Real-time PCR assay for the diagnosis of pleural tuberculosis.

INTRODUCTION: The diagnosis of pleural tuberculosis requires an invasive and time-consuming reference method. Polymerase chain reaction (PCR) is rapid, but validation in pleural tuberculosis is still weak.
OBJECTIVE: To establish the operating characteristics of real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) hybridization probes for the diagnosis of pleural tuberculosis.
METHODS: The validity of the RT-PCR hybridization probes was evaluated compared to a composite reference method by a cross-sectional study at the Hospital Universitario de la Samaritana. 40 adults with lymphocytic pleural effusion were included. Pleural tuberculosis was confirmed (in 9 patients) if the patient had at least one of three tests using the positive reference method: Ziehl-Neelsen or Mycobacterium tuberculosis culture in fluid or pleural tissue, or pleural biopsy with granulomas. Pleural tuberculosis was ruled out (in 31 patients) if all three tests were negative. The operating characteristics of the RT-PCR, using the Mid-P Exact Test, were determined using the OpenEpi 2.3 Software (2009).
RESULTS: The RT-PCR hybridization probes showed a sensitivity of 66.7% (95% CI: 33.2%-90.7%) and a specificity of 93.5% (95% CI: 80.3%-98.9%). The PPV was 75.0% (95% CI: 38.8%-95.6%) and a NPV of 90.6% (95% CI: 76.6%-97.6%). Two false positives were found for the test, one with pleural mesothelioma and the other with chronic pleuritis with mesothelial hyperplasia.
CONCLUSIONS: The RT-PCR hybridization probes had good specificity and acceptable sensitivity, but a negative value cannot rule out pleural tuberculosis.

Introduction

Tuberculosis (TB) has been a major public health disease for decades . The effects may be multisystemic and when it compromises spaces with paucibacillary behavior, it becomes more difficult to diagnose and to initiate appropriate and timely treatment .

Epidemiologically, TB has a worldwide distribution and the mortality rate of 2014 was reduced to about half that of 1990 . However, in 2015, 1.4 million people died of TB worldwide . Global incidence of TB has declined by 1.5% per year since 2000, and 18% total . In 2015 Colombia reported an incidence of 31 cases per 100,000 inhabitants, with a mortality of 2.1 cases per 100,000 inhabitants . Of these, 2,385 cases were extra pulmonary, of which 863 corresponded to pleural tuberculosis (TBP) . TB is, together with HIV, one of the leading causes of death in the world .

The detection of bacillus by culture, staining of histopathological studies or body fluids is essential for the diagnosis of TB, but it is necessary to take into account that less than 5% of the cases of TBP show a positive smear microscopy in the liquid Pleural due to the paucibacillary naturalization of this entity . Identification of the species and its resistance to antibiotics is achieved by culture and/or PCR-based techniques . Mycobacterium tuberculosis is isolated in culture in only 20% to 40% of cases of confirmed tuberculous pleuritis, the diagnostic yield of the culture being low in pleural fluid, but may be increased if a sample of pleural tissue is also cultured , , . Pleural biopsy with evidence of granulomas is positive in 75% of cases , .

Adenosine deaminase (ADA) nonspecific inflammatory marker is an enzyme the activity of which is involved in the differentiation and proliferation of lymphocytes and the activation of macrophages and neutrophils, being indicative of active local inflammatory response . The determination of the ADA2 isoenzyme could increase the precision since it is released from monocytes and is found in a high concentration in pleuritis by TB. It has been suggested that higher levels of ADA in pleural fluid better predict the diagnosis of TB with a sensitivity of 90 to 100% and a specificity of 89 to 100% when using the Guisti method . The specificity to discriminate between pleural effusion due to TB and malignancy was 95%, being low for the differentiation between paraneumonic effusion .

Consequently, a combination of several tests, including cultures and Ziehl-Neelsen (ZN) staining of the fluid or pleural tissue, has been recommended as a reference method for the diagnosis of TBP, and the histopathological study of the pleural tissue , .

The slow growth of M. tuberculosis in culture has led to the search for rapid diagnostic tests and new methods that detect it directly in clinical samples, without the need to wait for the result of such cultures .

Therefore, other diagnostic methods have been used, including the real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) of the qualitative type, which is a molecular biology test, which identifies the DNA of the mycobacteria, using a technique where the amplification and detection processes occur simultaneously in the same closed vial, with no need for any subsequent action, emitting results in less time and with a high specificity (98%), but with a low or variable sensitivity (62%) not being useful to exclude the disease .

The fluorescence detection systems used in RT-PCR can be of two types: intercalators and specific probes labeled with fluorochromes . Intercalating agents are fluorochromes that significantly increase the emission of fluorescence when bound to double-helix DNA. The most used in RT-PCR is SYBR Green I . The main drawback is low specificity, because they bind indistinctly to nonspecifically generated products or primer dimers, which are very common in the polymerase chain reaction (PCR). To improve specificity, optimum reaction conditions and careful selection of primers should be employed to decrease the risk of dimer formation. In addition, it is advisable to initiate the DNA synthesis reaction at high temperatures (hot-start PCR), which significantly reduces the risk of nonspecific amplifications .

Specific hybridization probes are probes labeled with two types of fluorochromes, a donor and an acceptor. The process is based on the transfer of fluorescent energy by resonance (FRET) between the two molecules. The most used are :

1. Hydrolysis probes, also referred to as TaqMan probes

2. Molecular beacons.

3. FRET probes. The system consists of two probes that bind to adjacent sequences of the target DNA. One of the probes carries a donor at the 3' end and the other an acceptor at the 5' end. When the probes are hybridized, the two fluorochromes are close. Upon being energized, the donor transfers its energy to the acceptor which, in turn, emits the fluorescence that the reader of the equipment detects.

In all these systems, the increase of DNA in each cycle corresponds to an increased hybridization of the probes, which leads to an increase in the same proportion of emitted fluorescence. The use of probes guarantees specificity of the detection and it allows the identification of polymorphisms or point mutations, but the cost is higher than SYBR Green and optimization of the reaction conditions is more difficult .

The diagnostic test evaluated in this work is M. tuberculosis Real-TM (RT-PCR kit for M. tuberculosis complex detection) which is a real-time amplification test for the qualitative detection of M. tuberculosis complex in biological materials (the result is obtained in an average of 3.5 days). DNA is extracted from the samples, amplified and detected by fluorescent probes specific for M. tuberculosis and M. tuberculosis (internal control). M. tuberculosis (internal control) is an IS6110 insertion DNA fragment of MTb modified and cloned into the bacteriophage (, containing DNA fragments used in the kit as matrix for the primer.

In this regard, different PCR studies have been published for the diagnosis of TBP, where handmade and commercial PCR tests have been used, with the use of different kits that do not make the results very homogeneous . In assessing these studies, oscillating values of mean specificity greater than 90% were found for PCR, but with mean sensitivity less than 80% according to the type of test used - .

Up to 2012 two RT-PCR studies were found, both published in 2011, one of which was published by Kalantri et al. , comparing RT-PCR with INFγ, IgA and ADA with respect to a combined reference method, where they found a sensitivity of 80%, higher than that mentioned in the other studies and a specificity of 98%. However, when compared to other criteria (clinical manifestations, response to empirical treatment and exclusion of other diagnoses) instead of the composite reference method, this sensitivity decreased to 64.9% while maintaining specificity unchanged . The other study, developed in Brazil, by Rosso, et al. , reported a sensitivity of 42.8% and a specificity of 94.2% for this test .

Considering that the evidence on the validity of RT-PCR in TBP is insufficient, we decided to carry out a study to evaluate the validity of this test comparing it with a combined reference method, in the adult hospitalization service of the Hospital Universitario de la Samaritana (HUS), in patients with lymphocytic exudate pleural effusion (according to light criteria and with a higher proportion of lymphocytes than neutrophils).

Materials and Methods

Design

Study of cross-sectional diagnostic tests to determine the validity of pleural fluid RT-PCR for the diagnosis of TBP.

Participants

The population under study were all patients over 18 years of age evaluated for lymphocytic exudate pleural effusion during the period from September 1, 2009 to September 30, 2012, in the HUS internal medicine hospitalization service, where the patient and the attending physician agree to participate in the study of pleuritis with the standard methods used by them.

Inclusion criteria were: Patients older than 18 years of age hospitalized in the HUS internal medicine service during the study period, with lymphocytic exudate-type pleural effusion (ratio of fluid proteins to serum proteins greater than 0.5 or LDH ratio of the fluid over serum LDH greater than 0.6 or LDH of the fluid greater than 2/3 of the upper limit of the serum normal value and with more than 50% of lymphocytes with no identified aetiology the study of which included ZN of pleural fluid or tissue, culture of pleural fluid or pleural tissue for M. tuberculosis and/or histology of pleural tissue with granulomas and where RT-PCR was performed with liquid or pleural tissue hybridization probes for M. tuberculosis.

Exclusion criteria were: Transudated pleural effusion (does not meet any of the exudate criteria discussed above) ; Neutrophilic exudate pleural effusion (meets exudate criteria above and with more than 50% neutrophils); Patients whose samples have been processed using techniques other than the protocols described later in this document. Patients for whom the study of the etiology of pleural effusion was incomplete because they had negative results in an insufficient number of standard diagnostic tests for an exudate pleural lymphocyte (they were not studied with all the tests that are part of the reference method of this work despite having negative results in the tests that were performed: ZN of pleural fluid or tissue, fluid culture or pleural tissue for M. tuberculosis and histology of pleural tissue).

Initially we used the molecular biology laboratory database where we had all the RT-PCR hybridation probes for M. tuberculosis performed in pleural liquid or tissue during the years of the study and with this information we arranged to search (previous authorization from the Patient and hospital) in the medical records of these patients the other inclusion criteria required.

Once the information was collected, we prepared to perform their respective coding and tabulation by double entry, using an instrument designed for data collection.

Diagnostic methods and reference method

A combined reference method was defined as follows: 1. Culture of pleural fluid or tissue for M. tuberculosis; 2. Ziehl-Neelsen (ZN) of pleural fluid or tissue; and 3. Histology of pleural tissue.

One of these three positive tests diagnosed M. tuberculosis pleuritis and it was ruled out if all three were negative. It was considered a probable case if the reference method was negative but the RT-PCR hybridization probes for M. tuberculosis was positive and the ADA greater than 47 UI/L .

Both the reference method tests and the ADA and the RT-PCR hybridization probes for M. tuberculosis were performed simultaneously once the diagnosis was made from lymphocyte exudate initially in pleural fluid and if these were inconclusive for a definitive diagnosis, these tests were made simultaneously in a sample of pleural biopsy. At the beginning of the study, there was no diagnosis of the etiology of the pleural effusion or previous history of TB or cancer, although this was not an exclusion criterion.

The complete extraction of the DNA in the pleural fluid of the patients, as well as the assembly of the RT-PCR hybridization probes was performed according to the recommendations of the kit manufacturer (SACACE Biotechnologies, Italy). In order to remove inhibitors from the RT-PCR reaction, initially all the pleural fluids obtained were treated with 250 mg of N-acetyl-L-Cysteine (Sigma), 4% NaOH and sodium citrate at 2.94%. The DNA subsequently obtained was used to assemble the RT-PCR using hybridization probes (FAM Emission) for the qualitative detection of the IS6110 gene specifically present in the Mycobacteria DNA of the tuberculous complex (M. tuberculosis, M. Africanum, M. bovis, M. bovis BCG, M. microti). Under the following amplification conditions: 1 Cycle: 95° C for 15 min, 40 Cycles: 95° C for 15 s, 65° C for 30 s, 72° C for 15 s. In order to discard the false negatives by the presence of amplification reaction inhibitors, an internal control (IC) of amplification (JOE emission) was added to all the samples. The assembly of the RT-PCR and the analysis of the results was carried out using the STRATAGENE MX 3005P equipment in the MxPro program. Samples were considered positive or negative based on increased fluorescence above the threshold established in the FAM and JOE channels. Thus, a sample was considered positive for M. tuberculosis if the fluorescence exceeded the limit of the established threshold in the FAM (green) channel, whereas a sample was considered negative if it did not show fluorescence in the FAM channel and presented positive fluorescence in the JOE channel. It is important to clarify that the results obtained for each patient with this technique were obtained in a maximum time of four hours.

All samples included in the study were grown in Ogawa kudot solid medium, using the modified Petroff technique, where the liquid samples were centrifuged at 3,000 rpm for 30 min and the sediment was resuspended in a maximum of 2 mL and deposited in the medium directly, cultivating in an inclined position at 37° C for 8 weeks.

These tests were processed by HUS personnel with extensive track record and experience in molecular biology, microbiology, clinical laboratory and pathology, respectively. The persons responsible for carrying out the tests of the reference method did not know the result of RT-PCR for M. Tuberculosis. And the person in charge of performing RT-PCR for M. tuberculosis was unaware of the outcome of the reference method.

Statistical Methods

The sample size estimation was based on the likelihood ratios and confidence intervals in a single-sample diagnostic test, where diagnostic tests are compared in the same subjects (paired design), for a 95% expected sensitivity, a 95% expected specificity, a 50% prevalence of pleural tuberculosis in the studied population, expecting an amplitude of the confidence interval of 95% of 0.1 on each side, using the equation proposed by Duffau - . With these parameters a sample size of 34 patients was estimated for this study.

Sensitivity, specificity, positive and negative predictive values, and respective confidence intervals were calculated for RT-PCR, ZN coloration and culture in pleural fluid, compared to the reference method. Confidence intervals were determined using the Mid-P Exact Test. The software OpenEpi version 2.3 (2009) was used.

Results

Participants and results

A population of 60 patients with pleural effusion in the HUS was included during the study period, of whom 40 met the inclusion criteria and of these nine (prevalence of 22.5%) were confirmed the diagnosis of TBP with the method reference. Of these nine patients confirmed with TBP, six were positive and three negative for RT-PCR, the latter were considered false negatives of the RT-PCR, since they presented resolution of the picture with antituberculous treatment. There were no patients with probable TBP (probable TBP: negative reference method with positive RT-PCR and ADA greater than 47 IU/L). There were two false positives for RT-PCR, one with pleural mesothelioma and the other with chronic pleuritis with mesothelial hyperplasia. In patients diagnosed with TPB, we found an average of 47.4 years of age with a standard deviation of ( 15.2. 66.7% of the patients with TBP were men.

Of the 40 patients included in the study (Fig. 1), 9 patients were confirmed TBP: 1 per culture for TB, ZN and PCR for TB positive in pleural fluid; 1 by ZN and PCR for TB positive in pleural fluid; 2 by culture for TB and PCR for positive TB in pleural fluid; 1 per culture for TB and PCR for positive TB in pleural fluid and pleural biopsy with casein granulomas; 1 per culture for positive TB in pleural fluid, culture for TB and PCR for positive TB in pleural tissue and pleural biopsy with casean granulomas; 2 by pleural biopsy with casein granulomas; 1 by PCR for positive TB in pleural fluid and pleural biopsy with casein granulomas. TB was discarded in thirty-one patients because of the negative reference method, where the cause of pleural lymphocytic effusion in 29.0% was due to association with neoplasia by pleural biopsy, of which three cases were due to mesothelioma and the remaining cases due to metastases, squamous cell carcinoma and adenoma without specified primary. 58.1% were associated with chronic reactive pleural inflammation with no other etiology and 12.9% had no clear diagnosis at the time of inclusion in the study.

Figure 1

Flowchart: RT - PCR in pleural fluid for diagnosis of TBP. Note: TBP: pleural tuberculosis; RT-PCR: real-time polymerase chain reaction

Estimates

A sensitivity of 66.7% (95% CI: 33.2%-90.7%) and a specificity of 93.5% (95% CI: 80.3%-98.9%) were calculated for the test under study (qualitative RT-PCR for MTb). The PPV was 75% (95% CI: 38.8%-95.6%) and the NPV was 90.6% (95% CI: 76.6%-97.6%) (Table 1).

Table 1

Results in the different diagnostic tests with respect to the diagnosis of TBP according to the definitive diagnosis obtained by the reference method.

Definitive Diagnosis	N: 40	RT - PCR in liquid		Liquid ZN		Tissue ZN		MTb liquid culture		MTb Tissue Culture		Histology of TBP pleura
		Positive	Negative	Positive	Negative	Positive	Negative	Positive	Negative	Positive	Negative	Positive	Negative
TBP	9	6	3	2	3	-	2	5	2	1	-	5	-
Mesothelioma	5	1	4	-	5	-	-	-	5	-	-	-	5
Chronic pleuritis with mesothelial hyperplasia	2	1	1	-	2	-	1	-	2	-	-	-	2
Other Tumors	5	-	5	-	5	-	-	-	5	-	-	-	5
Nonspecific Pleuritis	19	-	19	-	17	-	2	-	18	-	1	-	19
Total	40	8	32	2	32	-	5	5	32	1	1	3	31

TBP: pleural tuberculosis; RT-PCR: real-time polymerase chain reaction; ZN: coloration of Ziehl Neelsen; MTb: Mycobacterium tuberculosis.

With regard to culture for M. tuberculosis in pleural fluid, a sensitivity of 55.6% (95% CI: 39.7%-89.2%) was found with a specificity of 100% (95% CI: 87.1-100%); and for ZN in pleural fluid a sensitivity of 22.2% (95% CI: 39.7%-89.2%) was calculated with a specificity of 100% (95% CI: 87.1%-100%) (Table 1).

Discussion

With these results, the operating characteristics of the RT-PCR for the diagnosis of M. tuberculosis in pleural fluid in the HUS were established. A sensitivity (66.7%) was found, similar to that found in previously referenced studies - . . On the other hand, the specificity calculated was relatively high (93.5%) and both results were similar to that found by other authors.

In culture for M. tuberculosis in pleural fluid a sensitivity of 55.6% was found while ZN in pleural fluid was 22.2%; both had a specificity of 100%. These values show lower sensitivities than the RT-PCR, confirming once again the need to have a combined reference method since these tests alone could not rule out the presence of pleural tuberculosis. Additionally, in the case of cultures, the time required to obtain the diagnosis is extended to 8 weeks in such a way that a rapid test is required, such as RT-PCR, to define the initial management of the patient in a maximum time of four hours which is what this test would take to generate a result.

In the meta-analysis performed by Pai, et al. , commercial and artisanal PCR were evaluated, reporting a sensitivity of 62% and 71%, with a specificity of 98% and 93%, respectively, which is similar to that found in our research for RT-PCR. The studies included in this meta-analysis had small sample sizes and were heterogeneous; the reference method used included culture for M. tuberculosis, clinical findings, microbiology or biopsy, so that these reference methods lack precision to make a definitive diagnosis and make validation of the test under study difficult. Later in 2005, Chakravorty et al. , used the IS6110 and devRf3 (artesian tests) in liquid with a sensitivity of 75.5% and a specificity of 93.8%, similar for each test, with a greater sensitivity to that reported by us and with the same specificity, with a method of compound reference, not well defined, given by clinical, microbiology, cytology/histology and response to treatment, with a sample of 87 patients. In Taiwan, Liu et al. , published an artisanal PCR study using the IS6110 segment, reporting a sensitivity of 43.3% and a specificity of 95.5%, being the sensitivity lower than that described in our research, with no variation in the specificity and with false positives in 4.5% of the patients studied. Additionally, in the combined reference method, clinical and response to empirical treatment were included, making it difficult to perform an objective evaluation. And finally Kalantri, et al. , with a population of 204 cases divided into three groups by their diagnostic form (confirmed, probable and without TBP) reported a sensitivity of 80% having a composite reference method equal to that used by us and of 57.7% taking into account the clinic, response to treatment and having excluded other pathologies, with a specificity of 98.0% similar to that described in this study.

According to our reference method, there were 9 cases of TBP in our study and 31 cases with lymphocytic pleuritis due to causes other than TB, which gives us a prevalence of TBP of 23%. This prevalence is similar to that found in TBP studies in Spain and higher than the prevalence of TB in the studies carried out in the majority of countries with GDP higher than in our country and this could be explained by an epidemiological transition in our population with an increase in the frequency of neoplastic diseases and a reduction in the frequency of infectious diseases.

The operating characteristics of the PCR vary depending on the technique used and the association of other diagnostic tests and clinical characteristics of the patient. It can be observed that the use of RT-PCR requires less time, with high specificity but with low sensitivity. This makes the test insufficient to rule out TBP if the RT-PCR is negative and there is no alternative diagnosis and it requires performing the complete combined reference method. By having sensitivity and specificity values superior to those obtained with the other tests individually and yielding results much more quickly, it is a useful test to define early on the treatment to follow with a patient with lymphocyte exudate: if it is positive there would be valid reasons to start anti-tuberculosis treatment and if it is negative, not do so. However, these results should be analyzed in the clinical context of the patient and should be confirmed with reference method (ZN, culture and biopsy), since the predictive values are not good enough (PPV: 75.0% and NPV: 90.6%) for the use of RT-PCR as a definitive diagnostic method. In fact, two false positives were presented with a diagnosis of mesothelioma and chronic pleuritis with mesothelial hyperplasia, respectively.

For this study, a combined reference method was used, which allowed for a definitive and objective diagnosis of TBP and, therefore, to assess a more precisely the operating characteristics of the test under study, becoming a strength for this research. However, we should note that a weakness of the study is the sample size, which was low for the findings finally found, which increased confidence intervals and decreased study accuracy. This forces us to suggest conducting studies of validation of the RT-PCR with larger sample sizes, to increase the precision of the results.

Conclusions

The RT-PCR for M. tuberculosis in pleural fluid has good specificity for the diagnosis of TBP, but because its predictive values are not high enough, it should not be used for the definitive diagnosis of the disease. Its greatest use would be as a method to quickly define the behavior to follow with a patient, while the reports of the definitive diagnostic tests arrive. Cultures for M. tuberculosis and ZN of pleural fluid and tissue have a lower diagnostic yield than RT-PCR and it is necessary to continue using the combined reference method to establish the definitive diagnosis of lymphocytic pleuritis.

It is necessary to carry out new studies with a larger sample size in order to increase the precision of the previously established results.

Introducción

La tuberculosis (TB) es una enfermedad de gran impacto en salud pública desde hace décadas . Su compromiso puede ser multisistémico y cuando compromete espacios en donde su comportamiento es paucibacilar, se hace más difícil su diagnóstico y el inicio de un tratamiento adecuado y oportuno .

Epidemiológicamente, la TB tiene distribución mundial, la tasa de mortalidad de 2014 se redujo a cerca de la mitad de la de 1990 . No obstante, en el 2015 murieron de TB 1.4 millones de personas en todo el mundo . La incidencia mundial de la TB ha disminuido un 1.5% al año desde el 2000, y un 18% en total . Colombia en el año 2015 reportó una incidencia de 31 casos por 100,000 habitantes, con una mortalidad de 2.1 casos por 100,000 habitantes . De éstos, 2,385 casos fueron extra pulmonares de los cuales 863 correspondieron a tuberculosis pleural (TBP) . La TB constituye, junto con el VIH, una de las principales causas mundiales de muerte .

Para el diagnóstico de la TB es fundamental la detección del bacilo por cultivo, coloraciones de estudios histopatológicos o de líquidos corporales, pero hay que tener en cuenta que en menos del 5% de los casos de TBP se logra obtener una baciloscopia positiva en el líquido pleural debido a la naturaliza paucibacilar de esta entidad . La identificación de la especie y su resistencia a antibióticos se consigue mediante cultivo y/o técnicas basadas en PCR . El Mycobacterium tuberculosis se aísla en cultivo sólo en un 20 a 40% de los casos de una pleuritis tuberculosa confirmada, siendo el rendimiento diagnóstico del cultivo en líquido pleural bajo, pero puede aumentar si también se cultiva una muestra de tejido pleural ,,. La biopsia pleural con evidencia de granulomas es positiva en un 75% de los casos ,.

La Adenosin deaminasa (ADA) marcador inflamatorio no específico, es una enzima cuya actividad está involucrada en la diferenciación y proliferación de los linfocitos y la activación de los macrófagos y neutrófilos, siendo indicativa de respuesta inflamatoria local activa . La determinación de la isoenzima ADA2 podría aumentar la precisión ya que es liberada de los monocitos y es encontrada en una alta concentración en pleuritis por TB. Se ha sugerido que niveles mayores de ADA en líquido pleural predicen mejor el diagnóstico de TB con una sensibilidad del 90 al 100% y una especificidad del 89 al 100% cuando se usa el método Guisti . La especificidad para discriminar entre derrame pleural por TB y malignidad fue del 95%, siendo baja para la diferenciación entre derrame paraneumónico .

Por estos motivos se ha recomendado utilizar como método de referencia para hacer el diagnóstico de TBP la combinación de varias pruebas, incluyendo los cultivos y la tinción de Ziehl-Neelsen (ZN) del líquido o del tejido pleural; y el estudio histopatológico del tejido pleural ,.

El lento crecimiento del M. tuberculosis en cultivo ha llevado a la búsqueda de pruebas rápidas de diagnóstico y de nuevos métodos que lo detecten directamente en muestras clínicas, sin la necesidad de esperar el resultado de dichos cultivos .

Por esta razón se han venido utilizando otros métodos diagnósticos, entre los cuales está la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-PCR) de tipo cualitativa, que es una prueba de biología molecular, que identifica el ADN de la micobacteria, utilizando una técnica donde los procesos de amplificación y detección se producen de manera simultánea en el mismo vial cerrado, sin necesidad de ninguna acción posterior, emitiendo resultados en menor tiempo y con una alta especificidad (98%), pero con una baja o variable sensibilidad (62%) no siendo útil para excluir la enfermedad .

Los sistemas de detección por fluorescencia empleados en la RT-PCR pueden ser de dos tipos: agentes intercalantes y sondas específicas marcadas con fluorocromos . Los agentes intercalantes son fluorocromos que aumentan notablemente la emisión de fluorescencia cuando se unen a ADN de doble hélice. El más empleado en RT - PCR es el SYBR Green I . El principal inconveniente es su baja especificidad, debido a que se unen de manera indistinta a productos generados inespecíficamente o a dímeros de cebadores, muy frecuentes en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Para mejorar la especificidad se deben emplear condiciones de reacción óptimas y una selección cuidadosa de los cebadores para disminuir el riesgo de formación de dímeros. Además, es recomendable iniciar la reacción de síntesis de ADN a temperaturas elevadas (hot-start PCR) lo cual disminuye de forma notable el riesgo de amplificaciones inespecíficas .

Las sondas de hibridación específicas, son sondas marcadas con dos tipos de fluorocromos, un donador y un aceptor. El proceso se basa en la transferencia de energía fluorescente mediante resonancia (FRET) entre las dos moléculas. Las más utilizadas son :

1. Sondas de hidrólisis, denominadas también sondas TaqMan

2. Molecular beacons.

3. Sondas FRET. El sistema se compone de dos sondas que se unen a secuencias adyacentes del ADN diana. Una de las sondas lleva un donador en el extremo 3' y la otra un aceptor en el extremo 5'. Cuando las sondas están hibridadas, los dos fluorocromos están próximos. Al ser excitado, el donador transfiere su energía al aceptor que, a su vez, emite la fluorescencia que detecta el lector del equipo.

En todos estos sistemas, el incremento de ADN en cada ciclo se corresponde con un aumento de hibridación de las sondas, lo que conlleva un aumento en la misma proporción de fluorescencia emitida. El empleo de sondas garantiza la especificidad de la detección y permite identificar polimorfismos o mutaciones puntuales, pero su coste es más elevado que el SYBR Green y la optimización de las condiciones de la reacción resulta más difícil .

La prueba diagnóstica evaluada en el presente trabajo es M. tuberculosis Real-TM (Equipo de RT-PCR para la detección del complejo M. tuberculosis) la cual es un test de amplificación en tiempo real para la detección cualitativa del complejo M. tuberculosis en materiales biológicos (se obtiene el resultado en un promedio de 3.5 días). El ADN es extraído de las muestras; amplificado y detectado mediante sondas fluorescentes específicas para M. tuberculosis y control interno (M. tuberculosis). Mycobacterium tuberculosis (control interno) es un fragmento de ADN de inserción IS 6110 de MTb modificado y clonado en el bacteriófago (, conteniendo fragmentos de ADN usados en el equipo como matriz para el primer.

Al respecto, se han publicado diferentes estudios de PCR para el diagnóstico de TBP, en los cuales se han utilizado pruebas de PCR artesanales y otras comerciales, con el uso de diferentes estuches que han hecho que los resultados no sean muy homogéneos . Al valorar dichos estudios se ha encontrado para la PCR valores oscilantes de especificidad promedio mayor al 90%, pero con sensibilidad promedio menor al 80% según el tipo de prueba utilizada -.

Hasta el año 2012 se encontraron dos estudios con RT-PCR, ambos publicados en el año 2011, uno de ellos, publicado por Kalantri, et al. , quienes comparan la RT- PCR con el INFγ, IgA y ADA con respecto a un método de referencia combinado, donde encontraron una sensibilidad del 80%, superior a la mencionada en los demás estudios y una especificidad del 98%. Sin embargo, cuando se comparaba respecto a otros criterios (manifestaciones clínicas, respuesta a tratamiento empírico y la exclusión de otros diagnósticos) en lugar del método de referencia compuesto, esta sensibilidad disminuía al 64.9% manteniendo una especificidad sin cambios . El otro estudio, desarrollado en Brasil, por Rosso, et al. , reportó una sensibilidad del 42.8% y una especificidad del 94.2% para esta prueba .

Considerando que la evidencia sobre la validez de la RT - PCR en TBP es insuficiente, se decidió realizar un estudio para evaluar la validez de esta prueba comparándola con un método de referencia combinado, en el servicio de hospitalización adultos, del Hospital Universitario de la Samaritna (HUS), en pacientes con derrame pleural tipo exudado linfocitario (según los criterios de light y con mayor proporción de linfocitos que de neutrófilos).

Materiales y Métodos

Diseño

Estudio de pruebas diagnósticas de corte transversal, para determinar la validez de la RT-PCR en líquido pleural para el diagnóstico de TBP.

Participantes

La población en estudio fueron todos los pacientes mayores de 18 años evaluados por derrame pleural tipo exudado linfocitario, durante el periodo comprendido entre el primero de septiembre de 2009 hasta el 30 de septiembre de 2012, en el servicio de hospitalización de medicina interna del HUS, donde el paciente y el médico tratante aceptaran participar en el estudio de la pleuritis con los métodos estándares por ellos utilizados.

Los criterios de inclusión fueron: Pacientes mayores de 18 años de edad hospitalizados en el servicio de medicina interna del HUS durante el periodo del estudio, con derrame pleural tipo exudado linfocitario (relación proteínas del líquido sobre proteínas séricas mayor a 0.5 o relación LDH del líquido sobre LDH sérico mayor de 0.6 o LDH del líquido mayor de los 2/3 del límite superior del valor normal sérico y con más del 50% de linfocitos sin etiología identificada, cuyo estudio haya incluido ZN de líquido o tejido pleural, cultivo de líquido o tejido pleural para M. tuberculosis y/o histología de tejido pleural con granulomas y en quienes se haya realizado RT-PCR con sondas de hibridación en líquido o tejido pleural buscando M. tuberculosis.

Los criterios de exclusión fueron: Derrame pleural tipo transudado (no cumple ninguno de los criterios de exudado expuestos anteriormente ; Derrame pleural tipo exudado neutrofílico (cumple los criterios de exudado expuestos anteriormente y con más del 50% de neutrófilos); Pacientes a quienes las muestras se hayan procesado con técnicas diferentes a los protocolos que se describen más adelante en este documento. Pacientes en quienes el estudio de la etiología del derrame pleural haya quedado incompleto porque tuvieron resultados negativos en un número insuficiente de pruebas diagnósticas estándares para un exudado pleural linfocitario (no fueron estudiados con todas las pruebas que hacen parte del método de referencia de este trabajo a pesar de haber tenido resultados negativos en las pruebas que se les practicaron: ZN de líquido o tejido pleural, cultivo de líquido o tejido pleural para M. tuberculosis e histología de tejido pleural)

Inicialmente se utilizó la base de datos del laboratorio de biología molecular donde contamos con todas las RT-PCR sondas de hibridación para M. tuberculosis realizadas en líquido o tejido pleural durante los años del estudio y con esta información nos dispusimos a buscar (previa autorización del paciente y el hospital) en las historias clínicas de estos pacientes los demás criterios de inclusión requeridos.

Una vez recolectada la información, nos dispusimos a realizar su respectiva codificación y tabulación por doble entrada, para lo que se utilizó un instrumento diseñado para la recolección de datos.

Métodos diagnósticos y método de referencia

Se definió un método de referencia combinado de la siguiente forma: 1. Cultivo de líquido o tejido pleural para M. tuberculosis; 2. Ziehl-Neelsen (ZN) de líquido o tejido pleural; e 3. Histología de tejido pleural.

Con una de estas tres pruebas diagnósticas positiva se diagnosticó la pleuritis por M. tuberculosis y dicha entidad se descartó si las tres fueron negativas. Se consideró como caso probable si el método de referencia era negativo pero la RT-PCR sondas de hibridación para M. tuberculosis positiva y el ADA mayor de 47 UI/L .

Tanto las pruebas del método de referencia como el ADA y la RT-PCR sondas de hibridación para M. tuberculosis fueron realizadas en paralelo una vez se hizo el diagnóstico a partir del exudado linfocitario inicialmente en líquido pleural y si estas no eran concluyentes para generar un diagnóstico definitivo se realizaron dichas pruebas de forma paralela en muestra de biopsia pleural. Al inicio del estudio no se tenía el diagnóstico de la etiología de dicho derrame pleural ni tampoco antecedente previo de TB ni cáncer, aunque esto no era un criterio de exclusión.

La extracción total del ADN presente en el líquido pleural de los pacientes, así como el montaje de la RT-PCR sondas de hibridación se realizó según las recomendaciones del fabricante del kit (SACACE Biotechnologies, Italy). Para ello y con el fin de remover inhibidores de la reacción de la RT-PCR, inicialmente todos los líquidos pleurales obtenidos, fueron tratados con 250 mg de N-acetil-L Cisteina (Sigma), NaOH al 4% y citrato de sodio al 2.94%. El ADN posteriormente obtenido fue utilizado en el montaje de la RT-PCR, utilizando sondas de hibridación (Emisión FAM) para la detección cualitativa del gen IS6110 presente de forma específica en el ADN de las Micobacterias pertenecientes al complejo tuberculoso (M. tuberculosis, M. africanum, M. bovis, M. bovis BCG, M. microti). Bajo las siguientes condiciones de amplificación: 1 Ciclo: 95° C por 15 min, 40 Ciclos: 95° C por 15 s, 65° C por 30 s, 72° C por 15 s. Con el fin de descartar los falsos negativos por presencia de inhibidores de la reacción de amplificación, a todas las muestras se les adicionó un control interno (CI) de amplificación (Emisión JOE). El montaje de la RT-PCR y el análisis de los resultados se llevó acabo utilizando el equipo STRATAGENE MX 3005P en el programa MxPro. Las muestras fueron consideradas positivas o negativas basados en el aumento de la fluorescencia por encima del umbral establecido en los canales FAM y JOE. De esta forma, una muestra se consideró positiva para M. tuberculosis si la fluorescencia superó el límite del umbral establecido en el canal FAM (verde), mientras que una muestra se consideró negativa si no presentó fluorescencia en el canal FAM y presentó fluorescencia positiva en el canal JOE. Es importante aclarar que los resultados obtenidos para cada paciente con esta técnica se obtuvieron en un tiempo máximo de cuatro horas.

Todas las muestras incluidas en el estudio fueron cultivadas en medio sólido Ogawa kudot, utilizando la técnica de Petroff modificada, en donde las muestras liquidas fueron centrifugadas a 3,000 rpm durante 30 min y el sedimento es resuspendido en un máximo de 2 mL y depositado en el medio directamente; cultivando en posición inclinada a 37° C durante 8 semanas.

Estas pruebas fueron procesadas por personal del HUS con una amplia trayectoria y experiencia en biología molecular, microbiología, laboratorio clínico y patología, respectivamente. Las personas encargadas de ejecutar las pruebas del método de referencia desconocían el resultado de la RT-PCR para M. tuberculosis; y la persona encargada de realizar la RT-PCR para M. tuberculosis desconocía el resultado del método de referencia.

Métodos estadísticos

La estimación del tamaño muestral se hizo con base en las razones de verosimilitud e intervalos de confianza en un estudio de pruebas diagnósticas, de una sola muestra, donde las pruebas diagnósticas en evaluación son comparadas en los mismos sujetos (diseño emparejado), para una sensibilidad esperada del 90%, una especificidad esperada del 95% una prevalencia de tuberculosis pleural en la población estudiada del 50%, esperando una amplitud del intervalo de confianza del 95% de 0.1 a cada lado, utilizando la ecuación propuesta por Duffau -. Con estos parámetros se estimó un tamaño de muestra para este estudio de 34 pacientes.

Se calcularon la sensibilidad, especificidad, valores predictivos positivo y negativo, y los respectivos intervalos de confianza, para la RT-PCR, cultivo y coloración de ZN en líquido pleural, comparados con el método de referencia. Los intervalos de confianza se determinaron mediante la Prueba Mid-P Exact. Se utilizó el software OpenEpi versión 2.3 (2009).

Resultados

Participantes y resultados

Se obtuvo una población de 60 pacientes con derrame pleural en el HUS durante el periodo del estudio, de los cuales 40 cumplieron con los criterios de inclusión y de estos a nueve (prevalencia de 22.5%) se les confirmó el diagnóstico de TBP con el método de referencia. De estos nueve pacientes confirmados con TBP, 6 fueron positivos y 3 negativos para la RT-PCR, estos últimos, se consideraron como falsos negativos de la RT-PCR, ya que presentaron resolución del cuadro con el manejo antituberculoso. No hubo pacientes con TBP probable (TBP probable: método de referencia negativo con RT-PCR positiva y ADA mayor de 47UI/L). Se presentaron dos falsos positivos para la RT - PCR, uno con un mesotelioma pleural y el otro con una pleuritis crónica con hiperplasia mesotelial. En los pacientes con diagnóstico de TBP encontramos una media de 47.4 años de edad con una desviación estándar de (15.2. El 66.7% de los pacientes con TBP fueron hombres.

De los 40 pacientes incluidos en el estudio (Fig. 1), a 9 pacientes se les confirmó TBP: uno por cultivo para TB, ZN y PCR para TB positivos en liquido pleural; uno por ZN y PCR para TB positivos en liquido pleural; dos por cultivo para TB y PCR para TB positivos en liquido pleural; uno por cultivo para TB y PCR para TB positivos en liquido pleural y biopsia pleural con granulomas de caseificación; uno por cultivo para TB positivo en liquido pleural, cultivo para TB y PCR para TB positivos en tejido pleural y biopsia pleural con granulomas de caseificación; dos por biopsia pleural con granulomas de caseificación; uno por PCR para TB positiva en liquido pleural y biopsia pleural con granulomas de caseificación. A 31 pacientes se les descartó TBP por presentar el método de referencia negativo, encontrando como causa del derrame pleural linfocitario en el 29.0% asociación a neoplasia por biopsia pleural, de los cuales, tres casos fueron por mesotelioma y los restantes por metástasis, CA escamocelular y adenoma sin primario especificado. El 58.1% se asoció a inflamación crónica pleural reactiva sin otra etiología encontrada y el 12.9% no tuvo un diagnóstico claro al momento de la inclusión en el estudio.

Figura 1

Diagrama de flujo: RT-PCR en líquido pleural para diagnóstico de TBP.

Estimaciones

Para la prueba en estudio (RT-PCR cualitativa para MTb) se calculó una sensibilidad del 66.7% (IC 95%: 33.2%-90.7%) y una especificidad del 93.5% (IC 95%: 80.3%-98.9%). El VPP fue 75% (IC 95%: 38.8%-95.6%) y el VPN fue 90.6% (IC 95%: 76.6%-97.6%) (Tabla 1).

Tabla 1

Resultados en las diferentes pruebas diagnósticas con respecto al diagnóstico de TBP según el diagnóstico definitivo obtenido por el método de referencia.

Diagnóstico Definitivo	N: 40	RT - PCR en líquido		ZN líquido		ZN tejido		Cultivo MTb líquido		Cultivo MTb tejido		Histología pleura de TBP
		Positiva	Negativa	Positiva	Negativa	Positiva	Negativa	Positiva	Negativa	Positiva	Negativa	Positiva	Negativa
TBP	9	6	3	2	3	-	2	5	2	1	-	5	-
Mesotelioma	5	1	4	-	5	-	-	-	5	-	-	-	5
Pleuritis crónica con hiperplasia mesotelial	2	1	1	-	2	-	1	-	2	-	-	-	2
Otros Tumores	5	-	5	-	5	-	-	-	5	-	-	-	5
Pleuritis inespecífica	19	-	19	-	17	-	2	-	18	-	1	-	19
Total	40	8	32	2	32	-	5	5	32	1	1	3	31

TBP: tuberculosis pleural; RT-PCR: reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real; ZN: coloración de Ziehl Neelsen; MTb: Mycobacterium tuberculosis.

Con respecto al cultivo para M. tuberculosis en líquido pleural se encontró una sensibilidad del 55.6% (IC 95%: 39.7%-89.2%) con una especificidad del 100% (IC 95%: 87.1-100%); y para el ZN en líquido pleural se calculó una sensibilidad del 22.2% (IC 95%: 39.7%-89.2%) con una especificidad del 100% (IC 95%: 87.1% - 100%) (Tabla 1).

Discusión

Con estos resultados se establecieron las características operativas de la RT -PCR para el diagnóstico de M. tuberculosis en líquido pleural en el HUS. Se determinó una sensibilidad (66.7%) similar a lo encontrado en estudios previamente referenciados -,. Por otra parte, la especificidad calculada fue relativamente alta (93.5%) y ambos resultados fueron similares a lo encontrado por otros autores.

En el cultivo para M. tuberculosis en líquido pleural se encontró una sensibilidad del 55.6% mientras que para el ZN en líquido pleural fue del 22.2%, ambos tuvieron una especificidad del 100%. Estos valores muestran sensibilidades menores a la de la RT-PCR, confirmando una vez más la necesidad de tener un método de referencia combinado ya que estas pruebas por si solas no podrían descartar la presencia de tuberculosis pleural. Adicionalmente, en el caso de los cultivos, el tiempo necesario para obtener el diagnóstico se alarga hasta 8 semanas de tal manera que obliga a recurrir a una prueba rápida, como la RT-PCR, para definir el manejo inicial del paciente en un tiempo máximo de cuatro horas que es lo que esta prueba se tardaría en generar un resultado.

En el meta-análisis realizado por Pai, et al. , se evaluó PCR comerciales y artesanales, reportando una sensibilidad del 62% y 71%, con una especificidad del 98% y 93%, respectivamente, lo cual es similar a lo encontrado en nuestra investigación para RT-PCR. Los estudios incluidos en este meta-análisis tenían tamaños muestrales pequeños y eran heterogéneos, los método de referencia utilizados incluían cultivo para M. tuberculosis, hallazgos clínicos, microbiología o biopsia, de tal forma que estos método de referencia carecen de precisión para dar un diagnóstico definitivo y dificultan la validación de la prueba en estudio. Posteriormente en el año 2005, Chakravorty et al. , utilizaron el ensayo IS6110 y devRf3 (pruebas artesanales) en líquido con una sensibilidad del 75.5% y una especificidad del 93.8%, similar para cada prueba, con una mayor sensibilidad a la reportada por nosotros e igual especificidad, con un método de referencia compuesto, no bien definido, dado por la clínica, microbiología, cito/histología y la respuesta a tratamiento, con una muestra de 87 pacientes. En Taiwán, Liu et al. , publicaron un estudio de PCR artesanal utilizando el segmento IS6110, reportando una sensibilidad del 43.3% y una especificidad del 95.5%, siendo la sensibilidad inferior a la descrita en nuestra investigación, sin variaciones en la especificidad y con falsos positivos en un 4.5% de los pacientes estudiados. Adicionalmente en el método de referencia combinado se incluyó la clínica y la respuesta al tratamiento empírico lo que dificulta realizar una evaluación objetiva. Y finalmente Kalantri, et al. , con una población de 204 casos divididos en tres grupos por su forma de diagnóstico (confirmada, probable y sin TBP) reportó una sensibilidad del 80% al tener un método de referencia compuesto igual al usado por nosotros y del 57.7% al tener en cuenta la clínica, respuesta al tratamiento y haber excluido otras patologías, con una especificidad del 98.0% similar a la descrita en el presente trabajo.

De acuerdo con nuestro método de referencia, en nuestro estudio tuvimos 9 casos de TBP y 31 casos con pleuritis linfocitaria por causas diferentes a TB, lo cual nos da una prevalencia de TBP de 23%, esta prevalencia es similar a la encontrada en estudios de TBP en España y superior a la prevalencia de TBP en los estudios realizados en la mayoría de países con PIB superior al de nuestro país y podría explicarse por una transición epidemiológica en nuestra población con un incremento en la frecuencia de enfermedades neoplásicas y una reducción en la frecuencia de enfermedades infecciosas.

Las características operativas de la PCR varían dependiendo de la técnica utilizada y de la asociación de otras pruebas diagnósticas y características clínicas del paciente. Se puede observar que el uso de la RT-PCR requiere menor tiempo, con alta especificidad pero con baja sensibilidad. Esto hace que la prueba resulte insuficiente para descartar TBP si la RT-PCR es negativa y no existe otro diagnóstico alterno, y exige realizar el método de referencia combinado completo. Al tener unos valores de sensibilidad y especificidad superiores a los obtenidos con las otras pruebas en forma individual y arrojar resultados en forma mucho más rápida, resulta una prueba útil para definir tempranamente el manejo a seguir con un paciente que tenga exudado linfocitario: si es positiva habría razones válidas para comenzar el tratamiento anti -tuberculoso y si es negativa para no hacerlo. Sin embargo estos resultados deben ser analizados en el contexto clínico del paciente y deben confirmarse con el método de referencia (ZN, cultivo y biopsia), ya que los valores predictivos no son suficientemente buenos (VPP: 75.0% y VPN: 90.6%) para usar la RT-PCR como un método diagnóstico definitivo; y, de hecho, se presentaron dos falsos positivos en donde el diagnóstico fue mesotelioma y pleuritis crónica con hiperplasia mesotelial, respectivamente.

Para el presente estudio se utilizó un método de referencia combinado lo que permitió tener un diagnóstico definitivo y objetivo de TBP, y de esta manera hacer una evaluación más precisa de las características operativas de la prueba en estudio, convirtiéndose en una fortaleza para la presente investigación. Sin embargo, debemos señalar que como debilidad del estudio está el tamaño muestral, que resultó bajo para los hallazgos finalmente encontrados, lo cual aumentó los intervalos de confianza y disminuyó la precisión del estudio. Esto nos obliga a sugerir la realización de estudios de validación de la RT-PCR con mayores tamaños muestrales, para aumentar la precisión de los resultados.

Conclusiones

La RT-PCR para M. tuberculosis en líquido pleural tiene una buena especificidad para el diagnóstico de TBP, pero debido a que sus valores predictivos no son suficientemente altos, no debe utilizarse para el diagnóstico definitivo de la enfermedad. Su mayor utilidad sería como método para definir rápidamente la conducta a seguir con un paciente, mientras llegan los reportes de las pruebas diagnósticas definitivas. Los cultivos para M. tuberculosis y los ZN de líquido y tejido pleural tienen menor rendimiento diagnóstico que la RT-PCR y es necesario seguir usando el método de referencia combinado para establecer el diagnóstico definitivo de la pleuritis linfocitaria.

Es necesario realizar nuevos estudios con un mayor tamaño muestral con el fin de aumentar la precisión de los resultados previamente establecidos.