Immunotherapy and gene therapy as novel treatments for cancer.

The immune system interacts closely with tumors during the disease development and progression to metastasis. The complex communication between the immune system and the tumor cells can prevent or promote tumor growth. New therapeutic approaches harnessing protective immunological mechanisms have recently shown very promising results. This is performed by blocking inhibitory signals or by activating immunological effector cells directly. Immune checkpoint blockade with monoclonal antibodies directed against the inhibitory immune receptors CTLA-4 and PD-1 has emerged as a successful treatment approach for patients with advanced melanoma. Ipilimumab is an anti-CTLA-4 antibody which demonstrated good results when administered to patients with melanoma. Gene therapy has also shown promising results in clinical trials. Particularly, Herpes simplex virus (HSV)-mediated delivery of the HSV thymidine kinase (TK) gene to tumor cells in combination with ganciclovir (GCV) may provide an effective suicide gene therapy for destruction of glioblastomas, prostate tumors and other neoplasias by recruiting tumor-infiltrating lymphocytes into the tumor. The development of new treatment strategies or combination of available innovative therapies to improve cell cytotoxic T lymphocytes trafficking into the tumor mass and the production of inhibitory molecules blocking tumor tissue immune-tolerance are crucial to improve the efficacy of cancer therapy.

Introduction

Cancer progression is accompanied by a strong suppression of the immune system (IS), which interferes with effective antitumor response and diminishes tumor eradication . The immune-surveillance evasion occurs, in part, due to the fact that the tumor microenvironment inhibits T cell proliferation and attracts immune-suppressor cells .

A better knowledge of the interaction between the tumor and the IS has allowed the development of specific therapies designed to improve patient´s immune response. Tumor immunotherapy has two strategies: attack the tumor directly or activate the IS by the use of cell therapies, like stimulatory agonists or the immune-checkpoint blockade ; The latter has demonstrated a potential antitumoral immune response, proving to be a promising therapy . Another option is the use of a different approach: gene therapy, which allows modifying tumor gene expression for therapeutic purposes. For example, tumor cell transduction with "suicide genes" is a largely investigated strategy of anti-neoplastic gene therapy .

This article reviews the use of immune-checkpoint blockade and suicide gene therapy as different alternatives for cancer therapy and analyzes the possible synergic effects that can be reach with the combination of this both therapies.

1. Cancer and immune system

The IS interacts intimately with the tumors during the process of disease development and its progression to metastasis (tumoral immunology) . It also respond to cancer by recognizing and eliminating the abnormal cells (immuno-surveillance) . However, some resistant cells can evade this control (immunoediting) reducing their immunogenicity and promoting malignant growth .

Tumor cells change their surface markers recurrently.. For example, they express tumor-associated antigens (TAA) or reduce the expression of the major histocompatibility complex (MHC) class I. This can lead to the activation of the innate immune response cells, such as natural killer (NK) cells . Macrophages and neutrophils may attack the tumor cells and stimulate the cytotoxic T lymphocytes (CTL), the antigen-presenting cell (APC) and the NK cells. In contrast, inflammatory cells produce growth factors and angiogenesis-stimulating growth factors promoting tumor growht .

In the adaptive response, the processed TAA are presented by the MHC class I and II molecules from APCs to the specific receptors of T CD8+ and CD4+ cells respectively for their activation , . The CD8+ T lymphocytes are considered the main antitumor effector cells . Once activated, they mediate the lysis of tumor cells . Among the CD4+ T cells, the Th1 are responsible for cellular immunity: they secrete interleukine (IL)-2, TNFα and interpheron-γ (IFN-γ), promote the macrophage´s cytotoxic activity and induce the overexpression of MHC I and III in the APC. In contrast, the Th2 cells express IL-4, -5, -10 and -13, inducing clonal anergy, enhancing humoral immunity and regulating macrophage activity . On the other hand, the regulatory T (Treg) cells help to reduce inflammation by the production of TGF-β, IL-35 e IL-10 . The tumor cells can secrete chemokines as CCL22 which recruit Treg cells to supress the effector function of T cells and decreasing the immune response .

Tumors can also deregulate the IS by altering a complex balance between activating and inhibitory signals (checkpoints) in different pathways that regulate the function of T cells .

2. Regulatory T cells

Treg cells are relevant to the maintenance of the immunological homeostasis: they preserve the tolerance to self-antigens, prevent the autoimmune diseases, modulate the development of an immune response and favor the escape of tumor cells from immune control , . The best-characterized subpopulation expresses CD4, CD25 and Foxp3. Treg can suppress different cells such as CD4+ and CD8+ T lymphocytes, natural killer T cells, dendritic cells (DC), monocytes/macrophages, B lymphocytes and NK cells .

Because Treg suppresses the immune response against self-antigens , , it is postulated that TAA may induce an increase in the number of intratumoral Treg cells in several neoplasms, including colorectal cancer (CRC), facilitating tumor immunotolerance , . The accumulation of Treg in tumors is explained by several mechanisms, such as the conversion of CD4+ T cells to Treg in response to membrane-bound TGF-β, the recruitment of Tregs by chemokines as CCL17, CCL22 and CCL28 and tumor secretion of VEGF-A in response to hypoxia, which inhibits DC maturation. Immature DCs express TGF-β favoring the conversion of CD4 + T cells to Treg .

The most frequents TAA are own-antigens subexpressed in normal cells but highly expressed in tumor cells . One of the best known is the carcinoembryonic antigen (CEA) which is highly expressed in CRC ; the CEA is recognized as a self-antigen by the Tregs , causing a poor immune response to tumor cells. In ovarian, breast, pancreatic, stomach and liver cancers, an increase in Treg lymphocytes in the tumor is associated with a worse prognosis . The use of these cells as targets may benefit the therapeutic strategies against cancer .

2.1 Action mechanisms of the Treg cells

The Treg lymphocytes have four main mechanisms of action to regulate the immune response Fig. 1. The first is suppression by inhibitory cytokines, which include IL-3, IL-10 and TGF-β , . The second is suppression by cytolysis. Tregs may induce cytolysis of B cells through the production of granzyme B. These cells may also exert a cytolytic effect to CD8+ T lymphocytes and NK cells by granzyme-B-dependent and perforin-dependent killing mechanisms, or by the aTRAIL-DR5 - pathway - . The third mechanism is the suppression by metabolic alterations that affect the activity of molecules such as CD25 (IL-2 receptor), cyclic AMP (cAMP), CD39, CD73 and adenosine 2A receptor (A2AR) . The fourth mechanism consists on the suppression of the maturation and/or function of DC. This includes pathways such as the lymphocyte-activation gene-3 (LAG3) or the interaction between cytotoxic T-lymphocyte associated protein 4 (CTLA-4) and CD80/86, which induces the enzyme indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO), an immunosuppressive molecule generated by DC , . The blocking of these immunosuppressive mechanisms could increase the function of T cells and generate a more effective clinical response , .

Figure 1

Action mechanism of Treg cells. A. Production of inhibitory cytokines such as IL-10, IL-35, and TGF-β. B. The inhibition by cytolysis includes dependent mechanism of granzyme A or granzyme B as well as perforin dependent mechanisms. C. A metabolic disruption can occur by Treg cells due an overproduction of CD25, capturing IL-2; inhibition by cAMP or immunosuppression through the adenosine 2A receptor. D. The function and maturation of the DC can be modulated by the LAG3, CTLA-4 or the enzyme IDO pathways (Modified by Vignali et al. 2008) .

2.2 Regulation of immune-checkpoints by Treg cells

In the case of T cells, the amplitude and quality of the response after recognition of an antigen is regulated by a balance between costimulatory and inhibitory signals (immune-checkpoint) . In order to increase the effector function of tumor-infiltrating T cells, the immunosuppressive signals can be inhibited. There has been a greater clinical success with this strategy in the treatment of several types of cancer, such as melanoma and lung cancer . Some molecules that act as immune-checkpoints, such as CTLA-4 receptor and programmed cell death protein 1 (PD-1), are expressed on Treg lymphocytes and tumor-infiltrating effector T cells .

2.3 Cancer immune-checkpoints

As previously mentioned, the activation and inhibition of different receptors regulate the balance between immune response and immunotolerance , , which is important for complete activation and effector function of T cells . The antibody therapy against negative immunological regulators has shown success in antineoplastic therapy , , because it increases the potential of the antitumor immune response.

It has been demonstrated that tumors use some immunological control pathways as a mechanism of immune resistance , e.g. increasing the expression of the checkpoint proteins decreases the function of T cells. Examples of immunological checkpoints are PD-1, CTLA-4, LAG-3, T cell immunoglobulin and mucin domain-containing protein 3 (TIM-3), among others .

Antitumor antibodies that block immune-checkpoints are directed against lymphocyte receptors or their ligands Table 1. Two immune-checkpoints widely studied in the clinical context of cancer immunotherapy are CTLA-4 and PD-1. Both are inhibitory receptors that regulate the immune response . Although inhibition of control points seems to be successful in the treatment of some cancers, adverse events are associated, in particular autoimmune responses affecting organs such as the colon, skin, some endocrine glands, liver, etc .

Table 1

Development of pharmacological agents directed against immune-checkpoints signaling pathways , .

Target	Biological function	Antibodie	Clinical situation
CTLA-4	Inhibitory receptor	Ipilimumab	Approved by the FDA for melanoma. Phase IV trials for melanoma and metastatic renal cell cancer. Phase III trials for stomach / esophagus cancer, small cell and non-small cell lung cancer, renal carcinoma, pleural mesothelioma, metastatic squamous cell carcinoma of the head and neck, prostate cancer, ocular melanoma.
		Tremelimumab	Tested in phase III trials for melanoma, head and neck cancer, small and non-small cell lung cancer, urothelial cancer.
PD-1	Inhibitory receptor	Nivolumab	FDA approved for melanoma, renal carcinoma, non-small cell lung cancer. Phase IV trials for advanced metastatic renal carcinoma and metastatic melanoma. Phase III trials for small cell and non-small cell lung cancer, stomach/esophagus cancer, melanoma, mesothelioma, hepatocellular carcinoma, multiple myeloma, urothelial cancer, gastric cancer.
		Pembrolizumab	FDA approved for melanoma, non-small cell lung cancer. Phase III trials for melanoma and small and non-small cell lung cancer.
		Pidilizumab	Phase I/II trials for lymphoma, multiple myeloma, pancreatic cancer.
PD-L1	Programmed death-ligand 1	BMS-936559	Phase I trials for melanoma.
		Atezolizumab	Phase III trials for small cell and non-small cell lung cancer, triple negative breast cancer, urinary tract cancer, renal cancer, ovarian cancer, colorectal cancer, melanoma.
LAG3	Inhibitory receptor	IMP321	Phase I / II trials for breast adenocarcinoma, renal carcinoma, melanoma, pancreatic neoplasms.
B7-H3	Inhibitory ligand	Enoblituzumab	Phase I trials for various types of cancer.

CTLA-4: Cytotoxic T-Lymphocyte Antigen 4;

LAG3: Lymphocyte-activation gene 3;

PD-1: Programmed cell death protein 1;

PD-L1: Programmed death-ligand 1.

2.4 CTLA-4

The CTLA-4 receptor is the first immune-checkpoint used as clinical target . CTLA-4 is a member of the immunoglobulin superfamily CD28:B7. It is normally expressed at low levels on the surface of effector T cells and Treg cells. Its function is to regulate the amplitude of the early stages activation of these kinds of cells . To activate a T cell, three signals are required: the antigen binding to the T cell receptor (TCR), the interaction of MHC (in human: human leukocyte antigen, HLA) with CD8 or CD4 T cell receptors, and the generation of a costimulatory signal generated by the binding of CD80(B7) to CD28 , . Once this is completed, the CD28 pathway amplifies the TCR signaling to activate T cell proliferation. CD28 and CTLA-4 share the same ligands: CD80 (B7.1) and CD86 (B7.2), however these ligands bind to CTLA-4 with higher affinity , , because of this, CTLA-4 counteracts the costimulatory activity of CD28 , .

CTLA-4 is crucial in T-cell activation. This is demonstrated by the lethal phenotype of the hyperactivated immune system in CTLA-4 knockout mice . Although CTLA-4 is expressed in activated effector CD8+ T cells, its most important physiological function is through different effects on CD4+ T cells: the activity decrease of helper T cells (Th1) and the enhancing of the immunosuppressive activity of Treg cells .

It has been proposed that CTLA-4 expression attenuates the activation of T cells by a cascade of inhibitory signals Fig. 2, as well as by its competition with CD28 . Some studies suggest that the activation of protein-tyrosine phosphatase (SHP2) and protein phosphatase 2A (PP2A) counteracts the kinase signals induced by the TCR and CD28 . Other mechanisms, including Treg cell expansion, produce immunosuppressive cytokines such as TGF-β and the enzyme IDO .

Figure 2

Signaling model of CD28 and CTLA-4. A. When T cell stimulation occurs, the intracellular tyrosine residues of CD28 are phosphorylated, and this attracts kinase 3 phosphatidylinositol (PI3K). The activation of PI3K, which includes phosphorylation of phosphatidylinositol (PI) to phosphatidylinositol 3 phosphate (PIP3), can promote the activation of protein kinase B (PKB/Akt), followed by the nuclear factor-kB (NF-kB ), resulting in over-regulation of the BCL-XL gene that favors the survival of T cells. The Activation of Akt can also promote the production of interleukin 2 (IL-2). B. The HLA-peptide complex is recognized by the TCR and by its CD4 or CD8 co-receptor, this activates the Lck kinase, which phosphorylating the CD3 complex. This leads to the recruitment and phosphorylation of the zeta-chain associated protein kinase (ZAP70), which initiates a signaling cascade that activates the phospholipase Cγ1 (PLCγ1) and RAC. PLCγ1 promotes calcium mobilization and activation of the RAS pathway. The combination of these signaling cascades promotes the activation of transcription factors and cell proliferation. C. CTLA-4 suppresses the activation and function of T cells by recruitment of the protein tyrosine phosphatase (SHP-2) and the serine/threonine phosphatase 2A protein (PP2A). These phosphatases dephosphorylate several signaling points that are essential for the co-stimulation of T cells (Modified from Alegre ML et al., 2001, Chen et al., 2013 & Nirschl et al., 2015) , , .

CTLA-4 blockade can affect the intratumoral immune response by inactivating Treg tumor-infiltrating lymphocytes which can cause an increase in the Th1-dependent immune response . It has also been observed that its blockade enhances the production of specific antibodies against TAA, as well as a CD4+ cellular and CD8+ specific antigen response .

2.5 PD-1

PD-1 is also a key protein in immune regulation , it acts as an immune-checkpoint and immune-therapeutic target. It is a co-inhibitory molecule expressed in stimulated T cells, as well as in Treg lymphocytes, B-activated cells and NK cells , . PD-1 appears to play a crucial role in the modulation of T cell activity through interaction with its PD-L1 and PD-L2 ligands . PD-L1 is expressed in lymphoid and non-lymphoid tissues, it is activated especially in APC, DC, macrophages and B cells, but is also expressed in tumor cells that abrogate the lymphocyte response. Expression of this ligand in tumor tissue is recognized by effector T lymphocytes, which restrict their oncolytic activity to induce cancer immunotolerance . PD-L2 is only expressed in the APC .

After binding to its ligand, PD-1 suppresses T cell activation by recruiting SHP-2, which dephosphorylates and inactivates Zap70, an important component in the TCR signaling pathway. As result, PD-1 inhibits T-cell proliferation and its effector functions, such as the production of IFN-γ . PD-1 blockade may enhance antineoplastic immune responses by decreasing the number and suppressive activity of intratumoral Treg cells , in addition to increasing the proliferation of effector T cells (CD8+/HLA-DR+/Ki67+T cells), interferon-inducible T-cell alpha chemoattractant (I-TAC), IFN-γ and IL-18 .

2.6 Interacciones entre CTLA-4 y PD-1

Although CTLA-4 and PD-1 negatively regulate the activation of T cells by blocking the CD3/CD28 pathway, these receptors have different roles . CTLA-4 acts during the beginning of naive and memory T cells activation in lymphoid tissue, while PD-1 operates during the effector phase of T cells Fig. 3 , . The interaction of PD-1 with its PD-L1 ligand occurs predominantly in peripheral tissues, including tumor tissue , , .

Figure 3

CTLA-4 and PD-1 modulate different aspects of T cell response. A) CTLA-4 is overexpressed after activation of a naïve or memory T cell in the lymphoid tissue by recognition of a specific antigen presented in the HLA context, producing a decrease in the effector function (early activation phase). The Blocking of CTLA-4 with a specific antibody would allow the signaling pathway by the CD28 receptor, contributing to the proliferation and activation of T cells. B) PD-1 is expressed primarily in memory T cells of peripheral tissues, this pathway ensures the protection of tissues from collateral damage during an inflammatory response. Tumor cells overexpress PD-1 (PD-L1 and PD-L2) ligands to evade the T-cell response against the tumor. In the same way, the use of antibodies for block the PD-1 pathway would contribute to the development of a more potent immune response. (Modified from Ott et al 2013) .

There are preclinical studies that propose a combined therapy using antibodies for the blockade of both pathways simultaneously (anti-CTLA-4 plus anti-PD-1) . This dual strategy would enhance the antitumor response but it can also be expected to be more toxic .

2.7 Clinical use of immune-checkpoint blockade therapy

Ipilimumab (anti-CTLA-4) is a recombinant human monoclonal antibody (IgG1 kappa immunoglobulin) approved by the Food and Drug Administration (FDA) in 2011 for the treatment of metastatic melanoma. The human monoclonal antibody nivolumab (anti-PD-1) is an IgG4 kappa immunoglobulin authorized in Japan in 2014 for the treatment of unresectable melanoma. The FDA approved the humanized monoclonal antibody pembrolizumab (IgG4 kappa immunoglobulin) against PD-1 in September 2014 and the nivolumab in December 2014, both for the treatment of advanced melanoma. In March 2015 the FDA approved nivolumab for the treatment of lung cancer .

There are phase II studies proving increased survival in patients with metastatic melanoma who received ipilimumab , . In one study, an average survival of 10.1 months was observed in patients using ipilimumab versus 6.4 months in patients using a control peptide vaccine ; a 5-year survival rate of 18.2% was also observed in patients with advanced melanoma treated with ipilimumab+dacarbazine versus 8.8% in patients treated with placebo+dacarbazine . Two phase III studies of nivolumab showed clear benefits of this agent against metastatic melanoma compared to chemotherapy, obtaining a better survival rate at one year . In July 2017, the Bristol-Myers Squibb biopharmaceutical announced that the FDA expanded the use of intravenously administered ipilimumab as a treatment for non-extirpable metastatic melanoma in pediatric patients of 12 years or older. In addition, in August 2017, it was announced that nivolumab was approved by the FDA for the treatment of adult and pediatric patients (over 12 years of age) with metastatic colorectal cancer who present high microsatellite instability (MSI-H) or deficiencies in the repair of damaged DNA, and who had received a treatment with fluoropyrimidines, oxaliplatin, and irinotecan. The pembrolizumab and nivolumab (FDA approved) were compared with ipilimumab, demonstrating a higher response and lower toxicity . In addition, it was observed that PD-1 blockade had activity in patients who did not respond to CTLA-4 blockade . It has been proposed that agents which inhibit PD-1 are more effective than those that inhibit PD-L1 directly (e.g. human monoclonal antibody BMS-936559) because they can inhibit both ligands (PD-L1 and PD-L2) simultaneously .

In 2015, the safety and efficacy of nivolumab and ipilimumab were assessed separately and compared vs nivolumab+ipilimimab as a novel combined therapy (recorded as CheckMate 067 at ClinicalTrials.gov). They observed a survival of 11.4 months for the combined treatment versus 6.9 months for treatment with nivolumab alone and 2.9 months for ipilimumab alone . Although an increase of some months in the survival rate is observed, the immunotherapy has an exorbitant cost: 2015, the average cost per mg of nivolumab was estimated to $28.7, for nivolumab, $51.79 for pembrolizumab and $157.46 for ipilimumab. It should be noted that the administration dosages range from 2 mg/kg to 10 mg/kg every 3 weeks approximately. It is estimated that the cost of a patient's treatment with CheckMate 067 could reach the $295.56; the treatment with nivolumab is estimating in $103,220 and the ipilimumab in $158,252. Taking this into account, for a 75 kg patient with melanoma who wants a treatment with 26 of the highest and most frequent doses of pembrolizumab, the cost would be $ 1,009,944. If this treatment were provided to each of the 589,430 patients who die from melanoma cancer annually, the cost for the health systems would be $ 173,881,850,000. This is simply unsustainable. As in many other areas of the pharmacoeconomics of emerging drugs for chronic diseases, this represents a challenge that must be resolved by considering a balance between the demands of the community and the health systems versus the commercial interests of the entrepreneurs of the pharmaceutical industries .

2.8 Adverse effects

The use of ipilimumab and tremelimumab has been associated with adverse events affecting the skin (pruritus, vitiligo), intestine (diarrhea and colitis), liver (hepatitis and elevated liver enzymes) and endocrine glands (hypothyroidism, thyroidism) 36. Compared to CTLA-4 blockade, PD-1 or PD-L1 blockade may have similar effects, but they appear to be less common 24,36. Although good results have been shown in the use of these therapies, they are not sufficiently effective to use them alone 35, which is why their combination with other strategies is necessary. Gene therapy could be an interesting alternative for combined therapy.

3. Suicide gene therapy

The selectivity of the antineoplastic agents is limited because cancer cells are resistant to apoptosis, cell cycle arrest, and senescence. Besides that, some resistant cells subpopulations may emerge in response to the neoplastic agent 41. The application of gene therapy could improve the selectivity of immune-checkpoint directed therapies and facilitate their access to the tumor tissue 42. Suicide therapy has two alternatives: toxin gene therapy, in which genes for a toxic protein are transduced into tumor cells, or enzyme-activating prodrug therapy. The latter has two steps: initially, a gene of a heterologous enzyme is directed and delivered to the tumor for its expression. Subsequently, a prodrug that can become a cytotoxic drug by the heterologous enzyme is administered 43. Due to its mechanism of action, this therapy triggers an anti-tumor immunoreactivity, as will be explained below.

The herpes simplex virus-thymidine kinase/ganciclovir (HSV-TK/GCV) system is selective for tumor cells because it affects the active replication of DNA, which is one characteristic of tumor cells. This activity is decreased in the surrounding stromal cells, many of which are in the quiescent state 42,43.

3.1 Enzymes and prodrugs used in suicide gene therapy systems

The enzymes used in suicide gene therapy are divided into two groups. The first one includes enzymes of non-mammalian origin (e.g. HSV-TK). The second comprises enzymes of human origin that are absent or subexpressed in tumor cells . Several enzyme-prodrug systems have been developed for suicide gene therapy, such as the carboxyl esterase (CE)/irinotecan, carboxypeptidase A (CPA)/MTX-a-peptide, carboxypeptidase G2 (CPG2)/CMDA and HSV-TK/GCV. The HSV-TK/GCV system is the most studied and has progressed successfully to advanced phases in clinical trials, which is explained in more detail below , .

3.2 HSV-TK/GCV system

The HSV-TK/GCV system uses ganciclovir and its analogs as prodrugs. These are analogs of purine nucleosides , . Systemic administration of GCV induces selective apoptosis in cells transduced with the TK gene. HSV-TK is able to phosphorylate the GCV, turning it into monophosphorylated GCV, which is subsequently tri-phosphorylated by cellular kinases. This product blocks the DNA replication, causing its fragmentation and apoptosis , Fig. 4.

Figure 4

Comparative metabolism of the thymidine and ganciclovir by Herpes simplex virus thymidine kinase and cellular kinases. A. Thymidine metabolism. Typically, thymidine kinase enzymes can phosphorylate the thymidine to thymidine triphosphate, for further integration into DNA. B. Metabolism of ganciclovir. The HSV thymidine kinase, unlike to human thymidine kinase, is able to phosphorylate ganciclovir to convert to GCV-P, once this happened, the cellular kinases can phosphorylate it for later integration into the DNA, which leads to the arrest of its synthesis and therefore, the cell death.

The HSV-TK/GCV system has been tested in pre-clinical , and clinical studies against several types of cancer, such as prostate , , brain - , ovarian , , bladder , , cervix , pancreatic , and liver cancer , among others. Several phase I and II clinical trials have demonstrated the safety and efficacy of this therapy in humans , . Other studies have shown that HSV-TK gene transduction is safer and more effective with adenoviral replication deficient vectors compared to retroviral vectors , .

3.3 Immune response induced by the AdV-TK/GCV system

It has been shown that HSV-TK/GCV therapy induces anti-tumor immunity , and even regression of brain tumors in immunocompetent rats and neuroblastoma in a murine model , . In the treated tumors, a marked infiltration of inflammatory cells, predominantly CD4+ and CD8+, is observed. This suggests that the HSV-TK/GCV system stimulates the antitumor immune response , . The overexpression of different costimulatory molecules such B7.1 and B7.2, intracellular adhesion molecules (ICAM) and MHC molecules, and the attraction and activation of APCs are also observed in tumor tissue , .

During the HSV-TK/GCV tumor treatment, the levels of some cytokines that stimulate APCs and T cells, such as IL-2, IL-12, IFNγ, TNFα and GM-CSF, are increased; whereas inhibitory cytokines like IL- 4, IL-6 and IL-10 are not stimulated . The increase in the immune response has been demonstrated by higher levels of circulating active CD8 cells and elevated IL-12 in serum , , a key mediator of the cellular immune response against viral infections and malignant tumors , . Interestingly, NK cell levels have been linked to IL-12 levels, because NK cells are one of the targets of this interleukin , .

The viral TK protein also functions as a superantigen, stimulating a highly immunogenic tumor microenvironment . This protein induces the release and presentation of TAA which can be recognized by T lymphocytes and therefore generate an adaptive immune response. This can lead to tumor cell cytolysis and posterior recruitment of APCs . The activated APCs induce T cells proliferation by the secretion of IL-2 and IL-12 at the tumor site. All these events are desirable to get a powerful anti-tumor effect , . However, a contradictory observation should be considered. A clinical trial of HSV-TK/GCV as neoadjuvant therapy for pancreatic carcinoma using an adenoviral vector showed increased intratumoral levels of PD-L1 in samples analyzed after surgical resection. This event may decrease the effector T cell response but may be reversed with co-administration of PD-1 / PD-L1 inhibitors .

The viral vector-mediated HSV-TK/GCV therapy has shown effective progression to phase III in some clinical trials when it was used alone or in combination with chemotherapy or radiation for prostate cancer, hepatocellular carcinoma, or glioblastoma multiforme , , .

3.4 Adverse effects

Despite the promising results, there are some disadvantages. The replication-deficient adenoviral vectors trigger a strong humoral and cellular immune response that limits its effectiveness to a period of two to three weeks. Regardless these vectors may be useful for therapeutic applications where a very high level of transient expression of the therapeutic gene is desirable, as would occur in cancer gene therapy . On the other hand, the expression of the TK protein is not tumor specific. An interesting option is the use of adenoviruses that prefer their replication in tumor cells using a specific promoter .

Phase I and II studies have shown some side effects, such as mild fever, neutropenia, headache, thrombocytopenia, and impaired hepatic enzymes, among others. Fortunately, these events are transient and easy to tolerate , , .

4. Combined therapy as a new treatment

The combined treatment of gene therapy and immunotherapy is an attractive option that recent advances in cancer therapeutics have made possible. The use of a suicide gene therapy system would lead to the sudden and massive presentation of TAA over a sustained period of weeks or months. It is reasonable to think that this therapy can be synergistically enhanced by its combination with a systemically administered immune-checkpoint inhibitor drug such as those described in this review. To explain this idea in a better way, it could be assumed that a tumor treated with HSV-TK/GCV will generate sudden and massive exposure of TAA to the immune system, which in other conditions wouldn't generate an effective immunoreactivity due to the decrease of MCH I and costimulating molecules and by the induction of Treg. This event would trigger the attraction and activation of APC and some TAA could be expected to induce an increase in the number of intratumoral Treg lymphocytes (even before the intervention with gene therapy), leading to an immunosuppressive environment. In order to prevent this immunological phenomenon and to enhance the antitumor response, subsequent administration of an immune-checkpoint inhibitor, for example an anti-PD1 antibody, would affect the activity of intratumoral Treg cells. This would lead to an increase in the proliferation of the effector T cells capable of fighting the tumor and would reinforce an immune memory response that would potentially have a long-term protective effect .

Recently performed tests with adenoviral vectors that carry the HSV-TK gene and the PD-1 extracellular domain sequence fused to the Fc portion of mouse IgG2a was recently assayed to produce the soluble PD-1 (sPD1-Ig) segment. This segment inhibits activity of the complete ligand competitively, and consequently, inhibits the apoptotic effect of T cells mediated by the immunosuppressive interaction of the whole ligand with its receptor. This vector was administered in a murine model of colon carcinoma and demonstrated a synergy between HSV/TK therapy and competitive blockade of PD-1/PD-L1 binding. There was a significant decrease in tumor volume in the group of mice treated with HSV-TK/sPD1 compared to the control groups, including the group of mice treated with the simple scheme of HSV-TK / GCV .

It is possible that in the near future, preclinical and clinical trials will continue to test hypotheses similar to the one proposed in this section and will certainly have very effective clinical results, and above all, with a high level of therapeutic selectivity, which will favor even more the development of the precision medicine in the area of oncology.

Conclusion

The increase of the immune response against tumors could be a key strategy to fight against cancer. The TK/GCV system induces the massive presentation of TAA effectively. On the other hand, the expression of the TK super-antigen facilitates antitumor cellular immunity. The use of monoclonal antibodies against the immune-checkpoints, such as CTLA-4 and PD-1, can decrease the tumor immunosuppression. Until now both strategies are found in clinical trials and have shown promising results. It would be expected that the combination of these two types of therapies would be synergistic, more selective and effective and would have a long-term protective effect.

Introducción

La progresión de muchos tipos de cáncer se acompaña de una fuerte supresión del sistema inmune (SI), lo que interfiere con la respuesta antitumoral y la erradicación eficaz del tumor . La evasión de la inmuno-vigilancia es atribuida, en parte, a que el microambiente tumoral puede inhibir la proliferación de linfocitos T y atraer a poblaciones celulares supresoras .

La mejor comprensión del sistema inmunológico del tumor ha permitido el desarrollo de terapias específicas diseñadas para mejorar la respuesta inmune de un paciente. La inmunoterapia tumoral tiene dos estrategias: atacar al tumor directamente o activar el SI usando terapias celulares, como la estimulación con agonistas o el bloqueo de puntos de control inmunológicos . Este último libera el potencial de la respuesta inmune antitumoral, mostrando ser una terapia prometedora . Otra opción antitumoral es el uso de modalidades de terapia génica, que permiten modificar la expresión génica con propósitos terapéuticos. Por ejemplo, ésta puede facilitar la transducción de células tumorales con "genes suicidas", una de las estrategias de terapia génica antitumoral más investigadas .

En este artículo se hace una revisión del uso de terapia génica suicida y el bloqueo de los puntos de control inmunológicos como alternativas para el tratamiento del cáncer y se analizan los posibles efectos sinérgicos que podrían lograrse con la combinación de estas dos terapias.

1. Cáncer y el sistema inmune

El SI interactúa íntimamente con los tumores durante el proceso del desarrollo de la enfermedad y su progresión a metástasis (inmunología tumoral) . El SI responde al cáncer, reconociendo y eliminando las células anormales (inmuno-vigilancia) . Sin embargo, algunas células resistentes escapan de este control (inmunoedición) disminuyendo su inmunogenicidad , promoviendo el crecimiento maligno .

Las células tumorales presentan cambios en sus marcadores de superficie. Por ejemplo, expresan antígenos asociados a tumor (TAA) o disminuyen la expresión del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de clase I. Esto puede activar células de la respuesta inmune innata, como las células asesinas naturales (NK) . Los macrófagos y neutrófilos atacan las células tumorales y estimulan a los linfocitos T citotóxicos (CTL), a las células presentadoras de antígeno (APC) y a las NK. En contraste, las células inflamatorias producen factores de crecimiento tumorales (TGF) y factores estimuladores de la angiogénesis que contribuyen al desarrollo del tumor .

En la respuesta adaptativa, los TAA procesados son presentados por moléculas MHC clase I y II de las APC a los receptores específicos para la activación de las células T CD8+ o CD4+, respectivamente ,. Los linfocitos T CD8+ son consideradas las principales células efectoras antitumorales . Una vez que son activadas, median la lisis de las células cancerosas . Dentro de las células T CD4+, las Th1 son responsables de la inmunidad celular: secretan interleucina (IL)-2, TNFα e interferón-γ (IFN-γ), promueven la actividad citotóxica de los macrófagos e inducen la sobreexpresión de MHC I y II en las APC. En contraste, las células Th2 expresan IL-4,- 5, -10 y -13, induciendo anergia clonal, potenciando la inmunidad humoral y regulando la actividad de los macrófagos . Por otro lado, los linfocitos T reguladores (Treg), ayudan a reducir la inflamación produciendo TGF-β, IL-35 e IL-10 . Las células tumorales pueden secretar quimiocinas como CCL22 para reclutar células Treg con el objetivo de suprimir la función efectora de las células T y disminuir la respuesta inmune .

Los tumores también pueden desregular el SI alterando un complejo balance entre señales inhibitorias (puntos de control) y activadoras en diferentes vías que regulan la acción de las células T .

2. Linfocitos T reguladores

Los linfocitos Treg son relevantes para el mantenimiento de la homeostasis inmunológica: mantienen la tolerancia a antígenos propios, evitan la aparición de enfermedades autoinmunes, controlan el desarrollo de una respuesta inmune y favorecen el escape de las células tumorales del control inmunológico , . La subpoblación mejor caracterizada expresa CD4, CD25 y Foxp3. Las poblaciones celulares que son suprimidas por los linfocitos Treg incluyen a los linfocitos T CD4+ y CD8+, las células T naturales asesinas T (células NKT), las células dendríticas (DCs), los monocitos/macrófagos, los linfocitos B y las células NK .

Debido a que los Treg suprimen la respuesta inmune contra antígenos propios ,, se postula que los TAAs pueden inducir un incremento en el número de linfocitos Treg intratumorales en varias neoplasias, incluyendo el cáncer colorrectal (CRC), facilitando la inmunotolerancia tumoral ,. La acumulación de Treg en tumores se explica por varios mecanismos, como la conversión de células T CD4+ a Treg en respuesta a TGF-β de membrana, el reclutamiento de Tregs por las quimiocinas CCL17, CCL22 y CCL28 o la secreción tumoral de VEGF-A en respuesta a la hipoxia, lo cual inhibe la maduración de DC. Las DC inmaduras expresan TGF-β favoreciendo la conversión de células T CD4+ a Treg .

Los TAA más frecuentes son antígenos propios poco expresados en células normales, pero altamente expresados en las tumorales . El antígeno carcinoembrionario (CEA) expresado altamente en CRC , uno de los mejor conocidos, es reconocido como antígeno propio por los Tregs , ocasionando una respuesta inmune deficiente frente a las células tumorales. En cánceres de ovario, mama, páncreas, estómago e hígado, un incremento de linfocitos Treg en el tumor se asocia a empeoramiento del pronóstico17. El uso de estas células como blanco puede impactar las estrategias terapéuticas contra el cáncer .

2.1 Mecanismos de acción de los linfocitos Treg

Los linfocitos Treg tienen cuatro mecanismos principales de acción para regular la respuesta inmune Fig. 1. El primero es la supresión por citocinas inhibitorias, las cuales incluyen IL-3, IL-10 y TGFβ ,. El segundo es la supresión por citólisis. Los Treg pueden tener inducir citólisis de las células B por medio de la producción de granzima B. Estas células también pueden ejercer un efecto citolítico en linfocitos T CD8+ y células NK mediado por granzima B y perforina, o por la vía aTRAIL-DR5 -. El tercero es la supresión por alteraciones metabólicas que afectan la actividad de moléculas como CD25 (receptor de IL-2), AMP cíclico (cAMP), CD39, CD73 y el receptor de adenosina 2A (A2AR) . El cuarto mecanismo consiste en la supresión de la maduración o de la función de DC. Esto incluye vías como la del gen 3 de activación de linfocitos (LAG3) o la interacción entre el antígeno asociado a los linfocitos T citotóxicos (CTLA-4) y CD80/86, la cual induce a la enzima indoleamina-2,3-dioxigenasa (IDO), una molécula inmunosupresora generada por las DC ,. El bloqueo de estos mecanismos inmunosupresores podría incrementar la función de las células T y generar una respuesta clínica más efectiva ,.

Figura 1

Mecanismos de acción de las células Treg. A. Producción de citocinas inhibitorias como IL-10, IL-35, y TGF-β. B. La inhibición por citólisis incluye mecanismos dependientes de granzima A o granzima B, así como dependientes de perforina. C. Se puede dar una interrupción metabólica por parte de las células Treg al sobre-producir CD25, capturando la IL-2; realizar una inhibición por cAMP o inmunosuprimir por medio del receptor de adenosina 2A. D. Se puede modular la maduración o función de las DC por medio de las vías LAG3, CTLA-4 o por la enzima IDO (Modificado de Vignali et al. 2008) .

2.2 Regulación de los puntos de control inmunológicos por medio de linfocitos Treg

En el caso de las células T, la amplitud y calidad de la respuesta después del reconocimiento de un antígeno, está regulada por un balance entre señales coestimuladoras e inhibitorias (puntos de control inmunológico) . Con el objetivo de aumentar la función efectora de las células T infiltrantes de tumor, se pueden inhibir las señales inmunosupresoras; de esta manera, se ha tenido un mayor éxito clínico en el tratamiento de varios tipos de cáncer, como melanoma y cáncer de pulmón . Las moléculas que actúan como puntos de control inmunológico, como el receptor CTLA-4 y la proteína de muerte celular programada 1 (PD-1), son expresadas en los linfocitos Treg y en las células T efectoras infiltrantes de tumor .

2.3 Puntos de control inmunológico en cáncer

Como se comentó previamente, la activación e inhibición de diferentes receptores regula el balance entre la respuesta y la tolerancia inmune ,, siendo estos importantes para una completa activación y función efectora de las células T . La terapia con anticuerpos contra reguladores inmunológicos negativos ha demostrado éxito en el tratamiento antineoplásico ,, debido a que aumenta el potencial de la respuesta inmune antitumoral. Está demostrado que los tumores usan algunas vías de control inmunológico como mecanismo de resistencia inmune , ya que al incrementarse la expresión de las proteínas de los puntos de control, decrece la función de las células T. Ejemplos de puntos de control inmunológicos son PD-1, CTLA-4, LAG-3, inmunoglobulina de célula T (TIM-3), entre otros .

Los anticuerpos antitumorales que bloquean los puntos de control inmunológico están dirigidos contra receptores de linfocitos o sus ligandos Tabla 1. Dos puntos de control inmunológicos ampliamente estudiados en el contexto clínico de la inmunoterapia contra el cáncer son CTLA-4 y PD-1; ambos son receptores inhibitorios que regulan la respuesta inmune . Aunque la inhibición de los puntos de control parece ser exitosa en el tratamiento de algunos cánceres, está asociada eventos adversos, en particular a respuestas autoinmunes que afectan a órganos como el colon, la piel, algunas glándulas endócrinas, el hígado, etc .

Tabla 1

Desarrollo de agentes farmacológicos dirigidos contra vías de señalización de inmuno-checkpoints ,.

Blanco	Función biológica	Anticuerpo	Situación en clínica
CTLA-4	Receptor inhibitorio	Ipilimumab	Aprobado por la FDA para melanoma. Ensayos de fase IV para melanoma y cáncer metastásico de células renales. Ensayos de fase III para cáncer de estómago/esófago, cáncer de pulmón de células pequeñas y no pequeñas, carcinoma renal, mesotelioma pleural, carcinoma metastásico de células escamosas de cabeza y cuello, cáncer de próstata, melanoma ocular.
		Tremelimumab	Probado en ensayos de fase III para melanoma, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de células de pulmón pequeñas y no pequeñas, cáncer urotelial,
PD-1	Receptor inhibitorio	Nivolumab	Aprobado por la FDA para melanoma, carcinoma renal, cáncer de células de pulmón no pequeñas. Ensayos de fase IV para carcinoma renal metastásico avanzado y melanoma metastásico. Ensayos fase III para cáncer de pulmón de células pequeñas y no pequeñas, cáncer de estómago/esófago, melanoma, mesotelioma, carcinoma hepatocelular, mieloma múltiple, cáncer urotelial, cáncer gástrico
		Pembrolizumab	Aprobado por la FDA para melanoma, cáncer de células de pulmón no pequeñas. Ensayos de fase III para melanoma y cáncer de pulmón de células pequeñas y no pequeñas.
		Pidilizumab	Ensayos de fase I/II para linfoma, mieloma múltiple, cáncer de páncreas.
PDL1	Ligando de PD-1	BMS-936559	Ensayos de fase I para melanoma.
		Atezolizumab	Ensayos de fase III para cáncer de pulmón de células pequeñas y no pequeñas, cáncer de mama triple negativo, cáncer de tracto urinario, cáncer renal, cáncer de ovario, cáncer colorrectal, melanoma.
LAG3	Receptor inhibitorio	IMP321	Ensayos de fase I/II para adenocarcinoma de mama, carcinoma renal, melanoma, neoplasias pancreáticas.
B7-H3	Ligando inhibitorio	Enoblituzumab	Ensayos de fase I para vários tipos de cáncer.

CTLA-4: antígeno asociado a linfocitos T citotóxicos

LAG3: gen 3 de activación a linfocitos

PD-1: receptor proteíco de muerte celular programada 1

PDL1: ligando de PD-1

El receptor CTLA-4 es el primer punto de control inmunológico usado como blanco clínico . CTLA-4 es miembro de la súper-familia de las inmunoglobulinas CD28:B7, normalmente es expresado en bajos niveles en la superficie de las células T efectoras y células Treg. Su función es regular la amplitud de las primeras etapas de la activación de estas células . Para que una célula T se active se requieren tres señales: la unión del antígeno con el receptor de células T (TCR), la interacción del MHC (en humanos antígeno leucocitario humano, HLA) con los receptores CD8 o CD4 de las células T y la generación de una señal coestimuladora generada por la unión de CD80(B7) con CD28 ,. Una vez que esto ocurre, la vía de CD28 amplifica la señalización del TCR para activar la proliferación de las células T. CD28 y CTLA-4 comparten los mismos ligandos: CD80(B7.1) y CD86(B7.2), aunque estos se unen a CTLA-4 con mayor afinidad ,, debido a esto, CTLA-4 contrarresta la actividad coestimuladora de CD28 ,.

La importancia de CTLA-4 en la activación de células T está demostrada por el fenotipo letal del sistema inmune hiperactivado en ratones knockout para CTLA-44. A pesar de que CTLA-4 se expresa en células efectoras T CD8+ activadas, su función fisiológica más importante se ejerce a través de distintos efectos en los dos subconjuntos principales de células T CD4+: la disminución de la actividad de las células T cooperadoras (Th1) y el potenciamiento de la actividad inmunosupresora de las células Treg .

Se ha propuesto que la expresión de CTLA-4 atenúa la activación de las células T por una cascada de señales inhibitorias Fig. 2, así como por su competencia con CD28 . Algunos estudios sugieren que la activación de las proteína tirosina fosfatasa (SHP2) y de la proteína fosfatasa 2A (PP2A) contrarrestan las señales de las quinasas inducidas por TCR y CD28 . Otros mecanismos, incluyen la expansión de células Treg, estas producen citocinas inmunosupresoras como TGF-β y la enzima IDO.

Figura 2

Modelo de señalización de CD28 y CTLA-4. A. Cuando ocurre la estimulación de células T, se fosforilan los residuos intracelulares de tirosina de CD28, esto atrae a la quinasa 3 fosfatidilinositol (PI3K). La activación de PI3K, la cual incluye la fosforilación del fosfatidilinositol (PI) a fosfatidilinositol 3 fosfato (PIP3), puede promover la activación de la proteína quinasa B (PKB/Akt), seguida de la del factor nuclear-kB (NF-kB), resultando en la sobreregulación del gen BCL-XL que favorece la supervivencia de las células T. La activación de Akt puede también promover la producción de interleucina 2 (IL-2). B. El complejo HLA-péptido es reconocido por el TCR y por su co-receptor CD4 o CD8, lo que activa a la quinasa Lck, la cual fosforila al complejo CD3. Esto ocasiona el reclutamiento y fosforilación de la proteína asociada a la cadena ζ (ZAP70), la cual inicia una cascada de señalización que activa la fosfolipasa Cγ1 (PLCγ1) y RAC. PLCγ1 promueve la movilización de calcio y la activación de la vía RAS. La combinación de estas cascadas de señalización promueve la activación de factores de transcripción y proliferación celular. C. CTLA-4 suprime la activación y la función de las células T mediante el reclutamiento de la proteína tirosina fosfatasa (SHP-2) y la proteína serina/treonina fosfatasa 2A (PP2A). Estas fosfatasas desfosforilan varios de los puntos de señalización que son esenciales para la co-estimulación de las células T (Modificado de Alegre ML et al. 2001, Chen et al. 2013 & Nirschl et al. 2015) ,,.

El bloqueo de CTLA-4 puede afectar la respuesta inmune intratumoral mediante la inactivación de los linfocitos Treg infiltrantes de tumor y ocasionar un incremento en la respuesta inmune dependiente de células Th1 . También se ha observado que su bloqueo potencializa la producción de anticuerpos específicos contra TAA, así como una respuesta celular CD4+ y CD8+ antígeno específica .

PD-1 también es una proteína clave en la regulación inmune , actúa como un punto de control inmunológico y es un blanco inmuno-terapéutico. Es una molécula co-inhibitoria expresada en células T estimuladas, así como en los linfocitos Treg, células B-activadas y células NK ,. PD-1 parece tener una función crucial en la modulación de la actividad de las células T a través de la interacción con sus ligandos PD-L1 y PD-L2 . PD-L1 se expresa en tejidos linfoides y no linfoides, es activado especialmente en APCs, DCs, macrófagos y células B, aunque también se expresa en las células tumorales que abrogan la respuesta linfocitaria. La expresión de este ligando en el tejido tumoral es reconocida por los linfocitos T efectores, los cuales restringen su actividad oncolítica para inducir inmunotolerancia al cáncer . PD-L2 solo se expresa en las APCs .

Después de la unión con su ligando, PD-1 suprime la activación de células T reclutando SHP-2, la cual desfosforila e inactiva Zap70, un componente importante en la vía de señalización del TCR. Como resultado, PD-1 inhibe la proliferación de células T y sus funciones efectoras, como la producción de IFN-γ . El bloqueo de PD-1 puede mejorar las respuestas inmunes antineoplásicas al disminuir el número y actividad supresora de las células Treg intratumorales , además de incrementar la proliferación de células T efectoras (CD8+/HLA-DR+/Ki67+células T), la producción del quimioatrayente alfa de células T inducible con interferón (I-TAC), de IFN-γ y de IL-18 .

Aunque CTLA-4 y PD-1 regulan de manera negativa la activación de las células T al bloquear la vía CD3/CD28, estos receptores tienen distintos papeles . CTLA-4 opera durante el inicio de la activación de las células T nativas y de memoria en tejido linfoide y PD-1 opera durante la fase efectora de las células T Fig. 3 ,. La interacción de PD-1 con su ligando PD-L1 ocurre predominantemente en los tejidos periféricos, incluyendo el tejido tumoral ,,.

Figura 3

CTLA y PD-1 modulan diferentes aspectos de la respuesta de las células T. A) CTLA-4 es sobreexpresado después de la activación de una célula T virgen o de memoria en tejido linfático por el reconocimiento de un antígeno especifico presentado en el contexto de HLA, ocasionando un decremento en la función efectora (fase de activación temprana). El bloqueo de CTLA-4 con un anticuerpo específico permitiría la vía señalización por el receptor CD28, contribuyendo a la proliferación y activación de células T. B) PD-1 es expresado principalmente en células T de memoria de tejidos periféricos, esta vía asegura la protección de los tejidos del daño colateral durante una respuesta inflamatoria. Las células tumorales sobreexpresan los receptores de PD-1 (PD-L1 y PD-L2) para evadir la respuesta de las células T hacia el tumor. De la misma manera, al utilizar anticuerpos para bloquear la vía de PD-1 se contribuiría al desarrollo de una respuesta inmune más potente. (Modificada de Ott et al. 2013) .

Existen estudios preclínicos que proponen una terapia combinada utilizando anticuerpos para el bloqueo simultáneo de ambas vías (anti-CTLA-4 más anti-PD-1) . Esta estrategia dual potenciaría la respuesta antitumoral, pero también se puede prever que resulte más tóxica .

2.7 Uso clínico del bloqueo de puntos de control inmunológicos

El ipilimumab (anti-CTLA-4) es un anticuerpo monoclonal recombinante humano (inmunoglobulina IgG1 kappa) aprobado por la Food and Drug Administration (FDA) en el 2011 para el tratamiento de melanoma metastásico. El anticuerpo monoclonal humano nivolumab (anti-PD-1) es una inmunoglobulina IgG4 kappa autorizada en Japón en el 2014 para el tratamiento del melanoma no resecable. La FDA aprobó el anticuerpo monoclonal humanizado pembrolizumab (inmunoglobulina IgG4 kappa) contra PD-1 en septiembre de 2014 y el nivolumab en diciembre de 2014, ambos para el tratamiento de melanomas avanzados. En marzo del 2015 la FDA aprobó el nivolumab para el tratamiento de cáncer de pulmón .

Existen estudios de fase II que muestran una mayor sobrevida en pacientes con melanoma metastásico a los que se les administró ipilimumab ,. En un estudio, se observó una sobrevida media de 10.1 meses en pacientes que usaron ipilimumab contra 6.4 meses en pacientes que usaron una vacuna peptídica control ; también se observó una tasa de supervivencia en 5 años del 18.2% para pacientes con melanoma avanzado tratados con ipilimumab+dacarbazina contra el 8.8% de pacientes tratados con placebo+dacarbazina . Dos estudios fase III de nivolumab establecieron claros beneficios de este agente contra melanoma metastásico en comparación con la quimioterapia, mostrando una mejor tasa de supervivencia a un año . En julio del 2017, la compañía Bristol-Myers Squibb anunció que la FDA expandió el uso de ipilimumab administrado de manera intravenosa como tratamiento para melanoma metastásico no extirpable en pacientes pediátricos de 12 años de edad o mayores. Así mismo, en agosto del 2017, anunció que el nivolumab fue aprobado por la FDA para el tratamiento de pacientes adultos y pediátricos (mayores de 12 años) con cáncer colorrectal metastásico que presentan alta inestabilidad microsatelital (MSI-H) o deficiencia en la reparación de errores en el DNA, en los pacientes refractarios al tratamiento con fluoropirimidinas, oxaliplatino e irinotecan. El pembrolizumab y el nivolumab (aprobados por la FDA) fueron comparados contra el ipilimumab, demostrándose una mayor respuesta y una menor toxicidad . Además se observó que el bloqueo de PD-1 tuvo actividad en pacientes que no respondieron al bloqueo de CTLA-4 . Se ha propuesto que los agentes que inhiben PD-1 son más efectivos que los que inhiben directamente a PD-L1 (ej. anticuerpo monoclonal humano BMS-936559 , debido a que pueden inhibir ambos ligandos (PD-L1 y PD-L2) de manera simultánea .

En 2015 se evaluó la seguridad y eficiencia del nivolumab e ipilimumab por separado y en comparación con una terapia combinada nivolumab + ipilimimab (registrado como CheckMate 067 en ClinicalTrials.gov), observándose una sobrevida de 11.4 meses para el tratamiento combinado, contra con 6.9 meses para el tratamiento solo con nivolumab y 2.9 meses para el ipilimumab . Aunque se observa un aumento en la supervivencia de algunos meses, la inmunoterapia tiene un costo exorbitante; en el 2015 se estimó un costo promedio por mg de $28.78 dólares para el nivolumab, $51.79 dólares para el pembrolizumab y $157.46 dólares para el ipilimumab. Hay que considerar que las dosis de administración van desde 2 mg/kg hasta 10 mg/kg cada 3 semanas, aproximadamente. Se calcula que el costo del tratamiento de un paciente con CheckMate 067 podría ser de $295,566 dólares; el del nivolumab de $103,220 dólares y del ipilimumab de $158,252 dólares. Teniendo en cuenta lo anterior, para un paciente de 75 kg con melanoma que recibe 26 de las dosis más altas y frecuentes de pembrolizumab, el costo del tratamiento sería de $1,009,944 dólares. Si el tratamiento se le proporcionara a cada uno de los 589,430 pacientes que mueren por cáncer de melanoma anualmente, el costo para los sistemas de salud en general sería de $173,881,850,000 dólares. Esto es simplemente insostenible. Como en muchas otras áreas de la famacoeconomía de los medicamentos emergentes para las enfermedades crónicas, lo anterior representa un reto que debe resolverse considerando un equilibrio entre las demandas de la comunidad y de los sistemas de salud versus los intereses comerciales de los empresarios de las industrias farmacéuticas .

2.8 Efectos adversos

El uso de ipilimumab y tremelimumab se ha asociado con eventos adversos que afectan la piel (prurito, vitíligo), el intestino (diarrea y colitis), el hígado (hepatitis y enzimas hepáticas elevadas) y las glándulas endócrinas (hipotiroidismo, tiroidismo) . En comparación con el bloqueo de CTLA-4, el bloqueo de PD-1 o PD-L1 puede tener efectos similares, pero parecen ser menos comunes ,. Aunque se han mostrado buenos resultados en el uso de estas terapias, no son lo suficientemente efectivas para utilizarse solas , por lo que es necesaria su combinación con otras estrategias. La terapia génica podría ser una alternativa interesante para una terapia combinada.

3. Terapia génica suicida

La selectividad terapéutica de los agentes antineoplásicos es limitada, porque las células cancerosas son resistentes a la apoptosis, al arresto del ciclo celular y a la senescencia, además que pueden emerger subpoblaciones celulares resistentes . La aplicación de tecnologías de terapia génica podría mejorar la selectividad de las terapias dirigidas a los puntos de control inmunológico y facilitar el acceso de estas al tejido tumoral . La terapia suicida tiene dos alternativas: la terapia génica tóxica, en la cual se transducen genes para una proteína tóxica en las células tumorales, o la terapia de activación enzimática de profármacos. Esta última consta de dos etapas: inicialmente, el gen de una enzima heteróloga es dirigido y entregado al tumor para su expresión. Posteriormente, se administra un profármaco que es convertido en un medicamento citotóxico por la enzima heteróloga . Debido a su mecanismo de acción, esta terapia confiere una inmunorreactividad antitumoral, como se explicará más adelante.

El sistema HSV-TK/GCV es selectivo para las células tumorales debido a que afecta la replicación activa del DNA de manera preferencial en las células tumorales, actividad que es baja en las células estromales circundantes, muchas de las cuales están en estado quiescente ,.

3.1 Enzimas y profármacos usados en sistemas de terapia génica suicida

Las enzimas utilizadas en terapia génica suicida se dividen en dos grupos. El primero comprende enzimas de origen no mamífero (ej. timidina quinasa del virus Herpes simplex [HSV-TK]. El segundo comprende enzimas de origen humano que están ausentes o se expresan a bajas concentraciones en células tumorales . Se han desarrollado varios sistemas enzima-profármaco para terapia génica suicida, como los sistemas carboxil esterasa (CE)/irinotecan, carboxipeptidasa A (CPA)/péptidos MTX-a, carboxipeptidasa G2(CPG2)/CMDA y HSV-TK/ganciclovir (GCV). Este último sistema es el más estudiado y ha progresado exitosamente a ensayos clínicos de fases avanzadas, por lo cual se explica con más detalle a continuación ,.

3.2 Sistema HSV-TK/GCV

El sistema HSV-TK/GCV utiliza al ganciclovir y sus análogos como profármacos. Estos profármacos son análogos de los nucleósidos de purina ,. La administración sistémica del GCV induce apoptosis selectiva en las células transducidas con el gen TK. La HSV-TK es capaz de fosforilar el GCV, convirtiéndolo en GCV monofosforilado, que posteriormente es tri-fosforilado por quinasas celulares. Este producto bloquea la replicación del DNA, causando además su fragmentación y apoptosis , Fig. 4.

Figura 4

Metabolismo comparativo de la timidina y del ganciclovir por la timidina quinasa del virus Herpes simplex y las quinasas celulares. A. Metabolismo de la timidina. De manera normal, las enzimas timidina quinasa pueden fosforilar la timidina hasta obtener timidina trifosfato, para su posterior integración al DNA. B. Metabolismo del ganciclovir. La timidina quinasa del HSV, a diferencia de la timidina quinasa humana, es capaz de fosforilar el ganciclovir para convertirlo en GCV-P, una vez que esto ocurre, las quinasas celulares pueden fosforilarlo para su posterior integración en el DNA, esto ocasiona el arresto de su síntesis y por consiguiente, la muerte de la célula.

El sistema HSV-TK/GCV se ha ensayado en estudios pre-clínicos , y clínicos contra varios tipos de cáncer, como tumores de próstata ,, cerebro -, ovario ,, vejiga ,, cuello uterino , páncreas , y hepático , entre otros. Numerosos ensayos clínicos de fase I y II han probado la seguridad y eficacia de esta terapia en humanos ,. Diversos estudios demostraron que la transducción del gen HSV-TK es más segura y efectiva con vectores adenovirales de replicación deficiente en comparación con los vectores retrovirales ,.

3.3 Respuesta inmune inducida por el sistema AdV-TK/GCV.

Se ha evidenciado que la terapia con HSV-TK/GCV induce inmunidad anti-tumoral , e incluso, regresión de tumores cerebrales en ratas inmunocompetentes y de neuroblastoma en un modelo murino ,. En los tumores tratados se observa una marcada infiltración de células inflamatorias, con predominio de CD4+ y CD8+, lo que sugiere que el sistema HSV-TK/GCV estimula la respuesta inmune antitumoral ,. También se observa la sobreexpresión de las moléculas coestimuladoras B7.1 y B7.2, moléculas de adhesión intracelular (ICAM) y moléculas del MHC en los tumores, y la atracción y activación de APCs ,.

Durante el tratamiento de tumores con HSV-TK/GCV, se incrementan las citocinas que estimulan a las APCs y a las células T, como IL-2, IL-12, IFNγ, TNFα y GM-CSF, mientras que las citocinas inhibitorias IL-4, IL-6 e IL-10 no se estimulan . El incremento en la respuesta inmune ha sido demostrado por niveles más altos de células CD8 circulantes activas y por la elevación de IL-12 en suero ,, un mediador clave en la respuesta inmune celular contra infecciones virales y tumores malignos ,. Los niveles de células NK se han relacionado con los niveles de IL-12, debido a que las células NK son uno de los blancos de acción de esta interleucina ,.

Adicionalmente, la proteína TK viral funciona como un súper-antígeno, estimulando un microambiente tumoral altamente inmunogénico . Esta proteína induce la liberación y presentación de TAAs que pueden ser reconocidos por los linfocitos T y generar una respuesta inmune adaptativa que también conduce a la citólisis de células tumorales y reclutamiento de APCs . Las APCs activadas inducen la proliferación de células T por la secreción de IL-2 e IL-12 en el sitio del tumor. Todos estos eventos son deseables para conseguir un potente efecto anti-tumoral ,. Sin embargo, debe considerarse una observación que resulta contradictoria. Un ensayo clínico de terapia neoadyuvate con HSV-TK/GCV para carcinoma pancreático mediada por un vector adenoviral, mostró niveles intratumorales incrementados de PD-L1 en especímenes analizados después de la resección quirúrgica. Este evento puede disminuir la respuesta de las células T efectoras, pero puede revertirse con la co-administración de inhibidores de PD-1/PD-L1 .

Los ensayos clínicos en los que se ha probado la terapia con HSV-TK/GCV mediada por vectores virales de manera única o en combinación con agentes quimioterapéuticos o radioterapia para cáncer de próstata, carcinoma hepatocelular, o glioblastoma multiforme han mostrado progresos sólidos hasta fase III 67,68,75.

3.4 Efectos adversos

A pesar de los resultados prometedores, existen algunas desventajas. Los vectores adenovirales deficientes en replicación disparan una fuerte respuesta inmune humoral y celular que limita su duración a un periodo de entre dos o tres semanas. A pesar de esto, estos vectores pueden resultar útiles para aplicaciones terapéuticas en los que un nivel muy alto de expresión transitoria del gen terapéutico es deseable, como ocurriría en la terapia génica del cáncer . Por otro lado, la expresión de la proteína TK no es específica de tumor. Una opción interesante es el uso de adenovirus que prefieran su replicación en células tumorales usando un promotor específico .

En estudios en fase I y II se han mostrado algunos efectos secundarios, como fiebre leve, neutropenia, dolor de cabeza, trombocitopenia, alteración de las enzimas hepáticas, entre otros. Afortunadamente, estos eventos son transitorios y fáciles de tolerar ,,.

4. Combinación de terapias como nuevo tratamiento

El tratamiento combinado de terapia génica e inmunoterapia es una opción atractiva posibilitada por los avances recientes en la terapéutica del cáncer. El empleo de un sistema de terapia génica suicida determinaría la presentación súbita y masiva de TAAs por un periodo sostenido de semanas o meses. Resulta razonable pensar que esta terapia pueda ser reforzada de manera sinérgica mediante su combinación con un fármaco inhibidor de puntos de control inmunológico administrado de manera sistémica como los descritos en esta revisión. Para ejemplificar más esta idea, se podría suponer que un tumor tratado con HSV-TK/GCV generara la exposición súbita y masiva de TAAs al sistema inmune, los cuales en otras condiciones no generan una inmunoreactividad efectiva por la disminución de MCH I y de moléculas de coestimulación y por la inducción de Treg. Este evento desencadenaría la atracción y activación de las APC y se podría esperar que algunos TAAs induzcan un incremento en el número de linfocitos Treg intratumorales (incluso antes de la intervención con terapia génica), propiciándose un ambiente inmunosupresor. Para prevenir este fenómeno inmunológico y reforzar la respuesta antitumoral, la subsiguiente administración de un inhibidor de punto de control inmunológico, por ejemplo un anticuerpo anti-PD1, afectaría la actividad de las células Treg intratumorales, lo que conduciría a un incremento en la proliferación de las células T efectoras capaces de combatir al tumor y reforzaría una respuesta de memoria inmunológica que potencialmente tendría un efecto protector de largo plazo .

Recientemente se ensayó un vector adenoviral portando el gen HSV-TK y la secuencia del dominio extracelular de PD-1 fusionada a la porción Fc de la IgG2a de ratón, para producir el segmento PD-1 soluble (sPD1-Ig), que inhibe la actividad del ligando completo de manera competitiva, y por consecuencia, inhibe el efecto apoptótico de las células T mediado por la interacción inmunosupresora del ligando íntegro con su receptor. Éste se administró en un modelo murino de carcinoma de colon y demostró una sinergia entre la terapia HSV/TK y el bloqueo competitivo de la unión PD1/PD-L1. Hubo un decremento significativo en el volumen tumoral en el grupo de ratones tratados con HSV-TK/sPD1 en comparación con los grupos controles, incluyendo el grupo de ratones tratados con el esquema simple HSV-TK/GCV .

Es posible que en un futuro cercano se continúen realizando ensayos preclínicos y clínicos que prueben hipótesis similares a la que se plantea en este apartado y que seguramente tendrán resultados clínicos muy efectivos, y sobre todo, con un alto nivel de selectividad terapéutica, lo cual favorecerá aún más el desarrollo de la medicina de precisión en el área de la oncología.

Conclusión

La potencialización de la respuesta inmune contra los tumores podría ser una estrategia clave para combatir el cáncer. El sistema TK/GCV induce la presentación masiva de TAAs de manera efectiva. Por otra parte, la expresión del súper-antígeno TK facilita la inmunidad celular antitumoral. El uso de anticuerpos monoclonales contra puntos de control de la respuesta inmune, como CTLA-4 y PD-1, contrarrestan la inmunosupresión ocasionada por el tumor. Hasta ahora ambas estrategias se encuentran en ensayos clínicos y han demostrado resultados prometedores. Se esperaría que la combinación de estos dos tipos de terapias fuera sinérgica, más selectiva y efectiva y que tuviera un efecto protector de largo plazo.