)
AC	92 (41.8)	96 (43.6)
CC	40 (18.2)	53 (24.1)	0.15
AA+AC	180 (81.8)	167 (75.9)
CC	40 (18.2)	53 (24.1)	0.16
rs7804372
TT	131 (59.5)	116 (52.7)
AT	71 (32.3)	86 (39.1)
AA	18 (8.2)	18 (8.2)	0.30
TT+AT	202 (91.8)	202 (91.8)
AA	18 (8.2)	18 (8.2)	-
rs1049337
CC	116 (52.7)	121 (55.0)
CT	77 (35.0)	86 (39.1)
TT	27 (12.3)	13 (5.9)	0.06
CC+CT	193 (87.7)	207 (94.1)
TT	27 (12.3)	13 (5.9)	0.03

Para determinar las diferencias de la distribución genotípica entre el grupo de casos y de controles se aplicó la prueba de X2 y la prueba exacta de Fisher.

La frecuencia del alelo menor (T) para el SNP rs3779512 en el grupo de casos fue de 38.9%, y de 39.8% en el de control (p= 0.83). La distribución genotípica en el grupo de casos fue de 40.4% (GG), 41.4% (GT) y 18.2% (TT), con Fis= 0.13 (p= 0.03); en los controles, la distribución fue de 37.3% (GG), 45.9% (GT) y 16.8% (TT), con Fis=0.04 (p= 0.30) (Tabla 3).

En rs10270569, donde ocurre el cambio C/T, la frecuencia del alelo menor (T) fue de 18.4% en los casos y del 18.9% en los controles (p= 0.93). Los homocigotos CC, heterocigotos CT y homocigotos TT representaron el 67.7%, 27.7% y 4.6% en el grupo de casos, respectivamente; y en el grupo de control estas proporciones fueron 64.1%, 34.1% y 1.8% respectivamente. Se estimó el HWE en el grupo de casos (Fis= 0.07, p= 0.17), y también en el de controles (Fis= -0.11, p= 0.97 ) (Tabla 3).

En el SNP rs11773845 el alelo menor (C) fue encontrado en el 39.1% y 45.9% de los casos y controles, respectivamente (p= 0.047). Entre los casos, las proporciones de homocigotos AA, heterocigotos AC y homocigotos CC fueron de 40.0%, 41.8% y 18.2%, respectivamente. En el grupo de controles, la distribución genotípica de AA/AC/CC fue de 32.3%, 43.6% and 24.1%, en ese orden. En ambos grupos, el valor de Fis fue igual a 0.12 (p= 0.04), sugiriendo un exceso en la frecuencia de heterocigotos (Tabla 3).

La frecuencia del alelo menor (A) en el SNP rs7804372 fue de 24.3% en el grupo de casos y de 27.7% en el grupo de controles (p= 0.28). En los casos, las frecuencias genotípicas de los homocigotos (TT), heterocigotos (TA) y homocigotos AA fueron 59.5%, 32.3% y 8.2%, respectivamente. Esta distribución en el grupo de controles fue de 52.7%, 39.1% y 8.2%, en el mismo orden. El grupo de casos se encontró en HWE con un Fis= 0.12 (p= 0.04), y en los controles con un Fis= 0.02 (p= 0.41) (Tabla 3).

El alelo menor (T) en el SNP rs1049337 fue encontrado en un 29.8% de los casos, y en un 25.5% de los controles (p= 0.17). En los casos, las frecuencias genotípicas fueron de 52.7% (CC), 35.0% (CT) y 12.3% (TT); mientras que en los controles las frecuencias se encontraron en 55.0% (CC), 39.1% (CT) y 5.9% (TT). Se encontró un exceso en la frecuencia de heterocigotos en el grupos de casos (Fis= 0.16, p= 0.01), mientras que en el grupo control se encontró en HWE (Fis= -0.03, p= 0.71) (Tabla 3).

Para evaluar las diferencias en la distribución genotípicas entre los casos y controles, se compararon los homocigotos para el alelo menor mediante un modelo recesivo. De acuerdo con este abordaje, se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre los grupos de casos y controles para el SNP rs1049337 (p <0.05) (Tabla 3).

Discusión

La presente investigación contribuyó con las descripción de variantes comunes en el gen CAV1 en una población genéticamente estratificada de la región caribe, lo cual representa un enfoque inicial para acumular evidencia sobre la relación genotipo/fenotipo entre SNPs en CAV1 y trastornos metabólicos, que han sido previamente encontrados en población hispanoamericana ,.

En el presente estudio, se encontraron diferencias marginales en las frecuencias alélicas y genotípicas, lo que sugiere que hay poca significancia estadística para determinar una asociación genética, sin embargo, no se debe descartar la realización de más investigaciones que permitan esclarecer este vínculo a través de análisis de asociación más profundos. De acuerdo con los resultados de este trabajo, tras realizar la comparación entre los grupos de casos y controles, se observó que el alelo menor T en rs1049337 y los homocigotos TT fueron más frecuentes en el grupo de casos (Tabla 3). Estas diferencias entre los grupos sugieren una tendencia que relaciona variaciones en CAV1 con hipertrigliceridemia en la población adulta, encontrándose el alelo de riesgo en su forma recesiva. En el grupo de casos se encontró un significativo desequilibrio de Hardy-Weinberg (Fis= 0.16, p= 0.01), lo que indica un exceso en la frecuencia de heterocigotos entre estos sujetos, apoyando los hallazgos del modelo recesivo descrito arriba. Otros autores han analizado previamente este SNP en cohortes con enfermedades relacionadas con la obesidad, sin embargo, un modelo dominante mostró que no hubo diferencias en la distribución del genotipo entre sujetos con y sin resistencia a la insulina (p= 0.08) . Otro estudio aplicó un diseño similar para describir la asociación entre hipertrigliceridemia y rs926198, sin embargo, no hubo diferencias en las frecuencias alélicas o genotípicas . Por lo tanto, este trabajo aporta evidencia novedosa acerca de estas particulares variaciones polimórficas y su comportamiento en grupos con hipertrigliceridemia en una población genéticamente estratificada.

Teniendo en cuenta el interesante comportamiento mostrado por rs1049337, las frecuencias alélicas encontradas en este estudio fueron comparadas con los informes anteriores de las poblaciones de referencia, con el fin de brindar una descripción más profunda que pudiera ser útil en análisis posteriores. En este sentido, la frecuencia de los alelos para rs1049337 fue similar a la reportada por el proyecto HapMap para la población de CEU (MAF: 27.6% vs 25.0%) (Tabla 4). A pesar de las similitudes étnicas con MEX (ascendencia mexicana en Los Angeles, California), no fue posible establecer una comparación con muestras actuales de Cartagena de Indias debido a la falta de datos para este SNP en la base de datos del Proyecto HapMap .

Tabla 4

Frecuencias alélicas paras los SNPs en el gen de Caveolina 1 (CAV1) gene de diferentes poblaciones. La población referencia fue tomada del Proyecto HapMap, mientras que los casos y controles representan la muestra del presente estudio.

SNP	Casos	Controles	CEU	MEX	YRI	HCB
rs926198
C	0.280	0.309	0.332	0.184	0.611	0.093
T	0.720	0.691	0.668	0.816	0.389	0.907
rs3779512
G	0.611	0.602	0.593	0.730	0.195	0.895
T	0.389	0.398	0.407	0.270	0.805	0.105
rs10270569
C	0.816	0.811	0.726	0.780	0.732	0.965
T	0.184	0.189	0.274	0.220	0.268	0.035
rs11773845
A	0.609	0.541	0.580	0.750	0.221	0.698
C	0.391	0.459	0.420	0.250	0.779	0.302
rs7804372
A	0.243	0.277	0.270	0.210	0.327	0.221
T	0.757	0.723	0.730	0.790	0.673	0.779
rs1049337
C	0.702	0.745	0.750	-	0.973	0.488
T	0.298	0.255	0.250	-	0.027	0.512

CEU: residentes de Utah con ascendencia del Norte y Occidente de Europa;

MEX: ascendencia mexicana en Los Ángeles, California;

YRI: Yoruba en Ibadan, Nigeria;

HCB: Chinos Han en Beijing, China.

En general, las frecuencias alélicas y las distribuciones de genotipos en esta muestra fueron similares a las encontradas en los grupos con ancestría europea que viven en América del Norte (Tabla 4). De hecho, los hallazgos encontrados en Cartagena de Indias fueron notablemente cercanos a las frecuencias Europeas incluso en SNPs con una alta variación interpoblacional como en el caso de los SNPs rs926198, rs3779512 y rs1049337, lo que sugiere que la ascendencia española es un componente predominante en la población contemporánea de Cartagena de Indias .

Estudios previos han descrito una población mixta compuesta tres subpoblaciones en Cartagena de Indias, donde la ascendencia Europea representa más de la mitad de todos los linajes ,, por lo que las frecuencias genotípica actuales de los SNP en CAV1 se encuentran acorde con la elevada representación de la ascendencia española. En este sentido, es posible que los estudios de asociación genética puedan ser replicados empleando métodos de ajuste simples que requieran un aumento conservador en el poder del estudio o en el tamaño de la muestra. Sin embargo, siguiendo las recomendaciones del consorcio STREGA , la estratificación genética en Cartagena de Indias sigue siendo una cuestión a tener en cuenta que debe ser incluida como un factor de confusión en la ponderación de los procedimientos analíticos.

A pesar de la contribución histórica por parte de los inmigrantes Africanos que fueron transportados forzosamente como esclavos al Caribe Colombiano -, este reciente evento demográfico mostró poca influencia en la distribución genética de los SNPs en CAV1, considerando que las frecuencias alélicas locales se encontraron distantes a las observadas en grupos Africanos de referencia (Tabla 4). Estos resultados sugieren que el flujo genético influenciado por el sexo causado por el predominio social de los grupos Europeos durante el período colonial en América Latina y el Caribe podría ser responsable de algunos de los patrones genéticos actuales de la población ,.

Aunque los resultados del presente estudio han señalado una relación entre los polimorfismos en CAV1 e hipertrigliceridemia, hay algunas limitaciones que deben ser consideradas. En primer lugar, este estudio se llevó a cabo en una población multiétnica, donde la estratificación genética ha sido ampliamente descrita, por lo tanto, el efecto de confundidor debe ser tenido en cuenta análisis posteriores ,. En segundo lugar, el tamaño de los grupos es relativamente pequeño para una completa discriminación de las asociaciones genéticas, por lo que este estudio se limitó principalmente a observaciones descriptivas y comparativas.

Conclusión

Las frecuencias alélicas y genotípicas descritas para los SNPs en CAV1 en una muestra de Cartagena de Indias fueron similares a las observadas en grupos con ascendencia europea. Adicionalmente, las diferencias en las distribuciones alélicas y de genotipos entre los casos y los controles encontradas en este estudio, establecen un precedente para próximos estudios de asociación genética con una más amplia muestra y un más alto rendimiento en los procedimientos analíticos.