[α1-antitrypsin Pittsburg mutations: report of two cases in the same family].

Objective: To analyze the clinical and laboratory abnormalities of two patients with α1-antitrypsin (α1-AT) Pittsburgh in a family and review the literatures.
Methods: Both plasma clotting time and factor activities were performed using clotting or substrate methods. Platelet aggregation was evaluated using an optical aggregometer. The serum protein electrophoresis was performed on Sebia HYDRASYS by using Agarose gel. The exons of α1-AT were amplified by using polymerase chain reaction (PCR) and then sequenced and compared with NCBI GenBank records.
Results: The proband had several ruptures of corpus luteum and bleeding after operation, while her daughter had no bleeding history. Both of them showed prolonged coagulation tests which could not be corrected by mixing with the normal plasma. They also showed low levels of plasma coagulation factors, undetected protein C and S activity and abnormal bands of α1-globulin. The results of gene sequencing demonstrated that they were heterozygous for g.T17132G (p.Met358Arg) mutation of α1-antitrypsin gene (NG_008290.1) . Conclusions: Comparing with the data of previously reported cases, our results confirmed the obvious abnormality of coagulation test and the discrepancy of bleeding tendency of α1-antitrypsin Pittsburgh patients, and suggested that the rupture of corpus luteum would be a specific characteristic in women of child-bearing age.

正常凝血过程受到凝血-抗凝-纤溶系统的精细调节。凝血-纤溶系统中多数酶原以及某些其他酶原都属于丝氨酸蛋白酶，血液中同时存在相应的丝氨酸蛋白酶抑制剂serpins，后者为一类结构上同源的超家族，其中的活性中心能结合并灭活相应的丝氨酸蛋白酶[1]。在serpins超家族中，抗凝血酶是机体抗凝系统的主要成分，反应中心为精氨酸393-丝氨酸，灭活凝血酶和活化因子Ⅹ（FⅩa）、FⅨa与FⅪa[2]。而α1抗胰蛋白酶（α1-AT）的反应中心为甲硫氨酸358-丝氨酸，能抑制弹性蛋白酶、胰蛋白酶等多种丝氨酸蛋白酶的活性，其主要功能是对抗由多形核白细胞吞噬作用时释放的溶酶体蛋白水解酶[3]。α1-AT与抗凝血酶具有serpin的共同结构，但作用底物及功能不同[4]。当α1-AT活性中心358位上的丝氨酸（Ser）被精氨酸（Arg）取代后，α1-AT的抗蛋白酶活性丧失，表现为强烈的抗凝血酶活性而导致出血倾向，称为α1-AT Pittsburg突变[5]–[6]。α1-AT Pittsburg突变极为罕见，至今国际上仅报道了5个家系的6例患者[5],[7]–[10]。患者的出血程度有明显差异，凝血改变复杂，很容易误诊或漏诊。笔者报道同一家系的2例α1-AT Pitssburg突变患者，并对有关文献进行复习。

病例资料

1．病例资料：先证者，女，34岁，幼时偶有齿龈出血，12岁时左腿曾出现血肿，经“止血药物”处理后血肿消退，24岁行剖宫产手术，术后出血不止，经输血后行子宫切除术，术后2个月切口愈合。27岁时因黄体破裂致腹腔出血，经输血后手术切除。其后又两次发生黄体破裂出血，经血浆输注与注射重组人凝血因子Ⅶa后得到控制。患者肝肾功能正常，抗核抗体、抗磷脂抗体阴性，无消化道出血史，月经量不多。患者10岁女儿生长发育正常，无出血性疾病既往史。家系图见图1。

图1

患者家系图

2．凝血指标检测：先证者及其女儿APTT及凝血酶时间（TT）明显延长，PT轻度延长，不能被正常血浆、血小板磷脂、甲苯胺蓝及鱼精蛋白纠正。内源性凝血因子Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅺ、Ⅻ活性降低，而凝血因子Ⅱ、Ⅴ活性及纤维蛋白原浓度均异常，VWF抗原含量正常，蛋白C、蛋白S活性明显降低（表1），而先证者父母及兄长无凝血检测正常。腺苷二磷酸（ADP）、胶原、瑞斯托霉素及U46619诱导的血小板聚集正常（80%~90%），1 U/ml凝血酶诱导的血小板聚集降低，但凝血酶浓度增加至4 U/ml时，血小板聚集恢复至48%。

表1

同一家系2例α1抗胰蛋白酶Pittsburg突变患者凝血指标检测结果

受试者	APTT（s）	PT（s）	TT（s）	Fig（g/L）	FⅫ∶C（%）	FⅪ∶C（%）	FⅧ∶C（%）	FⅨ∶C（%）	FⅩ∶C（%）	FⅤ∶C（%）	FⅦ∶C（%）	FⅡ∶C（%）	VWF（%）	PC（%）	PS（%）
先证者	120	20.4	120	2.90	13.6	2.1	39.1	6.0	12.5	89.4	64.2	36.5	185	0	0
女儿	120	18.4	120	4.39	19.0	2.3	34.0	7.3	15.0	88.0	61.0	51.0	146	0	0
正常参考值	28～40	11.0～14.5	14～21	2.00～5.00	50.0～150.0	50.0～150.0	50.0～150.0	50.0～150.0	50.0～150.0	50.0～150.0	50.0～150.0	50.0～150.0	50～150	50～150	50～150

注：APTT：部分激活的凝血活酶时间；PT：凝血酶原时间；TT：凝血酶时间；Fig：纤维蛋白原；VWF：血管病性血友病因子；PC：蛋白C；PS：蛋白S。FⅡ∶C、FⅤ∶C、FⅦ∶C、FⅧ∶C、FⅨ∶C、FⅩ∶C、FⅪ∶C、FⅫ∶C分别为凝血因子Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅺ、Ⅻ活性

3．血清蛋白电泳：先证者及其女儿血清蛋白电泳α1蛋白总量分别为2.6%和3.1%（正常参考值1.0%~3.2%）。但电泳图见明显异常：血清白蛋白后有拖尾条带，α1球蛋白条带较弱且模糊分散，扫描峰图可见α1球蛋白峰平缓（图2）。

图2

α1-抗胰蛋白酶Pittsburg突变患者血清蛋白电泳检测结果

4．α1-AT基因测序：提取患者及家属的外周血细胞基因组DNA，双脱氧链终止法测序分析。结果显示患者及其女儿的α1-AT基因（NG_008290.1）均存在g.T17132G（p.Met358Arg）杂合突变，突变导致358位Met突变为Arg（图3），先证者父母及兄长未检测到该基因突变。

图3

α1抗胰蛋白酶基因g.T17132G（p.Met358Arg）杂合突变

讨论及文献复习

本家系先证者有原因不明的血肿、术后出血不止和多次黄体破裂病史，凝血检查发现APTT、TT明显延长，PT轻度延长，诊断时需与纤维蛋白原异常相鉴别。后者亦有出血病史，APTT、TT及PT均有延长，但可被正常人血浆1∶1纠正，进一步检查可发现纤维蛋白原含量降低。而本家系先证者纤维蛋白原含量正常，APTT、TT延长并不被正常血浆纠正，说明血浆中存在抑制物。另一需要鉴别的情况是肝素的影响，肝素也可引起APTT与TT延长，正常血浆不能纠正，但患者无肝素用药史。在少数恶性浆细胞病患者中肝素类物质增多，导致出血及APTT与PT延长[11]，这种可能性亦可排除。此外，血浆中未检测到抗核抗体、抗磷脂抗体，可排除获得性抑制物存在。凝血因子Ⅻ、Ⅺ、Ⅸ、Ⅹ活性均低于20%（尤其凝血因子Ⅺ活性只有2%）。ADP、胶原、瑞斯托霉素及U46619诱导的血小板聚集功能正常，1 U/ml凝血酶诱导的血小板聚集功能降低，但凝血酶浓度增加至4 U/ml时，血小板功能恢复至48%。血清蛋白电泳α1球蛋白含量虽正常，但条带极弱且模糊分散，血清白蛋白后有拖尾条带。测序分析发现患者α1-AT基因均存在g.T17132G（p.Met358Arg），致使α1-AT蛋白具有强烈的抗凝血酶活性。所有这些证据均支持先证者α1-AT Pittsburg突变诊断。

患者女儿也具有同样的凝血异常，检测α1-AT基因证实也具有g.T17132G（p.Met358Arg）突变，这些异常说明女儿亦为α1-AT Pittsburg突变。而先证者父母具有正常的凝血表型，亦不携带有基因突变。说明致病突变自然发生于先证者出生前的胚胎形成早期，而后遗传于女儿，符合染色体显性遗传规律。我们在血清蛋白电泳分析中未见文献报道的α1球蛋白条带分为A、B、C三个条带[6]，可能与检测方法不同有关。

α1-AT Pittsburg突变极为罕见，至今国内外仅有4例男性和2例女性报道。1978年Lewis等[6]首次发现α1-AT 358位上的甲硫氨酸突变为精氨酸后，其抗凝血酶活性增强1 000倍，与肝素辅助下的抗凝血酶作用效果相同[12]，患者自幼反复大出血50余次，并在14岁时死于腹腔大出血[5]，该病被命名为α1-AT Pittsburg突变。1992年Vidaud等[7]报告第2例患者，与首例不同的是该患者出血不明显且具有较低的蛋白C活性，因α1-AT Pittsburg突变蛋白结合和清除蛋白C的能力增强4 400倍[13]，导致蛋白C抗凝活性的相对缺乏而减轻出血倾向，由此认为患者出血的异质性主要是血浆蛋白C水平不同所致[14]。2009年北京协和医院报告了同患该病的父女患者[8]。结合本组2例母女患者，直接证实了该病为常染色体显性遗传，不受性别的影响。最近国内外相继报道了2例患者出血倾向差异性很大，8岁男性患儿反复发现皮肤关节出血，而女性患儿只表现为1次外伤后血肿[9]–[10]。

综合本组2例患者病例资料并复习以往文献报道，该病临床特征如下：①所有患者的凝血检测结果极其相似，APTT及TT明显延长，PT轻度延长，不能被正常血浆纠正，内源性凝血因子活性均降低。研究证实α1-AT Pittsburg突变能抑制前激肽酶、凝血因子Ⅺ及Ⅻ活性[15]，而凝血因子Ⅷ、Ⅸ及Ⅹ活性测定是通过内源性途径凝固时间测定，故其活性也相应降低。②除Lewis等[6]报告的第1例患者外，其他病例的蛋白C活性均极低，而患者的出血情况差异很大，因此我们推测可能有其他原因影响出血的发生。如最近文献报道突变的α1-AT Pittsburg突变蛋白能抑制组织型纤溶酶原激活物及纤溶酶活性[10]，可能维持凝血系统在较低的水平保持平衡，使患者不易发生出血。

此外，本例先证者与文献[8]报道的1例女性育龄期患者都发生反复黄体破裂出血。α1-AT是一个急性反应蛋白，在炎症和创伤时该蛋白浓度明显升高[16]。有文献曾报道α1-AT浓度在女性排卵期升高，并在黄体期达到顶峰[17]。这可能增加α1-AT Pittsburg突变女性患者育龄期黄体破裂的风险。血浆α1-AT怀孕时开始增加，分娩前达到高峰，并持续到产后[18]。

总之，α1-AT Pittsburg突变患者临床极其少见，很容易造成误诊和漏诊，应注意排除肝素类物质对凝血的影响。对于经常血肿形成尤其是伴有黄体破裂的女性，如发现明显的凝血异常、血清蛋白电泳可见α1条带弥散，需进行α1-AT基因检测，以明确诊断。目前对于α1-AT Pittsburg突变患者治疗手段有限，应避免外伤和有创性操作，急性出血期可进行血浆输注、血浆置换，也可给予抗纤溶药物或重组人凝血因子Ⅶa。