Reference values of amino acids, acylcarnitines and succinylacetone by tandem mass spectrometry for use in newborn screening in southwest Colombia.

INTRODUCTION: Inborn errors of metabolism (IEM) represent an important public health problem due to current diagnosis and treatment limitations, poor life quality of affected patients, and consequent untimely child death. In contrast to classical methods, tandem mass spectrometry (MS/MS) has allowed simultaneous evaluation of multiple metabolites associated with IEM offering higher sensitivity, low false positive rates and high throughput. AIMS: Determine concentration levels for amino acids and acylcarnitines in blood of newborns from Colombia, to establish reference values for further use in diagnosis of IEM.
METHODS: Implementation of a method to determine amino acids, acylcarnitines and succinylacetone in newborn dried blood spots using MS/MS, and its application in a cross-sectional study conducted in 891 healthy neonates from Cali and Quibdo cities is described.
RESULTS: fifty-seven analytes that allow the diagnosis of more than 40 different pathologies were tested. The method showed to be linear, precise and accurate. Healthy neonates 1-18 days of age were included, 523 from Cali and 368 from Quibdo; 52% male and 48% female. Age-related differences on the concentration levels of amino acids and acylcarnitines were observed whereas no significant differences by gender were found.
CONCLUSION: The study has contributed to reveal the usual concentration levels of amino acids, acylcarnitines and succinylacetone that could be used as reference for the establishment of a newborn metabolic screening program in Colombia.

Introduction

The Inborn Errors of Metabolism (IEM) are part of the group of so-called "rare, forgotten or orphan diseases" that fortunately affect very few people in the world. The incidence could be estimated in one person per 2,000 inhabitants for the most common, but in some cases can be as low as one per 10,000 or more inhabitants, which makes these diseases to be poorly known, seldom studied and treated and therefore neglected , . It is estimated that IEM could affect 6-8% of the world population, however, the data vary from country to country and in some like Colombia no data are available due to lack of epidemiological studies and the restrictions for accurate diagnosis.

IEM are serious, degenerative, chronic diseases with painful and disabling clinical manifestations ranging from unnoticed clinical pictures or confused with other diseases to varying degrees of mental retardation and physical disability . These diseases can result in death at an early age, creating a considerable family and social burden. The greatest problem with these diseases is the delay in diagnosis (5-10 years) or misdiagnosis due to the lack of specialized laboratories that perform accurate tests, leading to a delayed or lack of treatment. When available, early diagnosis and adequate treatment allow patients to lead an almost normal life, reducing sequelae or at least substantially lessening organ damages.

Tandem mass spectrometry (MS/MS) is a technology that allows simultaneous detection and identification of multiple analytes with high sensitivity, accuracy and precision, with high specificity. Based on these properties, MS/MS has been incorporated as a diagnosis tool for IEM screening in a screening system capable of detecting over 50 different conditions . First demonstrated by Millington et al. , , and further optimized and applied to metabolic neonatal screening by different groups , including de addition of succinylacetone (SUAC), as a specific marker for tyrosinemia type I (Tyr I) , , MS/MS currently replaces traditional screening techniques that usually analyse individual biomarkers for each disease. At present, MS/MS is routinely used in developed countries as United States, Canada, Germany and Spain - , and in Latin America countries such as México, Brazil and Costa Rica - . In Colombia there is not enough awareness about this issue, which leads to a lack of clarity regarding public health policies for their management . Currently, only congenital hypothyroidism is included in the list of mandatory diseases for screening, however it is known that screening is not performed in most regions of the country.

Because of the urgent need for a highly sensitive method for diagnostic and efficient IEM screening in Colombia, this study is focused on the establishment of concentration values of amino acids (AAs), acylcarnitines (ACs) and succinylacetone (SUAC) in a sample of Colombian newborns using MS/MS technology.

Materials and Methods

Subjects

A total of 891 healthy newborns from Cali (n= 523, department of Valle del Cauca) and Quibdo (n= 368, department of Choco), were recruited between August 2012 and July 2015 and included in the study. Blood specimens were collected by heel-stick and spotted on filter paper cards (Whatman nº903 filter, GE Healthcare, Westborough, USA) which were dried for 24 hours at room temperature and then stored at 4° C until use, according to the standards from Clinical and Laboratory Standard Institute . Duplicate samples were stored frozen at -20° C with a drying agent. This trial was conducted according to ICH E-6 Guidelines for Good Clinical Practices and the protocol was approved by Institutional Review Boards (IRB) of the Malaria Vaccine and Drug Development Center-MVDC (CECIV from Cali, act number 005), Clínica Versalles (Cali) and Hospital San Francisco de Asís (Quibdo). Written informed consent (IC) was obtained from the mother of each newborn at enrollment.

Inclusion criteria

All infants included in the present study fulfilled all selected inclusion criteria to ensure that they were not suffering from any disorder or disease. Among those criteria, we highlighted that healthy male and female newborns had to have weights in the range of 2,500 -4,000 g, gestational ages of 37-42 weeks, an APGAR score greater than 7 at 10 min and aged between 2 and 18 days.

Materials

Isotopically labeled internal standards AAs and ACs were purchased from Cambridge Isotope Laboratories, Inc.; hydrazine sulfate salt and HPLC grade acetonitrile from Sigma-Aldrich, SUAC from HT Brink, University hospital of Amsterdam, formic acid and 3 N HCl in n-butanol from Fluka. The filter paper 903 Protein Saver used for blood spot samples were purchased from Whatman. Base, low, medium and high level blood spot controls were supplied by the Newborn Screening Quality Assurance Program of Center of Disease Control and Prevention (CDC) (Lot:1421-1424; 1462-1464). Dried blood samples were analyzed using high performance liquid chromatography (Shimadzu Scientific Instruments, Columbia, MD) coupled to Tandem mass spectrometer 3200 QTRAP (AB Sciex).

Sample preparation

Dried blood spots (DBS) were punch at 3.2 mm diameter and placed into a single well of a polystyrene 96-well plate, to which 120 μL were added of a daily working solution containing acetonitrile: water (80:20 v/v), 0.08% formic acid, 3.6 mol/L hydrazine hydrate and internal standards of AAs, ACs and SUAC. The plate was sealed using adhesive Sealing Film (Fisherbrand No 08-408-240) and shaken at 600 rpm for 45 min at 45º C. The extracts were transferred to a new polystyrene 96-microwell plate and then dried under N2 atmosphere at room temperature for approximately 25 min at 40° C. Then 50 µL of methanol were added and dried again for 10 min. Samples were then reconstituted in 60 μL of n-butanol 3N HCl and incubated at 65º C ± 5° C for 20 min. The resulting mixtures were again dried for about 20 min, and each residue was finally reconstituted in 150 μL of mobile phase (acetonitrile: water 50:50 containing 0.025% formic acid), covered with aluminum foil, shaken for 10 min at room temperature, centrifuged at 500 r.p.m. for 4 min and placed into an autosampler tray for MS/MS analysis.

MS/MS analysis

A triple quadrupole tandem mass spectrometer, operated in positive-ion mode was used for analysis of AAs, ACs and SUAC. The samples were run using isocratic mobile phase (acetonitrile: water - 50:50 containing 0.05% formic acid) with a flow rate of 70 μL/min in 3 min run per sample using a high-performance liquid chromatography pump. The analysis was done using three different experiments per run: 1. Neutral loss of m/z 102 (scan range m/z: 130-280) for AAs detection, 2. Precursor ion of m/z 85 (scan range m/z: 200-550) for ACs and the multiple reaction mode (MRM) for SUAC (m/z 211 → 137) and the AA with lower sensitivity such as Arg (m/z 231 → 70), Gly (m/z 132 → 76), Leu (m/z 188 → 86), Met (m/z 206 → 104), Ser (m/z 162 → 60), His (m/z 156 → 110), OH-Pro (m/z 188 → 68), Thr (m/z 176 → 74) Ornitine (m/z 189 → 70) and Citruline (m/z 232 → 113). The software Analyst 1.5.2 (BioSciex) was used for data acquisition and Chemoview and Neoscreen were used for data analysis. Quantification of target analytes was achieved by calculating the ion abundance ratios of each pure compound relative to isotopically labeled internal standards (IS).

Linearity and limit of detection

Linearity of the method for AAs, ACs and SUAC was estimated in duplicated by inter-assay analysis of the DBS calibrators from CDC at four different concentrations between 3.7 and 746.7 µmol/L for AAs, 0.1 and 52.8 µmol/L for ACs and 0.3 and 11.1 µmol/L for SUAC and at 95% of confidence interval (CI). The limit of detection (LOD) was evaluated using a linearization in three different lower levels of concentration for each analyte, taking into account the baseline noise as an indicator of instrument sensitivity.

Precision and accuracy

Both the intra-assay and inter-assay precision for AAs, ACs and SUAC was estimated at two medium concentration levels of the DBS calibrators from CDC. Intra-assay precision was determined by duplicates in five repetitions, whereas the inter-assay precision was determined in duplicates for three days and two different analysts. Precision was denoted as the percent of coefficient of variation (%CV <20%) and Cochran values (<0.555) for intra-assay and inter-assay precision, respectively.

The accuracy of the assay was determined using DBS calibrators from CDC at four concentration levels (Lot: 1321-24 for AA and Lot: 1361-64 for AC) over three batch runs. Accuracy was denoted as the relative error (%RE). Accuracy was required to be within ±20%RE .

Statistical analysis

Data were processed with R-project by Bell Laboratories (formerly AT&T, now Lucent Technologies). Results are expressed as coefficient correlation (R2) for linearity, critical value of the F-distribution (ANOVA analysis) for analysis of variance, CV and Cochran values for precision and percentage of recovery for the Accuracy. A Shapiro-Wilk Test was used to check normality; however, there was not enough evidence to say that the data was normally distributed. Group comparisons by gender and study site were determined by a Mann Whitney U test and correlations between age and each analyte concentration were tested with a Spearman test. A p value ≤0.05 was considered significant.

Results

Validation of the method

Linearity was determined using four levels of concentrations. Coefficients of linear regressions (R²) for AAs, ACs and SUAC were >0.96 for all analytes (Table 1). Linearity ranges were within the ranges established by the CDC. The analysis of variance for the regression of each analyte by ANOVA test showed critical values of the F-distribution much lower than 5% for all analytes (Table 1). The mean intra-assay precision over the entire concentration range was always less than 20%, and the inter-assay precision, measured as the Cochran value (0.555) was compiled for all analytes (Table 1).

Table 1

Validation of the method

Analyte	LOD* (µmol/L)	Linear range (µmol/L)	Linearity	ANOVA	Precision		Accuracy
			**R2	†Critical values F	¶CV	Cochran	§% RE
			≥0.95	<5%	≤ 20%	0.555	80 - 120%
Phe	0.10	71.8-325.4	0.998	3.399E-05	8.17	0.430	83.24
XLeu	1.43	116.0-445.7	0.966	2.681E-03	10.39	0.245	91.06
Met	4.97	11.4-214.2	0.980	1.236E-03	14.65	0.309	96.59
Tyr	0.33	49.7-489.4	0.993	2.567E-04	6.18	0.356	98.63
Val	2.27	121.4-428.6	0.991	3.389E-04	6.70	0.534	92.47
Cit	0.35	26.3-232.7	0.999	3.050E-07	4.78	0.455	109.94
Ala	1.50	292.8-625.5	0.978	1.374E-03	6.17	0.250	105.20
Arg	0.89	10.0-266.1	0.995	1.358E-04	5.90	0.484	84.34
SUAC	0.12	1.4-9.0	0.995	1.318E-04	6.78	0.374	104.79
Free carnitine (C0)	0.04	25.9-79.0	0.971	2.104E-03	9.28	0.277	92.58
Acetyl (C2)	0.08	12.9-39.4	0.939	6.500E-03	10.95	0.220	83.78
Propionyl (C3)	0.14	1.3-12.4	0.999	8.953E-06	8.63	0.384	114.48
Butiryl (C4)	0.09	0.2-4.4	0.992	3.003E-04	13.19	0.297	94.55
Isovaleryl (C5)	0.01	0.1-2.4	0.999	7.922E-06	5.07	0.544	105.48
Glutaryl (C5DC)	0.15	0.5-1.8	0.997	6.015E-05	13.64	0.336	88.96
3-OH-valeryl (C5OH)	0.01	0.5-3.4	0.964	2.975E-03	5.05	0.304	79.77
Hexanoyl (C6)	0.01	0.0-2.2	0.999	2.258E-06	8.82	0.554	113.21
Octanoyl (C8)	0.06	0.0-2.3	0.983	9.102E-04	2.80	0.353	116.59
Decanoyl (C10)	0.03	0.0-2.5	0.981	1.165E-03	7.37	0.332	113.11
Dodecanoyl (C12)	0.01	0.0-2.1	0.991	3.672E-04	12.37	0.366	100.13
Myristoyl (C14)	0.01	0.1-2.6	0.997	6.014E-05	12.66	0.467	107.10
Palmitoyl (C16)	3.47*	0.9-9.2	0.958	3.752E-03	8.14	0.330	113.30
Hydroxy-Palmitoyl (C16OH)	2.83*	0.0-0.9	0.995	1.664E-04	8.17	0.43	175.40
Stearoyl (C18)	4.58*	0.6-5.7	0.996	9.952E-05	10.39	0.245	91.06
OH-stearoyl (C18OH)	3.75*	0.0-1.4	0.987	6.520E-04	14.65	0.309	96.59

* LOD: Límite de detección

**R2: Correlation Coeficient

† F: Citic value of distribution F

¶ CV: Variation Coeficient

§ %RE: Relative Error

Accuracy of the method was determined by replicated analysis of samples containing known amounts of each analyte in DBS calibrators from CDC. The accuracy data obtained were in the range of 83.2 to 109.9% for AAs, of 80.0 to 116.6% for ACs and was 104.8% for SUAC (Table 1). The LODs obtained for AAs, ACs and SUAC are also summarized in Table 1, showing the lowest detection for phenylalanine (Phe) of 0.1 µmol/L and 3-hidroxypalmitoylcarnitine (C16OH) of 2.83 nmol/L.

Concentrations of AAs, ACs and SUAC in the studied population

A total of 891 healthy neonates between 1 and 18 days of age, 463 (52%) male and 428 (48%) female, were included in this study. Of them, 313 neonates were between 1-2 days old, 257 between 3-8 days old and 321 were 9 to 18 days old.

A total of 25 analytes were used in the validation process, which form part of quality controls given by the CDC. In addition, 32 other analytes were tested to complete a total of 57 analytes of which 19 were AAs, 37 were ACs and SUAC, thus allowing diagnosis of 50 different pathologies. Specific markers were selected according to information obtained from Regions 4 Genetic New Born Screening and transferred from Hospital Clínico Universitario, Santiago de Compostela, España to Malaria Vaccine and Drug development Center in Cali (Colombia).

In general, the AAs (n= 8, Table 2) had mean concentrations ranging between 15 and 247 µmol/L. Of them, xLeu (mean 247 µmol/L), Ala (192 µmol/L) and Val (128 µmol/L) were the most abundant AAs, whereas Citruline (15 µmol/L) and Arg (20 µmol/L) were the less abundant. In general, ACs with shorter chains were the most concentrated whereas those of longer chain were the less abundant. Higher concentrations were observed for free carnitine (32 µmol/L) and acetyl carnitine (23 µmol/L), whereas hydroxystearoyl carnitine (C18-OH) (0.07 µmol/L) were the less concentrated. Palmitoyl carnitine (C16) was the most abundant among those of long-chains (Table 2).

Table 2

Reference concentration values for AAs and ACs.

Analyte	MEAN (µmol/L)	SD	P1*	P99**
Phe	44.27	11.78	23.92	78.94
XLeu	246.72	121.16	72.61	536.72
Met	35.50	19.71	11.00	101.91
Tyr	96.27	34.72	37.03	201.25
Val	128.42	32.10	59.18	204.00
Cit	14.95	4.56	7.81	27.52
Ala	192.01	53.86	91.43	348.82
Arg	19.94	11.48	4.40	52.07
C0	32.39	13.71	13.63	78.74
C2	22.69	8.62	9.02	54.31
C3	1.24	0.73	0.23	4.05
C4	0.22	0.15	0.07	0.64
C5	0.24	0.09	0.09	0.59
C5DC	0.12	0.07	0.03	0.36
C5OH	0.22	0.09	0.10	0.55
C6	0.16	0.09	0.04	0.51
C8	0.16	0.08	0.05	0.43
C10	0.17	0.09	0.05	0.45
C12	0.27	0.16	0.08	0.81
C14	0.32	0.15	0.10	0.84
C16	2.48	1.19	0.72	6.17
C16OH	0.10	0.06	0.02	0.27
C18	0.83	0.36	0.30	2.00
C18OH	0.07	0.05	0.02	0.26

SD: standard deviation

*Percentile 1 lower acceptance limit

**Percentile 99 upper acceptance limit

Age and gender distribution

Normal concentrations of AAs and ACs were compared with regard to factors such as age and gender. All data sets did not show a normal distribution when they were evaluated by Shapiro-Wilk test for normality, therefore non-parametric tests were used to check for differences between concentrations of AAs and ACs regarding different factors.

Age had a significant effect on analytes concentration, with rho ranging from 0.02 to 0.52 for positive relations and -0.06 to -0.39 for negative relations (Table 3). For the AAs, only phenylalanine and methionine had a negative correlation (Fig. 1A), whereas for the ACs, in all cases but Isovaleryl (C5, rho= 0.02), the correlation between the concentration and age was negative (rho <0) (Fig. 1B, Table 3), indicating that the concentration of these analytes decreases slightly with age, while it increases with age for isovaleryl and most of the tested AAs.

Table 3

Statistical analysis according to age (Spearman's correlation) and gender (Mann Whitney U test).

Analyte	Spearman Correlation		Female		Male		Mann Whitney U Test
	rho	p-values	Median (µmol/L)	IQR*	Median (µmol/L)	IQR1	p-values
Phe	-0.38	9.30E-21	42.34	36.14-49.44	42.21	36.09-49.43	0.842
XLeu	0.49	5.05E-35	216.36	149.29-335.02	213.10	149.91-347.67	0.677
Met	-0.21	8.99E-07	30.42	21.25-43.53	28.83	21.5-40.04	0.633
Tyr	0.46	6.78E-31	93.84	72.67-115.06	92.17	71.08-115.74	0.467
Val	0.50	2.10E-37	127.77	106.77-150.94	128.84	105.28-147.00	0.535
Cit	0.05	2.03E-01	14.06	12.02-17.00	14.30	12.12-16.89	0.955
Ala	0.30	1.69E-13	190.78	155.77-229.23	183.80	155-217.67	0.139
Arg	0.52	2.24E-40	16.94	9.73-26.00	18.83	10.83-29.60	0.018
C0	-0.29	1.45E-12	28.34	22.24-36.87	30.92	24.46-38.66	0.004
C2	-0.28	1.90E-11	21.03	17.30-26.59	20.95	17.18-25.61	0.484
C3	-0.12	4.96E-03	1.04	0.78-1.44	1.10	0.82-1.48	0.133
C4	-0.10	1.81E-02	0.20	0.15-0.27	0.20	0.15-0.26	0.798
C5	0.02	6.19E-01	0.23	0.17-0.28	0.23	0.18-0.28	0.945
C5DC	-0.32	4.95E-14	0.10	0.06-0.14	0.10	0.07-0.15	0.107
C5OH	-0.10	1.29E-02	0.20	0.16-0.26	0.21	0.16-0.26	0.252
C6	-0.31	1.26E-13	0.14	0.10-0.18	0.14	0.10-0.20	0.573
C8	-0.31	2.32E-13	0.14	0.10-0.19	0.14	0.11-0.20	0.251
C10	-0.35	1.10E-17	0.15	0.10-0.20	0.15	0.11-0.21	0.086
C12	-0.38	1.57E-20	0.22	0.15-0.32	0.23	0.16-0.34	0.557
C14	-0.31	1.99E-14	0.28	0.21-0.37	0.31	0.22-0.39	0.024
C16	-0.39	2.23E-22	2.22	1.61-3.06	2.25	1.70-3.12	0.310
C16OH	-0.36	3.95E-17	0.08	0.05-0.13	0.08	0.06-0.12	0.560
C18	-0.36	3.97E-19	0.75	0.56-0.99	0.75	0.59-1.00	0.727
C18OH	-0.28	2.16E-10	0.06	0.04-0.09	0.06	0.04-0.09	0.938

*IQR is the range between percentile 25 and 75

Figure 1

Scatter plots for some A. amino acids (phenylalanine, methionine and leucine) and B. short-chain carnitine (free carnitine and isovalerylcarnitine) and long-chain carnitine (palmitoylcarnitine) by age. Mean, median, 1th and 99 percentiles and the regression line are highlighted. Each analyte has a different scale all measured in µmol/L.

When comparisons by gender were made, arginine was the only amino acid showing significant differences (p= 0.018, higher concentration in males), while, in the case of the ACs, free carnitine and myristoyl carnitine also presented significant differences with higher concentrations in males, with p-values of 0.004 and 0.024, respectively (Fig. 2, Table 3).

Figure 2

Box-whisker plots of analytes by gender for arginine, free carnitine and myristoylcarnitine. The boxes correspond to 25th and 75th percentile and the horizontal line is the median concentration for the analyte.

Discussion

Herein, we reported a methodology to simultaneously evaluate 57 analytes related to AAs, ACs and SUAC and associated with more than 40 IEMs, using automated tandem mass spectrometry (MS/MS) on dried blood spots collected from Colombian newborns. This methodology revealed the normal concentrations values of these analytes in an ethnically diverse population of 891 newborns. Based on the national birth rate of the country (663,908 birth/year) , this sample set represents a statistically significant population for the establishment of normal values for the analyzed metabolites that meets the requirements of the Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) guidelines . Results indicated that blood samples enriched with each analyte in filter paper spots (Quality control from CDC) and subsequently mixed with labelled internal standards (isotope dilution method) led to data linearity over a wide range of concentrations, as well as to low detection limits.

Limitation in samples collections, such as a suitable collection time, appropriate application of heel-stick blood to filter paper, sufficient drying before packaging, and timely shipment to the screening laboratory, was present in less than 10% of the samples. However, we found that the validation parameters established for this method displayed great precision and accuracy leading to CVs and recoveries according to internationally accepted values for bioanalytical methods to be considered reliable and reproducible . The variables used in the regression for each analyte were statistically significant with critical values of the F-distribution < 5% (ANOVA test), demonstrating therefore that the model implemented here was adequate. The usual concentration values calculated from all samples showed a higher cutoff for AAs and lower for ACs and SUAC, which was in agreement with the highest intake of proteins during infant feeding. In comparison with 1st and 99th percentile reported in Region 4 genetics for these metabolites, we found values in similar ranges for most of them using a much smaller population. Some carnitines including and Hidroxy-octadecanoylcarnitine (C18), showed much greater 99th percentile values compared with those reported by other laboratories, which could be a problem due to a possible increase of false negatives by overlapping between the higher cut-off of healthy infants and lower cutoff of sick infants. Although ACs mean concentrations were in a low range of 0.07-32.4 µmol/L, these were always above their LOD, which is important for diagnostic distinction from patients with some metabolic disorders .

Acylcarnitine profiles of dried blood samples were characterized by a decrease in the concentration of most of them as the child aged, consistent with data reported in previous studies . In the case of isovaleryl carnitine, which showed a slight increase in concentration with age, it could be attributed to its variability depending on external factors such as the use of antibiotics or hemolysis related to jaundice. Age should be considered an important factor in determination of reference concentration values, taking into account challenges related to diagnosis in older infants due to decreasing AC concentrations. The lower cut off values for these analytes could lead to a difficulty in diagnosing metabolic disorders that show carnitine deficiency. No significant differences were found between males and females for almost all metabolites, except for arginine, free carnitine and myristoylcarnitine, which showed a higher concentration for male neonates, in agreement with results previously reported for carnitines , .

Significant differences were observed between levels of analytes when Cali and Quibdo results were compared (data no shown). However, there were also differences in the mean age of the newborn enrolled in the two populations, while the newborn from Cali had a mean of 9 days (range: 4-18 days) age, Quibdo's newborn had a mean age of 2 days (range: 1-7 days). It is known that the age, drugs therapies, parenteral nutrition, transfusions and type of feeds can all potentially influence the results. These differences were taking into account when cut-off values were established.

Use of MS/MS for Newborn screening of IEM offer some advantages such as analytical sensitivity, selectivity and accuracy, with the possibility to measure several analytes in a single analysis and relatively low rate of interferences . Most of the limitations of the method presented here are related to the DBS, namely, blood sampling, chromatographic and volume effects, analyte stability and hematocrit effects , that in some cases, such as the inherent interpatient variation in the volume of blood contained in the blood spot punch, can be solve by strict adherence to the general standard guidelines . It has been suggested, that the integrity of dried blood spots can be compromised within a short time frame by humidity and temperature during transportation of the samples, a significant degradation of AAs and ACs in the blood spot at high temperature (45° C) and humidity (>70%), particularly in the first day of storage . Therefore, transportation and storage condition must be controlled. Moreover, most metabolites used for newborn screening depend on hematocrit and on position of the disk , . Although hematocrit levels in neonates are significantly variable (45-60 %), in most cases, metabolite concentrations exceed unequivocally their respective cut-off levels and hematocrit and/or location of disk do not significantly affect the diagnosis. However, it is important to clarify that within the methodology of our study, no hematocrit was measured before the metabolic tests.

In conclusion, this is the first report of analyses of characteristic metabolites for IEM diagnosis by MS/MS in Colombia such as it is done in developed countries. At present, the biochemical tests and analytical tools being used in Colombia do not have enough sensitivity and specificity when compared to MS/MS. Additionally, those techniques such as gas chromatography, and enzymatic and colorimetric methods use complex protocols with long treatment of samples and are restricted to a limited number of analytes associated with a few diseases. The application of advanced technology, such as automated electrospray MS/MS analysis, allowed detection of more than 40 IEM with a significant reduction in analysis time (2-3 min). Data reported here represents a significant contribution to establish normal concentration levels of AAs, ACs and SUAC to be used as reference for implementation of a new newborn metabolic screening program in Colombia based on MS/MS technology, allowing to define the national prevalence of IEM.

Introducción

Los errores innatos del metabolismo (EIM) son parte del grupo de las llamadas "enfermedades raras, olvidadas o huérfanas" que por fortuna afectan a muy pocas personas en el mundo. La incidencia puede estimarse en una persona por cada 2,000 habitantes para las enfermedades más comunes, pero en algunos casos puede ser tan baja como uno por cada 10,000 o más habitantes, lo que hace que estas enfermedades sean poco conocidas, estudiadas y tratadas, y como consecuencia desatendidas ,. Se estima que los EIM podrían afectar entre el 6-8% de la población mundial, sin embargo, los datos varían de un país a otro y en algunos como Colombia no hay datos disponibles debido a la falta de estudios epidemiológicos y las restricciones para un diagnóstico preciso.

Los EIM son enfermedades crónicas graves y degenerativas, con manifestaciones clínicas dolorosas e incapacitantes que van desde cuadros clínicos inadvertidos o que se confunden con otras enfermedades, con diversos grados de retraso mental y discapacidad física . Estas enfermedades pueden causar la muerte a una edad temprana, lo que crea una carga familiar y social considerable. El mayor problema con estas enfermedades es el diagnóstico tardío (5-10 años) o erróneo debido a la falta de laboratorios especializados que realizan exámenes precisos, lo que conduce a un retraso o falta de tratamiento. El diagnóstico precoz y el tratamiento adecuado y oportuno de estas enfermedades permiten a los pacientes llevar una vida casi normal, reduciendo las secuelas o al menos reduciendo sustancialmente los daños en los órganos.

La espectrometría de masas en tándem (MS/MS) es una tecnología que permite la detección e identificación simultánea de múltiples analitos con alta sensibilidad, exactitud y precisión, con alta especificidad. Basándose en estas propiedades, se ha incorporado la MS/MS como una herramienta de diagnóstico para el tamizaje de EIM en un sistema de capaz de detectar más de 50 analitos diferentes . Millington et al , fue el primero en desarrollar el método de análisis y posteriormente diferentes grupos trabajaron en optimizarlo y aplicarlo al tamizaje metabólico en neonatos , incluyendo la adición de succinilacetona (SUAC), como un marcador específico para la tirosinemia tipo I (Tyr I) ,, la MS/MS actualmente reemplaza las técnicas de tamizaje tradicionales que analizan biomarcadores individuales para cada enfermedad. En la actualidad, la MS/MS se utiliza para tamizaje neonatal en países desarrollados como Estados Unidos, Canadá, Alemania y España -, y en países de América Latina como México, Brasil y Costa Rica -. En Colombia no existe suficiente conciencia sobre este tema, lo que conduce a una falta de claridad en cuanto a las políticas de salud pública para su manejo . Actualmente, sólo el hipotiroidismo congénito está incluido en la lista de enfermedades obligatorias para el tamizaje, sin embargo, se sabe que aún la prueba no se realiza en muchas de las regiones del país.

Debido a la necesidad urgente de un método altamente sensible para el diagnóstico y el tamizaje eficiente de los EIM en Colombia, este estudio se enfoca en el establecimiento de valores de concentración de aminoácidos (AAs), acilcarnitinas (ACs) y succinilacetona (SUAC) normales en una muestra colombiana de recién nacidos utilizando como tecnología la MS/MS.

Materiales y Métodos

Sujetos

Un total de 891 recién nacidos sanos de Cali (n = 523, departamento del Valle del Cauca) y Quibdó (n = 368, departamento de Chocó) fueron reclutados entre agosto de 2012 y julio de 2015 e incluidos en el estudio. Las muestras de sangre fueron colectadas por punción en talón e impregnadas en papel de filtro (filtro Whatman nº903, GE Healthcare, Westborough, EE.UU.), luego se dejaron secar durante 24 horas a temperatura ambiente y posteriormente fueron almacenadas a 4º C hasta su uso, siguiendo las guías del Instituto de Normas Clínicas y de Laboratorio (CLSI) . Las muestras sobrantes fueron almacenadas y congeladas a -20º C con desecante.

Este ensayo se realizó de acuerdo con las Directrices para Buenas Prácticas Clínicas de la ICH E-6 y el protocolo fue aprobado por los comités de ética del Centro Internacional de Vacunas- CIV (CECIV de Cali, acto 005), Clínica Versalles (Cali) y el Hospital San Francisco de Asís (Quibdó). Se obtuvo el consentimiento informado por escrito (CI) de la madre de cada recién nacido al momento de la inscripción al estudio.

Criterios de Inclusión

Todos los niños incluidos en el estudio cumplieron con todos los criterios de inclusión para asegurar que no sufrían ningún trastorno o enfermedad. Los recién nacidos sanos de ambos sexos debían cumplir criterios como tener pesos entre 2,500 y 4,000 g, edades gestacionales entre 37 a 42 semanas, puntuación APGAR mayor de 7 a los 10 min y edad entre 2 y 18 días de nacidos.

Materiales

Estándares de AAs y AC marcados isotópicamente fueron adquiridos en Cambridge Isotope Laboratories, Inc .; la sal de sulfato de hidrazina y acetonitrilo de grado HPLC en Sigma-Aldrich, SUAC de HT Brink, del Hospital Universitario de Ámsterdam, el ácido fórmico y HCl 3 N n-butanol de Fluka. El papel de filtro 903 Protein Saver usado para muestras de muestras de sangre se compró a Whatman. Los controles basales, de baja, media y alta concentración en sangre fueron proporcionados por el Programa de Aseguramiento de Calidad de tamizaje neonatal (NSQAP) del Centro de Control y Prevención de Enfermedades (CDC) (Lote 1421-1424; 1462-1464). Las muestras de sangre secas se analizaron usando cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC) (Shimadzu Scientific Instruments, Columbia, MD) acoplada a un espectrómetro de masas en Tandem 3200 QTRAP (AB Sciex).

Preparación de la muestra

Discos de sangre seca (DSS) se perforaron a un diámetro de 3.2 mm, y cada uno se dispuso en un pozo de una placa de poliestireno de 96, a los cuales se adicionaron 120 µL de solución de trabajo preparada diariamente que contenía: acetonitrilo:agua (80:20 v/v), 0.08% de ácido fórmico, 3.6 mol/L de hidrato de hidracina y los estándar internos de AAs, ACs y SUAC. La placa fue sellada con microfilm autoadhesivo (Fisherbrand No 08-408-240) y agitada a 600 rpm a 45° C durante 45 min.

Los extractos fueron transferidos a una nueva placa de poliestireno de 96 pozos y fueron secados bajo atmosfera de N2 a temperatura ambiente por aproximadamente 25 min a 40° C. Después se adicionaron 50 µL de metanol y los pozos de nuevo se secaron durante 10 min. Las muestras fueron reconstituidas en 60 µL de n-butanol 3N HCl e incubadas a 65° C ±5° C por 20 min. La mezcla resultante se secó nuevamente durante 20 min, y los residuos fueron finalmente reconstituidos en 150 µL de fase móvil (acetonitrilo:agua 50:50 con 0.025% de ácido fórmico), la placa fue cubierta con papel aluminio, agitada por 10 min a temperatura ambiente, y centrifugada durante 4 min a 500 rpm antes de ser puesta en la bandeja del automuestreador para el análisis por MS/MS.

Análisis por MS/MS

Un espectrómetro de masas en tándem con analizadores en triple cuadrupolo lineal, operado en modo ión-positivo fue usado para el análisis de AAs, ACs y SUAC. Las muestras se analizaron usando como fase móvil acetonitrilo:agua 50:50 con 0.025% de ácido fórmico en modo isocrático, a un flujo de 70 µL/min en una corrida de 3 min por muestra usando una bomba binaria HPLC (Shimadzu Scientific Instruments, Columbia, MD).

El análisis fue realizado usando tres experimentos diferentes por corrida: 1. Perdida neutra de m/z 102 (rango de scan m/z: 130/280) para la detección de AAs, 2. Precursor iónico de m/z 85 (rango del scan 200-550) para ACs, y 3. Modo de reacción múltiple (MRM) para SUAC (m/z 211 → 137) y los AA con baja sensibilidad como la Arg (m/z 231 → 70), Gly (m/z 132 → 76), Leu (m/z 188 → 86), Met (m/z 206 → 104), Ser (m/z 162 → 60), His (m/z 156 → 110), OH-Pro (m/z 188 → 68), Thr (m/z 176 → 74) Ornitine (m/z 189 → 70) y Citruline (m/z 232 → 113). El software Analyst 1.5.2 (BioSciex) fue usado para la adquisición de los datos, y los programas Chemoview y Neoscreen fueron usados para el análisis de los datos. La cuantificación de los analitos de interés se realizó calculando la abundancia de iones de cada compuesto puro en relación con los estándares internos marcados isotópicamente (IS).

Linealidad y límite de detección

La linealidad del método para AAs, ACs y SUAC se estimó por duplicado mediante el análisis de los controles en DSS del CDC, a cuatro concentraciones diferentes entre 3.7 y 746.7 µmol/L para AAs, 0.1 y 52.8 µmol/L para ACs y 0.3 y 11.1 µmol/L para SUAC y a un intervalo de confianza (IC) del 95%. El límite de detección (LOD) se evaluó utilizando una linealización de los tres niveles de concentración inferior para cada analito, teniendo en cuenta el ruido de base como indicador de la sensibilidad del instrumento.

Precisión y exactitud

Tanto la repetibilidad como la precisión intermedia del ensayo para AAs, ACs y SUAC se estimaron a dos niveles de concentración (baja y media) de los controles en DSS del CDC. La repetibilidad se determinó por duplicado en cinco repeticiones, mientras que la precisión intermedia fue determinada por duplicado durante tres días y dos analistas diferentes. La precisión fue denotada como el coeficiente de variación (CV <20%) y valores de Cochran (<0.555) para la repetibilidad y reproducibilidad respectivamente.

La precisión del ensayo se determinó utilizando los controles en DSS del CDC a cuatro niveles de concentración (Lot: 1321-24 para AA y Lot: 1361-64 para AC) en tres series de corridas. La precisión se denominó como el error relativo (%RE), y debía estar dentro de ±20% RE para ser aceptado .

Análisis estadístico

Los datos se procesaron con R-project de Bell Laboratories (antes AT&T, ahora Lucent Technologies). Los resultados se expresan como coeficientes de correlación (R2) para la linealidad, valor crítico de la distribución F (análisis ANOVA) para el análisis de los valores de varianza, CV y Cochran para la precisión y porcentaje de recuperación para la exactitud. Se utilizó la prueba de Shapiro-Wilk para comprobar la normalidad; sin embargo, no hubo pruebas suficientes para decir que los datos se distribuyeran normalmente. Las comparaciones entre grupos por sexo y lugar del estudio se determinaron mediante la prueba U Mann Whitney y las correlaciones entre la edad y concentración de los analitos se determinaron usando la prueba de Spearman. Un valor de p ≤0.05 se consideró significativo.

Resultados

Validación del método

La linealidad del método se determinó utilizando cuatro niveles de concentraciones. Los coeficientes de regresión lineal (R²) para AAs, ACs y SUAC fueron >0.96 para todos los analitos (Tabla 1). Los rangos de linealidad se encontraban dentro de los rangos establecidos por el CDC. El análisis de varianza para la regresión mediante la prueba ANOVA mostró valores críticos de la distribución F muy inferiores al 5% para todos los analitos (Tabla 1).

Tabla 1

Validación del método

Analito	*LOD (µmol/L)	Rango lineal (µmol/L)	Linealidad	ANOVA	Precisión		Exactitud
			**R2	Valores críticos †F	¶CV	Cochran	§% ER
			≥0.95	<5%	≤ 20%	0.555	80 - 120%
Phe	0.10	71.8 - 325.4	0.998	3.399E-05	8.17	0.43	83.24
XLeu	1.43	116.0 - 445.7	0.966	2.681E-03	10.39	0.245	91.06
Met	4.97	11.4 - 214.2	0.980	1.236E-03	14.65	0.309	96.59
Tyr	0.33	49.7 - 489.4	0.993	2.567E-04	6.18	0.356	98.63
Val	2.27	121.4 - 428.6	0.991	3.389E-04	6.7	0.534	92.47
Cit	0.35	26.3 - 232.7	0.999	3.050E-07	4.78	0.455	109.94
Ala	1.50	292.8 - 625.5	0.978	1.374E-03	6.17	0.25	105.2
Arg	0.89	10 - 266.1	0.995	1.358E-04	5.9	0.484	84.34
SUAC	0.12	1.4 - 8.98	0.995	1.318E-04	6.78	0.374	104.79
Carnitine libre (C0)	0.04	25.9 - 79	0.971	2.104E-03	9.28	0.277	92.58
Acetil (C2)	0.08	12.9 - 39.4	0.939	6.500E-03	10.95	0.22	83.78
Propionil (C3)	0.14	1.3 - 12.4	0.999	8.953E-06	8.63	0.384	114.48
Butiril (C4)	0.09	0.2 - 4.4	0.992	3.003E-04	13.19	0.297	94.55
Isovaleril (C5)	0.01	0.1 - 2.4	0.999	7.922E-06	5.07	0.544	105.48
Glutaril (C5DC)	0.15	0.5 - 1.8	0.997	6.015E-05	13.64	0.336	88.96
3-OH-valeril (C5OH)	0.01	0.5 - 3.4	0.964	2.975E-03	5.05	0.304	79.77
Hexanoil (C6)	0.01	0.0 - 2.2	0.999	2.258E-06	8.82	0.554	113.21
Octanoil (C8)	0.06	0.0 - 2.3	0.983	9.102E-04	2.8	0.353	116.59
Decanoil (C10)	0.03	0.0 - 2.5	0.981	1.165E-03	7.37	0.332	113.11
Dodecanoil (C12)	0.01	0.0 - 2.1	0.991	3.672E-04	12.37	0.366	100.13
Myristoil (C14)	0.01	0.1 - 2.6	0.997	6.014E-05	12.66	0.467	107.1
Palmitoil (C16)	3.47*	0.9 - 9.2	0.958	3.752E-03	8.14	0.33	113.3
Hydroxy-Palmitoil (C16OH)	2.83*	0.0 - 0.9	0.995	1.664E-04	8.17	0.43	175.4
Estearoil (C18)	4.58*	0.6 - 5.7	0.996	9.952E-05	10.39	0.245	91.06
OH-Estearoil (C18OH)	3.75*	0.0 - 1.4	0.987	6.520E-04	14.65	0.309	96.59

LOD: Límite de detección

*R2: Coeficiente de correlación

†F: Valor crítico de distribución F

¶CV: Coeficiente de variación

§%ER: Error relativo

La exactitud del método se determinó mediante el análisis de muestras que contenían cantidades conocidas de cada analito en controles en DSS del CDC. Los datos de precisión obtenidos estuvieron en el rango de 83.2 a 109.9% para AAs, de 80.0 a 116.6% para ACs y 104.8% para SUAC (Tabla 1). Los LODs obtenidos para AA, AC y SUAC también se resumen en la Tabla 1, mostrando la detección más baja para fenilalanina (Phe) (0.1 µmol/L) y para la 3-hidroxipalmitoil-carnitina (C16OH) (2.83 nmol/L).

Concentraciones de AAs, ACs y SUAC en la población de estudio

Se incluyeron en este estudio un total de 891 neonatos sanos de entre 1 y 18 días de nacidos, 463 (52%) hombres y 428 (48%) mujeres. De ellos, 313 recién nacidos tenían entre 1 y 2 días, 257 entre 3 y 8 días y 321 entre 9 y 18 días. Las muestras en DSS se usaron para determinar los 25 analitos validados, y que forman parte de los controles de calidad entregados por el CDC, adicionalmente, se analizaron otros 32 analitos para completar un total de 57, de los cuales 17 eran AAs, 37 ACs y SUAC, que permiten identificar 50 patologías diferentes. Los marcadores específicos se seleccionaron de acuerdo con la información obtenida a partir de la página de mejoramiento de calidad de laboratorios de tamizaje neonatal de Region 4 y que fueron transferidos desde el Hospital Clínico Universitario, Santiago de Compostela, España al Centro Internacional de Vacunas, Cali.

En general, los AAs (n= 8, Tabla 2) tenían concentraciones medias que oscilaban entre 15 y 247 µmol/L. De ellos, xLeu (media 247 µmol/L), Ala (192 µmol/L) y Val (128 µmol/L) fueron los AAs más abundantes, mientras que Citrulina (15 µmol/L) y Arg (20 µmol/L) presentaron las concentraciones más bajas. Por otra parte, las ACs con cadenas más cortas fueron las más concentradas, mientras que las de cadenas más largas fueron las menos abundantes. Se observaron las concentraciones más altas para la carnitina libre (32 µmol/L) y acetil carnitina (23 µmol/L), mientras que la hidroxiestearoil carnitina (C18-OH) (0.07 µmol/L) fue la menos abundante. La Palmitoyl carnitina (C16) fue la de mayor concentración entre las ACs de cadenas largas (Tabla 2).

Tabla 2

Valores de concentración de referencia para concentración de aminoácidos (AAs), acilcarnitinas (ACs)

Analito	Media (µmol/L)	DS	*P1	**P99
Phe	44.27	11.78	23.92	78.94
XLeu	246.72	121.16	72.61	536.72
Met	35.50	19.71	11.00	101.91
Tyr	96.27	34.72	37.03	201.25
Val	128.42	32.10	59.18	204.00
Cit	14.95	4.56	7.81	27.52
Ala	192.01	53.86	91.43	348.82
Arg	19.94	11.48	4.40	52.07
C0	32.39	13.71	13.63	78.74
C2	22.69	8.62	9.02	54.31
C3	1.24	0.73	0.23	4.05
C4	0.22	0.15	0.07	0.64
C5	0.24	0.09	0.09	0.59
C5DC	0.12	0.07	0.03	0.36
C5OH	0.22	0.09	0.10	0.55
C6	0.16	0.09	0.04	0.51
C8	0.16	0.08	0.05	0.43
C10	0.17	0.09	0.05	0.45
C12	0.27	0.16	0.08	0.81
C14	0.32	0.15	0.10	0.84
C16	2.48	1.19	0.72	6.17
C16OH	0.1	0.06	0,02	0,27
C18	0.83	0.36	0.30	2.00
C18OH	0.07	0.05	0.02	0.26

DS: Desviación estándar

Percentile 1: límite de aceptación inferior

*Percentile 99: límite de aceptación superior

Distribución por edad y sexo

Se compararon las concentraciones normales de AAs y ACs con respecto a factores como la edad y el sexo. Los datos no mostraron una distribución normal cuando fueron evaluados usando la prueba de normalidad de Shapiro-Wilk, por lo que se utilizaron pruebas no paramétricas para verificar las diferencias entre concentraciones de AAs y ACs con respecto a los diferentes factores.

La concentración de analitos tuvo una correlación significativa, con un rho que osciló entre 0.02 y 0.52 para las relaciones positivas y -0.06 y -0.39 para las relaciones negativas (Tabla 3). Para los AAs, sólo la fenilalanina y la metionina tuvieron una correlación negativa (Fig. 1A), mientras que para los ACs, en todos los casos excepto el Isovaleril (C5, rho=0.02) la correlación entre la concentración y la edad fue negativa (rho <0) (Fig. 1B, Tabla 3), indicando que la concentración de estos analitos disminuye ligeramente con la edad, mientras que aumenta con la edad para el isovaleril y la mayoría de los AAs.

Tabla 3

Análisis estadístico por edad (Correlación de Spearman) y sexo (Prueba de Mann Whitney U).

Analito	Correlación de Spearman		Niña		Niño		Prueba de Mann Whitney U
	rho	valor p	Mediana (µmol/L)	IQR*	Mediana (µmol/L)	IQR1	valor p
Phe	-0.38	9.30E-21	42.34	36.14-49.44	42.21	36.09-49.43	0.842
XLeu	0.49	5.05E-35	216.36	149.29-335.02	213.10	149.91-347.67	0.677
Met	-0.21	8.99E-07	30.42	21.25-43.53	28.83	21.5-40.04	0.633
Tyr	0.46	6.78E-31	93.84	72.67-115.06	92.17	71.08-115.74	0.467
Val	0.50	2.10E-37	127.77	106.77-150.94	128.84	105.28-147.00	0.535
Cit	0.05	2.03E-01	14.06	12.02-17.00	14.30	12.12-16.89	0.955
Ala	0.30	1.69E-13	190.78	155.77-229.23	183.80	155-217.67	0.139
Arg	0.52	2.24E-40	16.94	9.73-26.00	18.83	10.83-29.60	0.018
C0	-0.29	1.45E-12	28.34	22.24-36.87	30.92	24.46-38.66	0.004
C2	-0.28	1.90E-11	21.03	17.30-26.59	20.95	17.18-25.61	0.484
C3	-0.12	4.96E-03	1.04	0.78-1.44	1.10	0.82-1.48	0.133
C4	-0.10	1.81E-02	0.20	0.15-0.27	0.20	0.15-0.26	0.798
C5	0.02	6.19E-01	0.23	0.17-0.28	0.23	0.18-0.28	0.945
C5DC	-0.32	4.95E-14	0.10	0.06-0.14	0.10	0.07-0.15	0.107
C5OH	-0.10	1.29E-02	0.20	0.16-0.26	0.21	0.16-0.26	0.252
C6	-0.31	1.26E-13	0.14	0.10-0.18	0.14	0.10-0.20	0.573
C8	-0.31	2.32E-13	0.14	0.10-0.19	0.14	0.11-0.20	0.251
C10	-0.35	1.10E-17	0.15	0.10-0.20	0.15	0.11-0.21	0.086
C12	-0.38	1.57E-20	0.22	0.15-0.32	0.23	0.16-0.34	0.557
C14	-0.31	1.99E-14	0.28	0.21-0.37	0.31	0.22-0.39	0.024
C16	-0.39	2.23E-22	2.22	1.61-3.06	2.25	1.70-3.12	0.310
C16OH	-0.36	3.95E-17	0.08	0.05-0.13	0.08	0.06-0.12	0.560
C18	-0.36	3.97E-19	0.75	0.56-0.99	0.75	0.59-1.00	0.727
C18OH	-0.28	2.16E-10	0.06	0.04-0.09	0.06	0.04-0.09	0.938

*IQR es el rango entre el percentil 25 y 75

Figura 1

Diagramas de dispersión para algunos AAs. A. Aminoácidos (fenilalanina, metionina y leucina) y B. carnitina de cadena corta (carnitina libre e isovalerilcarnitina) y carnitina de cadena larga (palmitoilcarnitina) por edad. Se resaltan la media, mediana, los percentiles 1º y 99º y la regresión lineal. Cada analito tiene una escala diferente, todos ellos medidos en µmol/L.

Cuando se hicieron comparaciones por sexo, la arginina fue el único aminoácido que mostró diferencias significativas (p= 0.018, mayor concentración en los hombres), mientras que en el caso de los AC, la carnitina libre y la miristoil carnitina también presentaron diferencias significativas con concentraciones más altas en los hombres, con valores p de 0.004 y 0.024, respectivamente (Fig. 2, Tabla 3).

Figura 2

Diagramas de caja y bigotes por sexo para la arginina, la carnitina libre y la miristoilcarnitina. Las cajas corresponden al percentil 25 y 75 y la línea horizontal es la concentración media del analito.

Discusión

Aquí reportamos una metodología para evaluar simultáneamente 57 analitos relacionados con AAs, ACs y SUACs, asociados con más de 40 EIMs utilizando la MS/MS a partir de DSS recolectada de recién nacidos de Colombia. Esta metodología permitió determinar los valores normales de concentración de estos analitos en una población étnicamente diversa de 891 recién nacidos. Basado en la tasa nacional de natalidad (663,908 nacimientos/año) , este tamaño de muestra representa una población estadísticamente significativa para el establecimiento de valores normales de los metabolitos analizados y cumple con las guías del Instituto de Normas Clínicas y de Laboratorio (CLSI) .

Se observó que el método mostró una correlación lineal en una amplia gama de concentraciones, así como límites de detección bajos cuando se evaluaron muestras de sangre enriquecidas con los analitos de estudio preparados en DSS (controles de calidad del CDC), y posteriormente mezclados con estándares internos marcados isotópicamente. En general, no se observaron problemas mayores en la toma y manejo de las muestras, en menos del 10% de las muestras se presentaron problemas de calidad de los DSS, secado insuficiente o retrasos en tiempo de entrega. Los parámetros de validación establecidos mostraron una gran precisión y exactitud, que se evidencia en los CVs y los porcentajes de recuperación que se encuentran dentro de los valores aceptados internacionalmente para métodos bioanalíticos .

Las variables utilizadas en la regresión para cada analito fueron estadísticamente significativas con valores críticos de la distribución F <5% (prueba ANOVA), demostrando por lo tanto que el modelo implementado fue adecuado. Las concentraciones calculadas a partir de las muestras de recién nacidos mostraron los límites más altos para AAs y más bajos para ACs y SUAC, lo que se correlaciona con una mayor ingesta de proteínas durante la alimentación del lactante.

Cuando se comparan los percentiles 1 y 99 con los reportados por Región 4 genetics para estos metabolitos, se observan valores en rangos similares para la mayoría de ellos usando una población mucho más pequeña. Algunas carnitinas, entre ellas la Hidroxi-octadecanoilcarnitina (C18), mostraron percentiles más altos (99) en comparación con los reportados por otros laboratorios, lo que podría representar un problema debidos al posible aumento de falsos negativos al superponerse entre el corte superior de lactantes sanos y el corte inferior en lactantes enfermos.

Aunque las concentraciones medias de ACs estuvieron en un rango bajo de 0.07 -32.4 µmol/L, éstas estuvieron siempre por encima de su LOD, lo cual es importante para la identificación de pacientes con algunos trastornos metabólicos . Los perfiles de acilcarnitina en DSS de recién nacidos se caracterizaron, en la mayoría de los casos, por una disminución en la concentración a medida que el niño crecía, acorde con datos reportados en estudios previos .

En el caso de la isovaleril carnitina, que mostró un ligero aumento de la concentración con la edad, podría atribuirse su variabilidad a factores externos como el uso de antibióticos o la hemólisis relacionada con la ictericia. La edad debe considerarse como un factor importante en la determinación de los valores de concentración de referencia, teniendo en cuenta las dificultades relacionadas con el diagnóstico en los lactantes de más edad debido a la disminución de las concentraciones de ACs. Los valores de corte más bajos para estos analitos en niños mayores podrían conducir a una dificultad en el diagnóstico de trastornos metabólicos que muestren deficiencia de carnitina.

No se encontraron diferencias significativas entre niños y niñas para la mayoría de los metabolitos, excepto en el caso de la arginina, la carnitina libre y la miristoilcarnitina, que mostraron una mayor concentración para los neonatos hombres, estos resultados se correlacionan con estudios previamente reportados para las carnitinas ,.

Se observaron diferencias significativas entre las concentraciones en DSS de los analitos cuando se compararon los resultados entre Cali y Quibdó (datos no mostrados). Sin embargo, también hubo diferencias en la edad media de los recién nacido captados en las dos poblaciones, mientras que los recién nacidos de Cali tenían una media de 9 días (rango: 4-18 días), los recién nacidos de Quibdó tenía una edad media de 2 días (rango: 1-7 días) de nacidos. Se sabe que la edad, las terapias farmacológicas, la nutrición parenteral, las transfusiones y el tipo de alimentación pueden influir potencialmente en los resultados. Estas diferencias se tuvieron en cuenta al establecer los valores límite.

El uso de MS/MS para la detección de EIM en recién nacidos ofrece algunas ventajas como la sensibilidad analítica, selectividad y precisión, con la posibilidad de medir varios analitos en un solo análisis con una tasa de interferencias relativamente baja . La mayoría de las limitaciones del método que se presenta aquí, están relacionadas con la calidad de los DSS, la toma de muestras de sangre, los efectos cromatográficos y volumétricos, la estabilidad del analito y los efectos de hematocrito , que en la mayoría de los casos, puede resolverse mediante la estricta adherencia a las guías clínicas y de laboratorio .

Se ha sugerido que la integridad de las muestras de sangre seca en papel de filtro puede verse comprometida en un corto periodo de tiempo por la humedad y la temperatura a la que son expuestas durante el transporte de las muestras, se puede presentar una degradación significativa de los AA y AC en las muestras de sangre a alta temperatura (45° C) y humedad (>70%), particularmente en el primer día de almacenamiento . Por lo tanto, se deben controlar las condiciones de transporte y almacenamiento de las muestras. Por otra parte, la mayoría de metabolitos utilizados para la evaluación EIM en el recién nacido dependen del hematocrito y de la posición de corte en el disco ,. Aunque los niveles de hematocrito en neonatos son significativamente variables (45-60%), en la mayoría de los casos las concentraciones de metabolitos exceden inequívocamente sus respectivos niveles de corte y el hematocrito y/o la localización del disco no afectan significativamente el diagnóstico. Sin embargo, es importante aclarar que dentro de la metodología de nuestro estudio, no se midió el hematocrito antes de las pruebas metabólicas.

En conclusión, este es el primer reporte de análisis de los metabolitos característicos para el diagnóstico de EIM por MS/MS en Colombia, tal como se realiza en los países desarrollados. Actualmente, las pruebas bioquímicas y las herramientas analíticas que se utilizan en Colombia no tienen suficiente sensibilidad y especificidad en comparación con la MS/MS. Además, las técnicas como la cromatografía de gases y los métodos enzimáticos y colorimétricos utilizan protocolos complejos con un tratamiento prolongado de las muestras y se restringen a un número limitado de analitos asociados con unas pocas enfermedades. La aplicación de tecnología avanzada, como el análisis automatizado de MS/MS con ionización en electrospray, permite la detección de más de 40 EIM con una reducción significativa del tiempo de análisis (2-3 min).

Los datos reportados aquí representan una contribución significativa para establecer los niveles normales de concentración de AAs, ACs y SUACs para ser usados como referencia para la implementación de un programa de tamizaje metabólico de recién nacidos en Colombia basado en la tecnología MS/MS, que permita definir la prevalencia nacional de estas EIM.