Serological and molecular analysis of parvovirus B19 infection in Mayan women with systemic lupus erythematosus in Mexico.

BACKGROUND: Systemic lupus erythematosus (SLE) is a systemic autoimmune disease that mainly affects women, characterized by the production of autoantibodies. Its causal agent is unknown, but the combination of environmental, hormonal and genetic factors may favor the development of the disease. Parvovirus B19 has been associated with the development of SLE, since it induces the production of anti-single stranded DNA antibodies. It is unknown whether PV-B19 infection is an environmental factor that trigger or reactivate SLE in the Mexican Mayan population. AIM: A preliminary serological and molecular study of PV-B19 infection in Mayan women with established SLE was done.
METHODS: IgG and IgM anti PV-B19 were evaluated in 66 SLE patients and 66 control subjects, all women of Mayan origin. Viral DNA and viral load were analyzed by qPCR.
RESULTS: Insignificant levels of IgM were observed in 14.3% (4/28) of the patients and 11.4% (4/35) of control subjects. IgG was detected in 82.1% (23/28) of the patients and 82.9% (29/35) of control subjects, but were significantly higher in patients. Viral DNA was found in 86.0% (57/66) of the patients and 81.0% (54/66) of control subjects. Viral load, quantified in 28/66 patients and 31/66 controls which were positive for IgM and IgG, was significantly higher in controls.
CONCLUSION: The high prevalence of PV-B19 in Yucatan, and the presence of IgM, IgG, and viral load in Mayan women with established SLE suggest that PV-B19 infection could be an environmental factor to trigger or reactivate SLE.

Introduction

Systemic lupus erythematosus (SLE) is a chronic inflammatory systemic autoimmune disease of unknown etiology, caused by the interaction of genetic and environmental factors that contribute to the production of autoantibodies against self-antigens. The disease has a worldwide distribution and predominantly affects women - . Asian countries such as China, Hong Kong, Philippines and Japan, has reported more cases, and others like the United States, France, Spain, UK, and some regions of Australia, has presented increase in patients , . Several studies have been conducted in patients from different populations (Asian, European, American), but few in Mexican population.

Mexico has an admixed Mestizo population with a genetic pool from the Amerindian and the Spanish . The ancestry data derived from the HapMap project, which included Mexicans, shows that the Yucatan mestizos are the only ethnic group with Amerindian ancestry that are geographically distant from other Amerindian groups . On the other hand, Mexican individuals with SLE appear to have a more severe disease than European, a lower age of onset and a higher frequency of disease activity flares. Also, it has been reported that the prevalence of SLE in Yucatan (0.7%) is slightly higher than the national prevalence (0.6%) , .

Environmental factors such as bacterial, parasitic, fungal and viral infections have been associated with the pathogenesis of the disease in genetically predisposed patients , . It has been reported that various viruses and bacteria can produce superantigens which, through mechanisms such as adjuvant effect (bystander) and molecular mimicry, induce activation of autoreactive T and B lymphocytes. Viral particles in infected B lymphocytes can lead to the production of autoantibodies and cytokines such as IFN-α, contributing to autoimmune and inflammatory mechanism. Epstein-Barr virus (EBV), Cytomegalovirus (CMV), Human T-lymphotropic virus 1 (HTLV-1), and Parvovirus B19 (PV-B19) have been linked to the pathogenesis of SLE , .

Human PV-B19, which was identified in 1975 by Yvonne Cossart and her colleagues , is a small single-strand DNA virus (22-24 nm diameter) that causes a variety of diseases in humans. Its icosahedral capsid is composed of two identical structural proteins, VP1 (83 kDa) and VP2 (58 kDa), except for an additional fragment of 277 amino acids at the amino terminus of VP1. This unique VP1 region is external to the capsid, with many linear epitopes and phospholipase A2 activity (PLA2), which causes cytotoxicity and infectivity. PV-B19 also has the nonstructural protein NS1 (77kDa) involved in its transcription and translation . Three genotypic variants of PV-B19 have been identified: genotype 1 has a worldwide distribution; genotype 2 has been detected in patients from several European countries, the United States and Brazil; genotype 3 is most frequently in Africa and less frequently in other geographical areas - .

PV-B19 is transmitted by respiratory aerosol spread from individuals acutely infected, or by parenteral transmission via blood transfusion and blood products - . The virus replicates in the erythroblasts in the bone marrow, which express the blood group P antigen or globoside (Gb4), the alpha5beta1 integrin, and the Ku80 protein . Viral replication, leading to viremia on day 6, appears to be important in most clinical manifestations. Most infections are asymptomatic or have mild clinical pictures, but when the infection is associated with age-influenced clinical disorders or immune and hematologic status, it presents a wide variety of clinical manifestations that may be confused with systemic autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis (RA), progressive systemic sclerosis, Sjögren's syndrome (SS), vasculitis or SLE - . PV-B19 infection may be misdiagnosed as a new onset SLE, but at the same time, can both occur simultaneously in some patients.

PV-B19 is a ubiquitous virus, distributed worldwide, which can infect any age group. Primary infection usually occurs in childhood and adolescence. Seroprevalence (presence of specific IgG denoting past infection) increases with age. In industrialized countries, it is estimated from 2% to 10% in children under five years, that could increase up to 50% at the age of 15 and in adults it varies from 40% to 70%. By the age of 70, it becomes 80% to 100% , . Japan and Germany have reported high infections rates in pregnant women , .

In Mexico, there are few clinical and epidemiological studies of PV-B19. Tapia et al. , determined IgM and IgG in 128 people from groups considered at high risk of infection with PV-B19, and healthy people of all age groups and both sexes, in the Infectious Diseases Hospital at la Raza Medical Center. The results showed the presence of infection especially in women (63.2%) of 25-44 years (48.4%), with exanthems, habitual abortion, and anemia in immunocompromised patients or hematologic disorders. In 61 patients (47.6%), higher IgG antibodies were found, and only 4 of them had IgM. Vera et al. ,conducted a preliminary prospective study of 102 pregnant women in two rural towns of Yucatan, Mexico, founding a seroprevalence of 5.9% of IgM and 11.8% of IgG; confirming the presence of PV-B19 infection in these populations.

Several studies have been focused on the diagnosis of PV-B19 infection, but the relationship of PV-B19 with stablished SLE has not been studied in Mayan population of Mexico. Our objective was to perform a preliminary serological and molecular analysis of PV-B19 infection in women of the Mayan population with established SLE and healthy women. IgM and IgG anti-PVB19, presence of viral DNA and viral load were evaluated in both groups.

Materials and Methods

SLE patients

Sixty-six SLE women of Mayan origin, were recruited at the Rheumatology outpatient of the Agustin O'Horán and ISSSTE Regional Hospital, Yucatan. Diagnosis was established according American College of Rheumatology (ACR) criteria , and disease activity was evaluated by SLEDAI score . SLE women reported having different times with the disease. Sixty-six healthy women of the same origin with no history of autoimmune or infectious diseases as controls were studied. None of them were receiving any treatment. All women included gave their informed consent, according to the Declaration of Helsinki. The study was approved by the Research Ethics Committee of the Agustin O'Horán Hospital of Yucatan (CIE-008-1-11). All women gave 10 mL of venous peripheral blood (without anticoagulant) in one collection to obtain serum.

IgM and IgG anti-PV-B19

Two commercially available ELISA kits for detection of anti-B19 IgM (EIA-3504) and anti-B19 IgG (EIA-3503) (DRG Instruments GmbH, Germany) were used . Microtiter wells as a solid phase are coated with recombinant Parvovirus B19 antigen (VP1 proteins). Diluted serum from patients and controls, and ready-for-use controls, are pipetted into these wells. During incubation Parvovirus B19-specific antibodies of positive serum and controls are bound to the immobilized antigen. Subsequently, the specific human anti-IgG or anti-IgM conjugated to horseradish peroxidase (HRP) is added. The reaction is visualized by adding tetramethylbenzidine (TMB) which generates a blue color. The enzymatic reaction is stopped by addition of sulfuric acid solution (H2SO4), which develops a yellow color. The color intensity is proportional to antibody concentration. Reading was performed at a wavelength of 450 nm in an ELISA reader (model BioTek(r) ELx800), and antibody concentration was determined by the following formula:

Where:

Abs = sample absorbance

10 = constant to compare absorbance (cut-off and control samples)

CO = Cut-off control mean absorbance

Antibody concentration is expressed in DU (DRG units, exclusive measure of supplier used to have a parameter measurement of immunoglobulins), taking the absorbance cutoff control as reference. Each assay was performed in duplicate using the positive, negative and cutting controls, contained in the kit. Results were interpreted as follows: IgM positive >11 DU, IgG positive >12 DU, IgM negative <9 DU and, IgG negative <8.5 DU, respectively.

DNA isolation

DNA extraction was performed on IgM and IgG positive sera from patients and controls by saturated phenol method . This procedure was based on the classical phenol/cloroform extraction method using 200 (L of serum samples. Solution of chloroform-isoamyl alcohol (24:1) was added to separate protein, and the DNA was precipitated with 100% ethanol and 7.5 M ammonium acetate for 24 h at -20° C. The DNA pellet was washed twice with 70% ethanol, dried in the oven at 37° C for 1 h, and then resuspended in 30 (L of ultrapure water. After incubation of 20 min at 56° C, the DNA was quantified in a spectrophotometer (Nanodrop (tm) Thermo Scientific® 2000c), at wavelengths of 260 and 280 nm. DNA was stored at -20° C prior to use.

Cloning

To determine the presence of viral DNA and to quantify the viral load, a segment of the NS1 protein was cloned from the viral DNA extracted from the serum of a patient diagnosed with PVB19 and was used as a positive control. The 168 bp band corresponding to the protein NS1, was amplified using the Maxima Hot Start Taq DNA polymerase (Thermo Scientific) and primers (0.5 µM) as follows: 4 min initial denaturation at 95º C, following by 40 cycles of denaturation (95° C for 30 sec), primer annealing (55° C, 30 sec), extension step of 1 min at 72º C, and a final holding stage at 72° C for 10 min. PCR products were identified by electrophoresis in agarose 1% stained with GelRed (GelRed(tm) Nucleic Acid Gel Stain. Biotium). The band was purified by centrifugation (Wizard SV Gel and PCR Clean-up system kit, Promega), and ligated to pCR 2.1-TOPO cloning vector (TOPO-TA Cloning kit, Invitrogen by Life Technologies). The ligation product was introduced into chemically competent E. coli cells (One Shot® TOP10 Competent Cells, Invitrogen by Life Technologies) at 42° C/30 s, and were seeded in LB solid medium with kanamycin (50 µg/mL) overnight at 37° C. White colonies expressing plasmid were selected and seeded in the liquid LB medium overnight at 37° C. Plasmid was purified (PureLink Quick Plasmid DNA Miniprep kit. Invitrogen by Life Technologies), and visualized by electrophoresis in agarose 1% stained with GelRed. The presence of the insert was determined by PCR using the Maxima Hot Start Taq DNA polymerase (Thermo Scientific). Purified plasmids were analyzed by BLAST and compared with the reported sequences of NS1 gene of PV-B19 in the GenBank.

Detection of PV-B19 DNA

Viral DNA (15 ng) was amplified by real time-PCR, designed according to MIQE guidelines . Primers and probes used in amplification reactions were described by Bonvicini et al. , (B19 primer forward 5'-CGCCTGGAACASTGAAACCC-3', B19 primer reverse 5´-TCAACCCCWACTAACAGTTC-3', and genotype 1 probe 6FAMGTTGTAGCTGCATCGTGGGAAGAMGBNFQ). They were designed by Applied Biosystems and directed against the non-structural protein 1 (NS1, 616-2631 nucleotides) of PV-B19 genotype 1. Amplification conditions were as follows: 20 sec of initial denaturation at 95º C, following by 50 cycles of amplification: denaturation (95° C for 3 s), primer annealing (55° C, 40 s), and a final incubation 30 s at 60º C. Amplification was carried out in the StepOne (tm) Real-Time PCR System equipment using TaqMan Fast Virus 1 step Master Mix (Applied Biosystems). Analysis of viral DNA (presence/absence of NS1, and genotype 1) was performed according to the CT (cycle threshold). The CT is the cycle at which the fluorescence level reaches a certain amount (the threshold). This method directly uses the CT information generated to calculate relative expression in target and reference samples, using as reference a negative sample .

Viral load

IgM and IgG positive samples were quantified by real time PCR using the same primers and probe, described above. Viral load was quantified using a standard curve assay with different copy number of the plasmid containing the fragment of 168 bp of the NS1 gene (4,099bp). The number of copies of the 6-point standard curve was determined using the URI Genomics & Sequencing Center software (http://cels.uri.edu/gsc/cndna.html). This calculation was based on the assumption that the average weight of a base pair (bp) is 650 Daltons. This means that one mole of a bp weighs 650 g and that the molecular weight of any double stranded DNA template can be estimated by taking the product of its length (in bp) and 650. The inverse of the molecular weight is the number of moles of template present in one gram of material. Using Avogadro's number, 6.022x1023 molecules/mole, the number of molecules of the template per gram is calculated. The number of copies of template was estimated by multiplying by 1x109 to convert to ng and then multiplying by the amount of template (in ng). The formula used, starting from an initial concentration of 1ng, was:

(1 ng x 6.022 x 1023) / (4099 x 1 x 109 x 650) = 2.25 x 108 copies.

Five serial dilutions at 10 were included (Table 1). Each sample and standard curve were tested by triplicate. Amplification conditions were as follows: 2 min pre-heating at 50º C, 10 min polymerase activation at 95º C, following by 50 cycles of denaturation (95° C for 15 s), primer annealing (55° C, 40 s), extension step of 20 s at 72º C, and a final holding stage at 60° C for 30 s. Amplification reaction was performed in the StepOne (tm) Real-Time PCR System equipment (Applied Biosystems), using the Maxima Probe/ROX master mix (Thermo Scientific), primers (0.5 µM), and probe (0.1 µM). The number of copies in the samples was calculated with the StepOne software taking into account the average of CT values obtained with respect to the standard curve. Viral load are expressed in copies per milliliter of serum (cps/mL).

Table 1

Number of copies of the standard curve, determined in triplicate with the URI Genomics & Sequencing Center software, as described in Material and methods.

Standard curve (ng)	Number of copies
1	2.25 x 108
0.1	2.25 x 107
0.01	2.25 x 106
0.001	2.25 x 105
0.0001	2.25 x 104
0.00001	2.25 x 103

Statistical Analysis

Wilcoxon matched-pairs signed rank test was used to assess the significance of any difference in values of IgM and IgG, and viral load (cps/mL) among SLE patients and control subjects (p <0.05). Correlation analysis was done using the Pearson correlation coefficient. In all comparisons, the level of significance was p <0.05, using the Graph Pad Prism 5 software.

Results

Characteristics of SLE patients and controls

The average age of the patients and controls was 39.03 and 38.18 years, respectively. The average time with disease in patients was 9 years (Table 2). All female patients were under treatment, 56.1% of them had active disease determined by SLEDAI (>4).

Table 2

Characteristics of SLE patients (n=66).

Features	SLE patients
Mean age (year)	39.0
Mean Disease duration (year)	9.9
SLEDAI (%)
Active (≥ 4)	56.1
Nonactive (< 4)	43.9
Locality in the Yucatan State(%)
Mérida	53.0
Hunucmá	3.0
Maxcanú	3.0
Motul	3.0
Peto	4.6
Progreso	3.0
Other in Yucatan State	30.0
Treatment(%)
Prednisone	54.5*
Azathioprine	39.4*
Metotrexate	13.6*
Deflazacort	18.2*
Hydroxycloroquine	19.7*

SLEDAI: Systemic Lupus Erythematosus Disease Activity Index.

* Percentage of patients receiving the drug in combination with other one

Levels of IgM and IgG anti PV-B19

Antibodies were detected in 42.4% (28/66) of SLE patients and 53.0% (35/66) of controls. We found 14.3% (4/28) of patients and 11.4% (4/35) of controls with no significant levels of IgM (p= 0.7922). On the other hand, 82.1% (23/28) of patients and 82.9% (29/35) of controls showed IgG, but significantly higher levels were detected in patients (p= 0.0353) (Table 3 and Fig. 1). Only one patient and two controls have both IgG and IgM. We found 58.3% (14/24) of patients with disease duration of 4 years or more presented IgG, but no correlation was observed. Correlation was also not observed in those who presented less than 4 years (41.7%, 10/24) (Fig. 2). Association analysis of IgG and IgM with SLEDAI was performed but no correlation was observed between IgM levels and disease activity (SLEDAI >4). However, IgG levels showed significant negative correlation in patients with lower disease activity (SLEDAI <4) (Fig. 3).

Table 3

IgM and IgG anti-PV-B19 in SLE patients (n = 66) and controls (n = 66), analyzed by ELISA as described in Material and methods.

Antibody	SLE patients (n (%))	Controls (n (%))
IgM >11 DU	4 (14.3)	4 (11.4)
IgG >12 DU	23 (82.1)	29 (82.9)
IgG and IgM	1 (3.6)	2 (5.7)
Total	28 (42.4)	35 (53.0)

Figure 1

Levels of IgM and IgG anti-PV-B19 in SLE patients (n= 28) and controls (n= 30), analyzed by ELISA as described in Material and methods. Results expressed in DU units are presented in scatter plots and mean with SME (standard mean error). Wilcoxon matched-pairs signed rank test was used to assess the difference of expression among SLE patients and control subject (p <0.05).

Figure 2

Correlation analysis of IgG anti-PV-B19 with evolution time (≥4 or ≤4 years) in SLE patients. Results are presented in scatter plots. Pearson correlation test was used to assess correlation. r= Pearson correlation coefficient; p <0.05.

Figure 3

Correlation analysis of IgM and IgG anti-PV-B19 with disease activity (SLEDAI >4 or <4) in SLE patients. Results are presented in scatter plots. Pearson correlation test was used to assess correlation. r= Pearson correlation coefficient; p <0.05.

Detection of PV-B19 DNA and viral load

The sequenced fragment of NS1 protein, used as positive control, was analyzed by BLAST and showed 100% of homology with reported sequences of NS1 gene of PV-B19 in GenBank 43-45 (Fig. S1). The sequence was registered in the GenBank (BankIt1994458 Human KY680313). PV-B19 DNA of genotype 1 was detected in 86.4% (57/66) and 81.8% (54/66) of patients and controls, respectively (Table S1). Viral load was quantified in 28/66 SLE patients and 30/66 healthy controls, which were positive for IgM and IgG (Table S2). We found that 67.9% (19/28) of patients presented viral load: 10.7% (3/28) with IgM and 57.1 % (16/28) with IgG. It was also found viral load in 80.0% (24/30) of the controls: 13.3% (4/30) with IgM and 66.7 % (20/30) with IgG, respectively (Table 4). Viral load was no detected in patients with IgM (1/28), IgG (7/28), or both (1/28), neither in controls subjects with IgG (5/30), or IgM and IgG (1/30) (Table S2). No correlation of IgM or IgG with viral load was found in both groups; however, viral load was significantly higher in the controls with IgG (Fig. 4). A graph representing the number of copies of the standard curve is shown with the CT values of a sample (Fig. 5).

Figure S1

Alignment of sequenced fragment of NS1 protein of PV-B19 with reported sequences in GenBank.

Table S1

Presence/absence of viral DNA and IgM or IgG in SLE patients (n = 66) and

SLE Patients	Presence Absence	IgM (DU)	IgG (DU)	Healthy controls	Presence Absence	IgM (DU)	IgG (DU)
1	P	2.50	3.74	1	A	2.40	2.20
2	P	1.90	16.00	2	P	2.80	1.76
3	P	3.83	90.75	3	A	2.00	4.80
4	P	5.95	56.00	4	P	2.80	1.40
5	P	4.05	1.83	5	P	3.70	4.10
6	P	4.42	16.48	6	P	6.70	1.70
7	A	5.20	3.00	7	P	2.60	24.20
8	P	2.46	16.63	8	P	3.30	7.60
9	P	2.57	34.12	9	A	1.40	6.10
10	P	6.99	70.16	10	P	3.11	35.30
11	P	4.75	88.25	11	P	2.00	2.10
12	P	1.62	17.24	12	P	2.28	14.54
13	A	2.10	3.90	13	P	5.70	2.00
14	P	1.46	2.82	14	P	1.82	7.49
15	A	0.00	1.53	15	P	2.78	7.46
16	A	1.44	2.83	16	P	4.24	1.39
17	A	1.38	9.98	17	P	4.20	2.59
18	P	7.13	2.88	18	P	1.64	1.16
19	P	2.19	3.37	19	A	2.00	4.20
20	P	1.66	12.36	20	P	3.69	41.26
21	P	2.60	41.59	21	P	2.23	86.02
22	A	4.10	1.70	22	A	2.04	2.71
23	P	1.40	2.00	23	P	3.13	24.94
24	P	1.40	31.00	24	P	3.64	13.72
25	P	4.10	2.50	25	P	2.06	22.42
26	P	7.10	1.10	26	P	2.48	4.21
27	A	5.38	3.10	27	P	2.15	13.65
28	P	2.00	1.40	28	A	6.90	6.60
29	P	1.24	7.29	29	P	1.80	17.44
30	P	1.11	2.40	30	A	1.70	3.08
31	P	5.15	2.73	31	P	2.18	2.84
32	P	5.86	2.76	32	P	1.67	13.85
33	P	5.08	2.29	33	P	2.50	7.50
34	P	2.81	3.41	34	P	2.23	2.26
35	P	0.60	2.00	35	P	1.53	30.76
36	P	0.66	0.79	36	A	2.65	1.95
37	P	5.72	1.20	37	P	4.79	1.25
38	P	3.73	1.75	38	P	10.90	16.00
39	P	0.56	77.46	39	P	5.39	25.00
40	P	0.69	79.46	40	P	3.70	2.80
41	P	5.12	8.31	41	P	1.51	1.60
42	P	4.85	20.34	42	A	1.76	0.00
43	P	6.62	6.98	43	A	5.10	2.60
44	P	30.41	11.37	44	P	5.97	31.52
45	P	20.77	15.73	45	P	4.16	22.18
46	P	8.75	11.15	46	P	2.70	5.40
47	P	12.34	6.88	47	P	14.42	42.10
48	P	5.77	10.20	48	P	2.78	19.44
49	P	2.01	41.53	49	P	7.34	31.77
50	P	4.32	7.35	50	P	4.15	29.55
51	P	2.43	7.37	51	P	1.80	8.27
52	A	11.02	11.34	52	P	4.15	11.43
53	A	1.96	3.35	53	P	3.65	12.73
54	P	4.16	9.51	54	P	2.92	20.17
55	P	4.89	4.65	55	P	9.37	43.27
56	P	1.73	7.91	56	-	3.10	11.81
57	P	2.61	28.23	57	P	6.28	21.28
58	P	1.37	4.00	58	P	18.84	11.54
59	P	2.62	0.00	59	P	10.49	24.23
60	P	1.61	5.13	60	P	9.73	38.18
61	P	2.52	10.54	61	P	11.52	30.42
62	P	2.08	9.18	62	P	14.41	16.08
63	P	2.1.	49.66	63	P	28.21	1.78
64	P	2.19	44.17	64	P	1.52	3.52
65	P	2.47	3.71	65	P	1.97	2.16
66	P	4.41	27.85	66	-	8.19	9.43

Presence: P

Absence: A

Table 4

Serum viral load (cps/mL) in SLE patients (n = 28) and controls (n = 30) with IgM or IgG, analyzed by qPCR and ELISA, respectively, as described in Material and methods.

Viral load/antibodies	SLE patients (%)	Healthy controls (%)
cps/mL (+) IgM (+)	3/28 (10.7)	4/30 (13.3)
cps/mL (+) IgG (+)	16/28 (57.1)	20/30 (66.7)
cps/mL (-) IgM (+)	1/28 (3.6)	--
cps/mL (-) IgG (+)	7/28 (25.0)	5/30 (16.7)
cps/mL (-) IgM/IgG (+)	1/28 (3.6)	1/30 (3.3)

Table S2

Serum viral load (cps/mL) in SLE patients and controls with IgM or IgG, analyzed by qPCR and ELISA, respectively, as described in Material and methods.

SLE Patients	cps/mL	IgM (DU)	IgG (DU)	Healthy controls	cps/mL	IgM (DU)	IgG (DU)
1	4201.636791	25	3.74	1	159046.3715	28	1.76
2	4117.944717	19	1.60	2	68096.33636	26	2.42
3	0	383	90.75	3	0	311	3.53
4	9168.199539	595	5.60	4	122609.1675	228	14.54
5	0	405	1.83	5	5914.156437	42	2.59
6	0	442	16.48	6	67065.8493	223	86.02
7	26209.05876	246	16.63	7	16777.81105	313	24.94
8	0	257	34.12	8	94853.63007	364	13.72
9	8431.143761	699	70.16	9	39084.53369	206	22.42
10	2591.694593	475	88.25	10	126880.3711	215	13.65
11	4574.241638	162	17.24	11	47948.55881	167	13.85
12	0	146	2.82	12	68316.29181	153	30.76
13	5838.443756	166	12.36	13	0	479	1.25
14	449.7214556	26	41.59	14	32992.91611	109	1.60
15	7472.707748	14	3.10	15	18782.56798	539	2.50
16	20002.53105	124	7.29	16	0	597	31.52
17	0	056	77.46	17	17914.39438	416	22.18
18	2919.049501	069	79.46	18	18311.41281	278	19.44
19	0	485	20.34	19	36226.25351	734	31.77
20	24352.15759	3041	11.37	20	48950.22202	415	29.55
21	0	2077	15.73	21	0	365	12.73
22	3175.864458	1234	6.88	22	0	937	43.27
23	6933.708191	201	41.53	23	22605.70526	628	21.28
24	4482.713699	261	28.23	24	33647.85004	1884	11.54
25	4170.306683	21	49.66	25	33567.1196	1049	24.23
26	5064.297199	219	44.17	26	25119.77386	973	38.18
27	3566.889524	247	3.71	27	0	1152	30.42
28	0	441	27.85	28	55128.37601	2821	1.78
				29	40356.28128	152	3.52
				30	64150.62714	197	2.16

Figure 4

Viral load in serum of SLE patients (28/66) and controls (31/66) with IgM or IgG, analyzed by qPCR as described in Material and methods. Results expressed in copies/mL are presented in scatter plots and mean with SME (standard mean error). Wilcoxon matched-pairs signed rank test was used to assess the difference of expression among SLE patients and control subject (p <0.05).

Figure 5

Graph representing the number of copies of the standard curve with the CT values of an analyzed sample, as described in Material and methods. The red symbols indicate the points of the standard curve and the blue ones of a sample, taken from the StepOne software.

Discussion

During viral infection the humoral immune response is crucial to limit infection. In immunocompetent individuals, viremia begins 6 days after infection and decreases days later with the presence of antibodies against VP1 and VP2 proteins. In acute infection IgM antibodies are detectable in the first 3 days of the infection and undetectable between 60 and 90 days, but it could remain elevated between 3 and 6 months - . Some authors report that acute PV-B19 infection may trigger its onset or exacerbate preexisting SLE , .

This is the first report on PV-B19 infection in women with stablished SLE of the Mayan population in Mexico. IgM antibodies against VP1 were detected in patients with confirmed SLE who showed disease activity (SLEDAI >5), and had an average of 9.8 years with the disease. Although IgM levels in the patients were not different from the controls, and showed no correlation with the disease activity, probably due to the duration of the disease and the treatment, data suggest recent infection in our patients and seems to correlate with the reactivation of the disease. This supports that PV-B19 infection is associated with confirmed SLE as etiopathogenic factor, and it corresponds to what was suggested by Ramos et al .

IgG is detected days after IgM, indicating resolution of infection and past or chronic infection, providing lifelong immunity , . In our study, high levels of IgG antibodies were detected in SLE patients, supporting past or chronic infection. Unlike the data reported by Pugliese et al. , who found a significant correlation between IgG anti-PV-B19 and SLE, we found no correlation between IgG and SLEDAI; the inverse correlation observed between IgG with low disease activity (SLEDAI <4), is probably due to high IgG values in a single patient, which we consider not representative. Our data suggest that IgG levels appear to increase in SLE patients likely due to support therapy for chronic PV-B19 infection, since all of our patients were being treated with anti-inflammatory drugs, corticosteroids and immunosuppressive agents. In this regard, it has been described that the use of corticosteroids, immunosuppressive agents, and biological therapies may increase the risk of viral infection in SLE patients and PV-B19 infection could become chronic or severe on them , . However, longitudinal studies are required to confirm this.

PV-B19 genotype 1 was detected in SLE patients and controls, and viral load was quantified in those patients and controls with high levels of IgM or IgG antibodies. We found no correlation between IgM or IgG antibodies and viral load in both groups; however, higher viral load was found in controls confirming presence of PV-B19 in the region, and supporting the prevalence of infection in the Mayan population. IgG antibodies and viral load in patients seem to support the chronic infection associated with immunosuppression by therapy. Viral load was no detected in some patients with IgM, IgG or both. In this regard, it has been reported that viremia disappears at day 10 post infection, whereas IgM (10-12 days) and IgG (14 days) start to synthesize. In this stage, viral particles are not detected, indicating that the reason for not detecting viral DNA in some of our patients and controls with high titer of IgG and/or IgM, could be that those individuals were in day 12 of infection, when virus is not present. However, longitudinal studies are required to confirm this.

In our control women, no clinical symptoms suggestive recent infection or illness were observed, but IgM and IgG antibodies, as well as presence of DNA and viral load were detected. Despite the differences in sample size and populations studied, the data support the IgM and IgG seroprevalence found by Vera et al. , and confirm the circulation of the virus in the Mayan population. Viral load was no detected in some controls with IgG or IgM/IgG antibodies. In this regard, it has been reported that immunocompetent individuals produce antibodies that effectively eliminate viremia within a few days of infection, and the infection is often not developed, is asymptomatic or has mild clinical manifestations (like the common cold) , which seems to agree with what we found in our controls. On the other hand, there have also been rare cases of chronic PV-B19 infection in healthy individuals, with involvement of the central nervous system, causing nonspecific symptoms such as fatigue, fever, arthralgia and myalgia, which may hinder the diagnostic . None of our controls women manifest some of these symptoms, however, longitudinal studies are needed to evaluate the association of PV-B19 infection with neurological, autoimmune or hematological disorders in the immunocompetent Mayan population.

Conclusion

The high prevalence of PV-B19 in Yucatan, and the presence of IgM, IgG, and viral load in Mayan women with established SLE suggest that PV-B19 infection could be an environmental factor to trigger or reactivate SLE. However, longitudinal studies and a large sample are required to confirm the association of PV-B19 with the development of SLE, as well as the effect of immunosuppressive therapy on the resurgence of the virus.

Introducción

El lupus eritematoso sistémico (LES) es una enfermedad autoinmune inflamatoria sistémica crónica de etiología desconocida, causada por la interacción de factores genéticos y ambientales que contribuyen a la producción de autoanticuerpos frente a los auto-antígenos. La enfermedad tiene una distribución mundial y afecta principalmente a las mujeres -. Países asiáticos como China, Hong Kong, Filipinas y Japón han reportado más casos, y otros como Estados Unidos, Francia, España, Reino Unido y algunas regiones de Australia, han presentado un aumento en los pacientes ,. Varios estudios se han realizado en pacientes de diferentes poblaciones (asiática, europea, americana), pero pocos en la población mexicana.

México tiene una población mestiza mezclada con una carga genética de amerindios y españoles . Los datos de ancestría derivados del proyecto HapMap, que incluyó a los mexicanos, muestra que los mestizos de Yucatán son el único grupo étnico con ascendencia amerindia que está geográficamente distante de otros grupos amerindios . Por otro lado, los individuos mexicanos con LES parecen tener una enfermedad más severa que la europea, una menor edad de inicio y una mayor frecuencia de brotes de actividad de la enfermedad. También se ha reportado que la prevalencia de LES en Yucatán (0.7%) es ligeramente superior a la prevalencia nacional (0,6%) ,.

Factores ambientales como infecciones bacterianas, parasitarias, fúngicas y virales se han asociado con la patogénesis de la enfermedad en pacientes genéticamente predispuestos ,. Se ha reportado que varios virus y bacterias pueden producir superantígenos que, a través de mecanismos tales como el efecto adyuvante (bystander) y el mimetismo molecular, inducen la activación de linfocitos T y B autoreactivos. Las partículas virales en los linfocitos B infectados pueden conducir a la producción de autoanticuerpos y citoquinas como el IFN-α, contribuyendo al mecanismo autoinmune e inflamatorio. El virus de Epstein-Barr (EBV), el citomegalovirus (CMV), el virus T-linfotrópico humano 1 (HTLV-1) y el parvovirus B19 (PV-B19) se han relacionado con la patogénesis del LES ,.

El PV-B19 humano, identificado en 1975 por Yvonne Cossart y sus colaboradores , es un virus pequeño de ADN de una sola hebra (22-24 nm de diámetro) que causa una variedad de enfermedades en los seres humanos. Su cápside icosaédrica se compone de dos proteínas estructurales idénticas, VP1 (83 kDa) y VP2 (58 kDa), excepto por un fragmento adicional de 277 aminoácidos en el amino terminal de VP1. Esta única región VP1 es externa a la cápside, con muchos epítopos lineales y actividad de fosfolipasa A2 (PLA2), lo que causa citotoxicidad e infectividad. PV-B19 también tiene la proteína no estructural NS1 (77kDa) involucrada en su transcripción y traducción . Se han identificado tres variantes genotípicas de PV-B19: el genotipo 1 tiene una distribución mundial; el genotipo 2 se ha detectado en pacientes de varios países europeos, Estados Unidos y Brasil; el genotipo 3 es más frecuente en África y menos frecuente en otras áreas geográficas -.

PV-B19 se transmite por vía aérea (secreciones respiratorias) de individuos infectados, o por la transmisión parenteral a través de transfusiones de sangre y productos sanguíneos -. El virus se replica en los eritroblastos de la médula ósea, que expresan el grupo sanguíneo antígeno P o globoside (Gb4), la integrina alfa5beta1 y la proteína Ku80 . La replicación viral, que conduce a la viremia al día 6, parece ser importante en la mayoría de las manifestaciones clínicas. La mayoría de las infecciones son asintomáticas o tienen cuadros clínicos leves, pero cuando la infección se asocia con trastornos clínicos influenciados por la edad o estado inmunológico y hematológico, presenta una amplia variedad de manifestaciones clínicas que pueden confundirse con enfermedades autoinmunes sistémicas como la artritis reumatoide (AR), esclerosis sistémica progresiva, síndrome de Sjögren (SS), vasculitis o SLE -. La infección por PV-B19 puede diagnosticarse erróneamente como LES dé aparición reciente, pero al mismo tiempo, ambas pueden ocurrir simultáneamente en algunos pacientes.

PV-B19 es un virus ubicuo, distribuido en todo el mundo, que puede infectar a cualquier grupo de edad. La infección primaria ocurre generalmente en la niñez y adolescencia. La seroprevalencia (presencia de IgG específica que denota la infección pasada) aumenta con la edad. En los países industrializados, se calcula entre el 2% y el 10% de los niños menores de 5 años que pueden aumentar hasta el 50% a la edad de 15 años, y en los adultos varía entre el 40% y el 70%. A la edad de 70, llega a ser de 80% a 100% ,. Japón y Alemania han reportado altas tasas de infección en mujeres embarazadas ,.

En México, existen pocos estudios clínicos y epidemiológicos de PV-B19. Tapia et al., determinaron IgM e IgG en 128 personas de grupos considerados de alto riesgo de infección por PV-B19, y personas sanas de todas las edades y ambos sexos, en el Hospital de Enfermedades Infecciosas del Centro Médico La Raza. Los resultados mostraron la presencia de infección especialmente en mujeres (63.2%) de 25-44 años (48.4%), con exantemas, aborto habitual y anemia en pacientes inmunocomprometidos o trastornos hematológicos. En 61 pacientes (47.6%), se encontraron anticuerpos IgG elevados, y sólo 4 de ellos tenían IgM3 4. Vera et al. , realizaron un estudio prospectivo preliminar en 102 mujeres embarazadas en dos ciudades rurales de Yucatán, México, encontrando una seroprevalencia de 5.9% de IgM y 11.8% de IgG; confirmando la presencia de infección por PV-B19 en estas poblaciones.

Diversos estudios se han centrado en el diagnóstico de la infección por PV-B19, pero la relación de PV-B19 con LES establecido no se ha estudiado en la población maya de México. Nuestro objetivo fue realizar un análisis serológico y molecular preliminar de la infección por PV-B19 en mujeres de la población maya con LES establecido y mujeres sanas. IgM e IgG anti-PVB19, presencia de ADN viral y carga viral se evaluaron en ambos grupos.

Materiales y Métodos

Pacientes con LES

Sesenta y seis mujeres con LES de origen maya fueron reclutadas del área de consulta eterna de Reumatología del Hospital Regional Agustín O'Horán e ISSSTE, Yucatán. El diagnóstico se estableció según los criterios del Colegio Americano de Reumatología (ACR) , y la actividad de la enfermedad fue evaluada por el puntaje de SLEDAI . Las mujeres con LES reportaron tener diferentes tiempos con la enfermedad. Se estudiaron 66 mujeres sanas del mismo origen sin antecedentes de enfermedades autoinmunes o infecciosas, como controles, y ninguna de ellas estaba recibiendo algún tratamiento. Todas las mujeres incluidas dieron su consentimiento informado, según la Declaración de Helsinki. El estudio fue aprobado por el Comité de Ética en Investigación del Hospital Agustin O'Horán de Yucatán (CIE-008-1-11). Todas las mujeres dieron 10 mL de sangre venosa periférica (sin anticoagulante) en una toma para obtener suero.

IgM e IgG anti-PV-B19

Se utilizaron dos kits ELISA comercialmente disponibles para la detección de IgM anti-B19 (EIA-3504) y IgG anti-B19 (EIA-3503) (DRG Instruments GmbH, Alemania) . Los pocillos de la placa de microtitulación, como fase sólida, se recubrieron con el antígeno recombinante de PV-B19 (proteína VP1). El suero diluido de pacientes y controles, y los controles del kit listos para usar, se pipetean en estos pocillos. Durante la incubación los anticuerpos específicos de PV-B19 del suero positivo y los controles se unen al antígeno inmovilizado. Posteriormente, se añade la anti-IgG humana o anti-IgM conjugada a peroxidasa de rábano picante (HRP). La reacción se visualiza añadiendo tetrametilbenzidina (TMB) que genera un color azul. La reacción enzimática se detiene mediante la adición de una solución de ácido sulfúrico (H2SO4), que desarrolla un color amarillo. La intensidad del color es proporcional a la concentración de anticuerpos. La lectura se realizó a una longitud de onda de 450 nm en un lector de ELISA (modelo BioTek(r) ELx800), y la concentración de anticuerpos se determinó mediante la siguiente fórmula:

Dónde:

Abs = absorbancia de la muestra

10 = constante para comparar las absorbancias (control de corte y muestras control)

CO = absorbancia media del control de corte

La concentración de anticuerpos se expresa en DU (unidades DRG, medida exclusiva del proveedor utilizada para medir parámetros de inmunoglobulinas), tomando como referencia la absorbancia del control de corte. Cada ensayo se realizó por duplicado usando los controles positivos, negativos y de corte, contenidos en el kit. Los resultados fueron interpretados como sigue: IgM positivo ≥11 DU, IgG positivo ≥12 DU, IgM negativo ≤ 9 DU, e IgG negativo ≤ 8,5 DU, respectivamente.

Aislamiento del ADN

La extracción de ADN se realizó en sueros positivos para IgM e IgG de pacientes y controles mediante el método de fenol saturado . Este procedimiento se basa en el método clásico de extracción de fenol / cloroformo usando 200 µL de muestras de suero. Se añadió solución de cloroformo-alcohol isoamílico (24:1) para separar proteínas, y el ADN se precipitó con etanol al 100% y acetato de amonio 7.5 M durante 24 h a -20º C. El ADN precipitado se lavó dos veces con etanol al 70%, se secó en el horno a 37° C durante 1 hora y después se resuspendió en 30 μL de agua ultrapura. Después de la incubación de 20 minutos a 56° C, el ADN se cuantificó en un espectrofotómetro (Nanodrop (tm) Thermo Scientific(r) 2000c), a longitudes de onda de 260 y 280 nm. El ADN se almacenó a -20º C hasta su uso.

Clonación

Para determinar la presencia de ADN viral y cuantificar la carga viral, se clonó un segmento de la proteína NS1 a partir del ADN viral extraído del suero de un paciente diagnosticado con PV-B19 y se usó como control positivo. La banda de 168 pb correspondiente a la proteína NS1 se amplificó usando la Taq ADN polimerasa Maxima Hot Start (Thermo Scientific) y los cebadores (0.5 μM) como sigue: una desnaturalización inicial de 4 min a 95º C, seguida de 40 ciclos de desnaturalización (95º C durante 30 s), alineación del cebador (55º C, 30 s), etapa de extensión de 1 minuto a 72º C y una etapa final de in cubación a 72º C durante 10 min. Los productos de PCR se identificaron por electroforesis en agarosa al 1% teñida con GelRed (GelRedTM Nucleic Acid Gel Stain, Biotium). La banda se purificó mediante centrifugación (kit Wizard SV Gel y PCR Clean-up System, Promega), y se ligó al vector de clonación pCR 2.1-TOPO (kit de clonación TOPO-TA, Invitrogen por Life Technologies). El producto de ligación se introdujo en células de E. coli químicamente competentes (One Shot(r) TOP10 Competent Cells, Invitrogen por Life Technologies) a 42° C / 30 s, y se sembraron en medio sólido LB con kanamicina (50 μg / mL) durante la noche a 37° C. Se seleccionaron colonias blancas que expresaron el plásmido y se sembraron en el medio LB líquido durante la noche a 37° C. El plásmido se purificó (kit PureLink Quick Plasmid DNA Miniprep, Invitrogen por Life Technologies) y se visualizó mediante electroforesis en agarosa al 1% GelRed. La presencia del inserto se determinó mediante PCR usando la Taq ADN polimerasa Maxima Hot Start (Thermo Scientific). Los plásmidos purificados se analizaron mediante BLAST y se compararon con las secuencias reportadas del gen NS1 de PV-B19 en el GenBank.

Detección del ADN de PV-B19

El ADN viral (15 ng) se amplificó mediante PCR en tiempo real, diseñado de acuerdo con la guía del MIQE . Los cebadores y sondas usados ​​en las reacciones de amplificación fueron descritos por Bonvicini et al. , (B19 cebador delantero 5'-CGCCTGGAACASTGAAACCC-3 ', B19 cebador inverso 5'-TCAACCCCWACTAACAGTTC-3', y sonda del genotipo 1 6FAMGTTGTAGCTGCATCGTGGGAAGAMGBNFQ). Se diseñaron por Applied Biosystems y se dirigieron contra la proteína no estructural 1 (NS1, 616-2631 nucleótidos) del genotipo 1 de PV-B19. Las condiciones de amplificación fueron las siguientes: 20 segundos de desnaturalización inicial a 95º C, seguido de 50 ciclos de amplificación: desnaturalización (95° C durante 3 s), alineación del cebador (55° C, 40 s), y una incubación final de 30 s a 60º C. La amplificación se llevó a cabo en el equipo de PCR en tiempo real StepOne (tm) utilizando TaqMan Fast Virus 1 step Master Mix (Applied Biosystems). El análisis del ADN viral (presencia / ausencia de NS1 y genotipo 1) se realizó de acuerdo con el CT (umbral de ciclo). El CT es el ciclo en el que el nivel de fluorescencia alcanza una cierta cantidad (el umbral). Este método utiliza directamente la información generada de CT para calcular la expresión relativa en las muestras blanco y de referencia, utilizando como referencia una muestra negativa .

Carga viral

Las muestras positivas de IgM e IgG se cuantificaron mediante PCR en tiempo real utilizando los mismos cebadores y sonda, descritos anteriormente. La carga viral se cuantificó empleando un ensayo de curva estándar con diferentes números de copias del plásmido conteniendo el fragmento de 168 pb del gen NS1 (4,099 pb). El número de copias de la curva estándar de 6 puntos se determinó usando el software URI Genomics & Sequencing Center (http://cels.uri.edu/gsc/cndna.html). Este cálculo se basó en el supuesto de que el peso promedio de un par de bases (pb) es de 650 Daltons. Esto significa que un mol de un pb pesa 650 g y que el peso molecular de cualquier templete de ADN de doble hebra puede estimarse tomando el producto de su longitud (en pb) y 650. El inverso del peso molecular es el número de moles del templete presente en un gramo de material. Utilizando el número de Avogadro, 6.022x1023 moléculas / mol, se calcula el número de moléculas del templete por gramo. El número de copias del templete se estimó multiplicando por 1x109 para convertir a ng y luego multiplicando por la cantidad de templete (en ng). La fórmula utilizada, a partir de una concentración inicial de 1ng, fue:

(1 ng x 6.022 x 1023) / (4,099 x 1 x 109 x 650) = 2.25 x 108 copias. Se incluyeron cinco diluciones seriadas a la 10 (Tabla 1). Cada muestra y curva estándar se realizaron por triplicado. Las condiciones de amplificación fueron las siguientes: 2 min de precalentamiento a 50º C, 10 min de activación de polimerasa a 95º C, 50 ciclos de desnaturalización (95º C durante 15 s), alineación del cebador (55º C, 40 s), etapa de extensión 20 s a 72º C, y una etapa final de incubación a 60º C durante 30 s. La reacción de amplificación se realizó en el equipo de PCR en tiempo real StepOne (tm) (Applied Biosystems), utilizando la mezcla de reacción Maxima Probe / ROX (Thermo Scientific), primers (0.5 μM) y sonda (0.1 μM). El número de copias en las muestras se calculó con el software StepOne teniendo en cuenta el promedio de los valores de TC obtenidos con respecto a la curva estándar. La carga viral se expresa en copias por mililitro de suero (cps/mL).

Tabla 1

Número de copias de la curva estándar, determinada por triplicado con el software URI Genomics & Sequencing Center, como se describe en Material y métodos.

Curva estándar (ng)	Número de copias
1	2.25 x 108
0.1	2.25 x 107
0.01	2.25 x 106
0.001	2.25 x 105
0.0001	2.25 x 104
0.00001	2.25 x 103

Análisis estadístico

Para evaluar la significancia de cualquier diferencia en los valores de IgM e IgG, y la carga viral (cps/mL) entre los pacientes con LES y sujetos control (p <0.05), se utilizó la prueba de rangos pareada de Wilcoxon. El análisis de correlación se realizó utilizando el coeficiente de correlación de Pearson. En todas las comparaciones, el nivel de significancia fue p <0.05, utilizando el programa Graph Pad Prism 5.

Resultados

Características de los pacientes con LES y de los controles

La edad promedio de los pacientes y controles fue de 39.03 y 38.18 años, respectivamente. El tiempo promedio con la enfermedad en pacientes fue de 9 años (Tabla 2). Todas estaban bajo tratamiento, 56.1% de ellas tenían enfermedad activa determinada por SLEDAI (>4).

Tabla 2

Características de los pacientes con LES (n = 66).

Características	Pacientes con LES
Edad promedio (años)	39.0
Promedio de duración con la enfermedad (años)	9.9
SLEDAI	%
Activos (≥ 4)	56.1
Inactivos (< 4)	43.9
Localidades en el Estado de Yucatán	%
Mérida	53.0
Hunucmá	3.0
Maxcanú	3.0
Motul	3.0
Peto	4.6
Progreso	3.0
Other in Yucatan State	30.3
Tratamiento	%
Prednisona	54.5*
Azathioprina	39.4*
Metotrexate	13.6*
Deflazacort	18.2*
Hydroxycloroquina	19.7*

SLEDAI: Índice de actividad de la enfermedad del lupus eritematoso sistémico.

* Porcentaje de pacientes que recibieron el fármaco en combinación con otro

Niveles de IgM e IgG anti PV-B19

Se detectaron anticuerpos en el 42.4% (28/66) de los pacientes con LES y en el 53.0% (35/66) de los controles. Encontramos 14.3% (4/28) de los pacientes y 11.4% (4/35) de los controles sin niveles significativos de IgM (p= 0.7922). Por otro lado, 82.1% (23/28) de los pacientes y 82.9% (29/35) de los controles mostraron IgG, pero se detectaron niveles significativamente más altos en los pacientes (p= 0.0353) (Tabla 3 y Fig. 1). Sólo un paciente y dos controles mostraron IgG e IgM. Se encontró que el 58.3% (14/24) de los pacientes con una duración de enfermedad de 4 años o más presentó IgG, pero no se observó correlación. La correlación tampoco se observó en aquellos que presentaron menos de 4 años (41.7%, 10/24) (Fig. 2). Se realizó un análisis de asociación de IgG e IgM con el SLEDAI, pero no se observó correlación entre los niveles de IgM y la actividad de la enfermedad (SLEDAI >4). Sin embargo, los niveles de IgG mostraron correlación negativa significativa en pacientes con menor actividad de la enfermedad (SLEDAI <4) (Fig. 3).

Tabla 3

IgM e IgG anti-PV-B19 en pacientes con LES (n = 66) y controles (n = 66), analizados por ELISA como se describe en Material y métodos.

Anticuerpo	Pacientes con LES (%)	Controles (%)
IgM > 11 DU	4 (14.3)	4 (11.4)
IgG > 12 DU	23 (82.1)	29 (82.9)
IgG and IgM	1 (3.6)	2 (5.7)
Total	28 (42.4)	35 (53.0)

Figura 1

Niveles de IgM e IgG anti-PV-B19 en pacientes con LES (n= 28) y controles (n= 30), analizados por ELISA como se describe en Material y métodos. Los resultados expresados ​​en unidades DU se presentan en graficas de puntos con la media y SME (media del error estándar). Prueba de rangos pareada de Wilcoxon se utilizó para evaluar la diferencia de expresión entre los pacientes con LES y sujetos control (p <0.05).

Figura 2

Análisis de correlación de IgG anti-PV-B19 con el tiempo de evolución (≥4, o ≤4 años) en pacientes con LES. Los resultados se presentan en graficas de puntos. Se utilizó la prueba de correlación de Pearson para evaluar la correlación. r = coeficiente de correlación de Pearson; p < 0.05.

Figura 3

Análisis de correlación de IgM e IgG anti-PV-B19 con actividad de la enfermedad (SLEDAI >4 o <4) en pacientes con LES. Los resultados se presentan en graficas de puntos. Se utilizó la prueba de correlación de Pearson para evaluar la correlación. r= coeficiente de correlación de Pearson; p < 0.05.

Detección de ADN PV-B19 y carga viral

El fragmento secuenciado de la proteína NS1, utilizado como control positivo, se analizó mediante BLAST y mostró 100% de homología con secuencias reportadas del gen NS1 de PV-B19 en el GenBank - (Figura S1). La secuencia se registró en el GenBank (BankIt1994458 Human KY680313). El ADN de PV-B19 del genotipo 1 se detectó en 86.4% (57/66) y 81.8% (54/66) de los pacientes y controles, respectivamente (Tabla S1). La carga viral se cuantificó en 28/66 pacientes con LES y 30/66 controles sanos, que fueron positivos para IgM e IgG (Tabla S2). Se encontró que el 67.9% (19/28) de los pacientes presentó carga viral: 10.7% (3/28) con IgM y 57.1% (16/28) con IgG. También se encontró carga viral en el 80,0% (24/30) de los controles: 13.3% (4/30) con IgM y 66.7% (20/30) con IgG, respectivamente (Tabla 4). La carga viral no se detectó en pacientes con IgM (1/28), IgG (7/28), o ambos (1/28), ni en controles con IgG (5/30), o IgM e IgG (1/30) (Tabla S2). No se encontró correlación de IgM o IgG con carga viral en ambos grupos; sin embargo, la carga viral fue significativamente mayor en los controles con IgG (Fig. 4). Se muestra un gráfico que representa el número de copias de la curva estándar con los valores de CT de una muestra (Fig. 5).

Figura S1

Alineamiento del fragment de la secuencia de la proteína NS1 de PV-B19 con la secuencia reportada en el GenBank.

Tabla S1

Presencia/ausencia de DNA viral e IgM o IgG en patientes SLE (n= 66) y controles (n= 66), analizados por PCR y ELISA, respectivamente, como se describio en Materiales y metodos.

Pacientes con LES	Presencia Ausencia	IgM (DU)	IgG (DU)	Sujetos sanos	Presencia Ausencia	IgM (DU)	IgG (DU)
1	P	2.50	3.74	1	A	2.40	2.20
2	P	1.90	1.60	2	P	2.80	1.76
3	P	3.83	90.75	3	A	2.00	4.80
4	P	5.95	5.60	4	P	2.80	1.40
5	P	4.05	1.83	5	P	3.70	4.10
6	P	4.42	16.48	6	P	6.70	1.70
7	A	5.20	3.00	7	P	2.60	2.42
8	P	2.46	16.63	8	P	3.30	7.60
9	P	2.57	34.12	9	A	1.40	6.10
10	P	6.99	70.16	10	P	3.11	3.53
11	P	4.75	88.25	11	P	2.00	2.10
12	P	1.62	17.24	12	P	2.28	14.54
13	A	2.10	3.90	13	P	5.70	2.00
14	P	1.46	2.82	14	P	1.82	7.49
15	A	0.00	1.53	15	P	2.78	7.46
16	A	1.44	2.83	16	P	4.24	1.39
17	A	1.38	9.98	17	P	4.20	2.59
18	P	7.13	2.88	18	P	1.64	1.16
19	P	2.19	3.37	19	A	2.00	4.20
20	P	1.66	12.36	20	P	3.69	41.26
21	P	2.60	41.59	21	P	2.23	86.02
22	A	4.10	1.70	22	A	2.04	2.71
23	P	1.40	2.00	23	P	3.13	24.94
24	P	1.40	3.10	24	P	3.64	13.72
25	P	4.10	2.50	25	P	2.06	22.42
26	P	7.10	1.10	26	P	2.48	4.21
27	A	5.38	3.10	27	P	2.15	13.65
28	P	2.00	1.40	28	A	6.90	6.60
29	P	1.24	7.29	29	P	1.80	17.44
30	P	1.11	2.40	30	A	1.70	3.08
31	P	5.15	2.73	31	P	2.18	2.84
32	P	5.86	2.76	32	P	1.67	13.85
33	P	5.08	2.29	33	P	2.50	7.50
34	P	2.81	3.41	34	P	2.23	2.26
35	P	0.60	2.00	35	P	1.53	30.76
36	P	0.66	0.79	36	A	2.65	1.95
37	P	5.72	1.20	37	P	4.79	1.25
38	P	3.73	1.75	38	P	1.09	1.60
39	P	0.56	77.46	39	P	5.39	2.50
40	P	0.69	79.46	40	P	3.70	2.80
41	P	5.12	8.31	41	P	1.51	1.60
42	P	4.85	20.34	42	A	1.76	0.00
43	P	6.62	6.98	43	A	5.10	2.60
44	P	30.41	11.37	44	P	5.97	31.52
45	P	20.77	15.73	45	P	4.16	22.18
46	P	8.75	11.15	46	P	2.70	5.40
47	P	12.34	6.88	47	P	14.42	4.21
48	P	5.77	1.02	48	P	2.78	19.44
49	P	2.01	41.53	49	P	7.34	31.77
50	P	4.32	7.35	50	P	4.15	29.55
51	P	2.43	7.37	51	P	1.80	8.27
52	A	11.02	11.34	52	P	4.15	11.43
53	A	1.96	3.35	53	P	3.65	12.73
54	P	4.16	9.51	54	P	2.92	20.17
55	P	4.89	4.65	55	P	9.37	43.27
56	P	1.73	7.91	56	-	3.10	11.81
57	P	2.61	28.23	57	P	6.28	21.28
58	P	1.37	4.00	58	P	18.84	11.54
59	P	2.62	0.00	59	P	10.49	24.23
60	P	1.61	5.13	60	P	9.73	38.18
61	P	2.52	10.54	61	P	11.52	30.42
62	P	2.08	9.18	62	P	14.41	16.08
63	P	2.1.	49.66	63	P	28.21	1.78
64	P	2.19	44.17	64	P	1.52	3.52
65	P	2.47	3.71	65	P	1.97	2.16
66	P	4.41	27.85	66	-	8.19	9.43

Presencia: P

Ausencia: A

Tabla S2

Carga viral en suero (cps/mL) en patientes SLE y controles con IgM o IgG, analizados por qPCR y ELISA, respectivamente, como se describio en Materiales y métodos.

Pacientes con LES	cps/mL	IgM (DU)	IgG (DU)	Sujetos sanos	cps/mL	IgM (DU)	IgG (DU)
1	4201.636791	25	3.74	1	159046.3715	28	1.76
2	4117.944717	19	1.60	2	68096.33636	26	2.42
3	0	383	90.75	3	0	311	3.53
4	9168.199539	595	5.60	4	122609.1675	228	14.54
5	0	405	1.83	5	5914.156437	42	2.59
6	0	442	16.48	6	67065.8493	223	86.02
7	26209.05876	246	16.63	7	16777.81105	313	24.94
8	0	257	34.12	8	94853.63007	364	13.72
9	8431.143761	699	70.16	9	39084.53369	206	22.42
10	2591.694593	475	88.25	10	126880.3711	215	13.65
11	4574.241638	162	17.24	11	47948.55881	167	13.85
12	0	146	2.82	12	68316.29181	153	30.76
13	5838.443756	166	12.36	13	0	479	1.25
14	449.7214556	26	41.59	14	32992.91611	109	1.60
15	7472.707748	14	3.10	15	18782.56798	539	2.50
16	20002.53105	124	7.29	16	0	597	31.52
17	0	056	77.46	17	17914.39438	416	22.18
18	2919.049501	069	79.46	18	18311.41281	278	19.44
19	0	485	20.34	19	36226.25351	734	31.77
20	24352.15759	3041	11.37	20	48950.22202	415	29.55
21	0	2077	15.73	21	0	365	12.73
22	3175.864458	1234	6.88	22	0	937	43.27
23	6933.708191	201	41.53	23	22605.70526	628	21.28
24	4482.713699	261	28.23	24	33647.85004	1884	11.54
25	4170.306683	21	49.66	25	33567.1196	1049	24.23
26	5064.297199	219	44.17	26	25119.77386	973	38.18
27	3566.889524	247	3.71	27	0	1152	30.42
28	0	441	27.85	28	55128.37601	2821	1.78
				29	40356.28128	152	3.52
				30	64150.62714	197	2.16

Tabla 4

Carga viral sérica (cps/mL) en pacientes con LES (n= 28) y controles (n= 30) con IgM o IgG, analizados por qPCR y ELISA, respectivamente, tal como se describe en Material y Métodos.

Carga viral/anticuerpos	Pacientes con SLE(%)	Controles (%)
cps/mL (+) IgM (+)	3/28 (10.7)	4/30 (13.3)
cps/mL (+) IgG (+)	16/28 (57.1)	20/30 (66.7)
cps/mL (-) IgM (+)	1/28 (3.6)	--
cps/mL (-) IgG (+)	7/28 (3)	5/30 (16.7)
cps/mL (-) IgM/IgG (+)	1/28 (3.6)	1/30 (3.3)

Figura 4

Carga viral en suero de pacientes con LES (28/66) y controles (31/66) con IgM o IgG, analizada por qPCR como se describe en Material y métodos. Los resultados expresados ​​en copias / mL se presentan en graficas de puntos con la media y SME (media del error estándar). Prueba de rangos pareada de Wilcoxon se utilizó para evaluar la diferencia de expresión entre los pacientes con LES y sujetos control (p <0.05).

Figura 5

Gráfico que representa el número de copias de la curva estándar con los valores de CT de una muestra analizada, tal como se describe en Material y métodos. Los símbolos rojos indican los puntos de la curva estándar y los azules de una muestra, tomados del software StepOne.

Discusión

Durante la infección viral la respuesta inmune humoral es crucial para limitar la infección. En individuos inmunocompetentes, la viremia comienza 6 días después de la infección y disminuye días más tarde con la presencia de anticuerpos contra las proteínas VP1 y VP2. En la infección aguda, los anticuerpos IgM son detectables en los primeros 3 días de la infección e indetectables entre 60 y 90 días, pero pueden permanecer elevados entre 3 y 6 meses -. Algunos autores reportan que la infección aguda por PV-B19 puede desencadenar su aparición o exacerbar el SLE preexistente ,.

Este es el primer informe sobre la infección por PV-B19 en mujeres con LES establecido de la población maya en México. Anticuerpos IgM contra VP1 se detectaron en pacientes con LES confirmado quienes mostraron actividad de la enfermedad (SLEDAI >5), y tenía un promedio de 9.8 años con la enfermedad. Aunque los niveles de IgM en los pacientes no fueron diferentes de los controles y no mostraron correlación con la actividad de la enfermedad, probablemente debido a la duración de la enfermedad y el tratamiento, los datos sugieren una infección reciente en nuestros pacientes y parece correlacionar con la reactivación de la enfermedad. Esto apoya que la infección por PV-B19 se asocia con el LES establecido como factor etiopatogénico, y correlaciona con lo sugerido por Ramos et al.

La IgG se detecta días después de la IgM, indicando resolución de la infección e infección pasada o crónica, proporcionando inmunidad a lo largo de toda la vida ,. En nuestro estudio, se detectaron altos niveles de anticuerpos IgG en pacientes con LES, apoyando la infección pasada o crónica. A diferencia de los datos reportados por Pugliese et al. , que encontraron una correlación significativa entre IgG anti-PV-B19 y SLE, no encontramos correlación entre IgG y SLEDAI; la correlación inversa observada entre IgG con baja actividad de la enfermedad (SLEDAI <4), se debe probablemente a los altos valores de IgG en un solo paciente, que consideramos no representativo. Nuestros datos sugieren que los niveles de IgG parecen aumentar en los pacientes con LES probablemente debido a la terapia que apoyo la infección crónica de PV-B19, ya que todos nuestros pacientes estaban siendo tratados con antiinflamatorios, corticosteroides y agentes inmunosupresores. A este respecto, se ha descrito que el uso de corticosteroides, agentes inmunosupresores y terapias biológicas puede aumentar el riesgo de infección viral en pacientes con LES y la infección por PV-B19 puede convertirse en crónica o grave en ellos ,. Sin embargo, estudios longitudinales son necesarios para confirmar esto.

Se detectó el genotipo 1 de PV-B19 en pacientes con SLE y controles, y se cuantificó la carga viral en aquellos pacientes y controles con altos niveles de anticuerpos IgM o IgG. No se encontró correlación entre los anticuerpos IgM o IgG y la carga viral en ambos grupos; sin embargo, se encontró una mayor carga viral en los controles confirmando la presencia de PV-B19 en la región, y apoyando la prevalencia de infección en la población maya. Los anticuerpos IgG y la carga viral en pacientes parecen apoyar la infección crónica asociada con la inmunosupresión mediada por la terapia. La carga viral no se detectó en algunos pacientes con IgM, IgG o ambos. En este sentido, se ha informado que la viremia desaparece al día 10 después de la infección, mientras que la IgM (10-12 días) e IgG (14 días) comienzan a sintetizarse. En esta etapa, no se detectan partículas virales, indicando que la razón para no detectar el ADN viral en algunos de nuestros pacientes y controles con alto título de IgG y / o IgM, podría ser que estos estaban en el día 12 de la infección, cuando el virus no está presente. Sin embargo, estudios longitudinales son necesarios para confirmar esto.

En nuestras mujeres control, no se observaron síntomas clínicos sugestivos de infección reciente o enfermedad, pero se detectaron anticuerpos IgM e IgG, así como presencia de ADN y carga viral. A pesar de las diferencias en el tamaño de muestra y las poblaciones estudiadas, los datos apoyan la seroprevalencia de IgM e IgG encontrada por Vera et al. 35, y confirma la circulación del virus en la población maya. La carga viral no se detectó en algunos controles con anticuerpos IgG o IgM / IgG. A este respecto, se ha reportado que los individuos inmunocompetentes producen anticuerpos que eliminan efectivamente la viremia a los pocos días de la infección, y la infección no suele desarrollarse, es asintomática o tiene manifestaciones clínicas leves (como el resfriado común) , lo que parece correlacionar con lo que encontramos en nuestros controles. Por otra parte, también se han registrado casos raros de infección crónica por PV-B19 en individuos sanos, con afectación del sistema nervioso central, causando síntomas inespecíficos como fatiga, fiebre, artralgia y mialgia, lo que puede dificultar el diagnóstico . Ninguna de nuestras mujeres control manifestó algunos de estos síntomas, sin embargo, los estudios longitudinales son necesarios para evaluar la asociación de la infección de PV-B19 con trastornos neurológicos, autoinmunes o hematológicos en la población inmunocompetente maya.

Conclusión

La alta prevalencia de PV-B19 en Yucatán y la presencia de IgM, IgG y carga viral en mujeres mayas con LES establecido sugieren que la infección por PV-B19 podría ser un factor ambiental para desencadenar o reactivar el LES. Sin embargo, estudios longitudinales y una muestra mayor son necesarios para confirmar la asociación de PV-B19 con el desarrollo de LES, así como el efecto de la terapia inmunosupresora sobre el resurgimiento del virus.